RNA干扰REG1A基因抑制人膀胱癌T24细胞增殖

目的:观察小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默REG1A (regenerating islet-derived 1 alpha)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及细胞周期的影响.方法:化学合成针对REG1A基因的3对siRNA,使用脂质体将其转染至T24细胞中.应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测REG1A siRNA转染后T24细胞REG1A mRNA和蛋白的表达,CCK-8(cell counting kit-8)法检测转染后的细胞增殖情况,FCM检测转染后细胞周期的变化.结果:与空白对照组比较,REG1A siRNA转染T24细胞后,REG1A mRNA和蛋白表达分别下降了(83.10±0.06)％和(55.81±0.16)％,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞增殖受到抑制(P＜0.05),G0/G1期细胞百分比明显增加(P＜0.05),细胞增殖指数下降(P＜0.05).结论:REG1A siRNA能有效抑制膀胱癌T24细胞REG1A mRNA和蛋白的表达,并抑制细胞增殖.     

小干扰RNA沉默survivin基因对结肠癌Caco-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察survivin在人结肠癌细胞Caco-2中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默survivin基因对survivin蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响.方法:以脂质体LipofectAMINE 2000为载体,将针对特异靶点survivin基因的siRNA转染入人结肠癌细胞Caco-2.应用免疫细胞化学SP法和Western印迹法检测survivin蛋白表达的变化,MTT法检测细胞增殖,FCM法检测细胞凋亡.结果:免疫细胞化学检测结果显示,survivin蛋白在Caco-2细胞空白对照组、脂质体对照组及阴性错配对照组的细胞质中均呈强阳性表达,而在survivin-siRNA转染组细胞质中呈弱阳性表达;Western印迹法检测结果显示,survivin-siRNA转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于空白对照组、脂质体对照组和阴性错配对照组;MTT检测结果显示,与阴性错配对照组相比, survivin-siRNA转染组细胞生长出现明显的抑制(P＜0.05),且不同时段(24、48和72 h)的肿瘤细胞增殖抑制率之间差异有统计学意义(P＜0.05);FCM检测结果显示,survivin-siRNA转染组细胞出现明显的亚二倍体峰,细胞凋亡率(9.72%)明显高于空白对照组(P＜0.01).结论:siRNA沉默survivin基因可抑制结肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡.推测survivin基因可能成为结肠癌基因治疗的一个新靶点.     

小RNA干扰沉默CD147基因对膀胱癌T-24细胞生物学行为的影响

目的:探讨重组腺病毒介导的小RNA干扰(small interfering RNA,siRNA)沉默CD147基因表达对人膀胱癌T-24细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法:构建针对CD147基因的siRNA重组腺病毒表达载体Ad-CD147 siRNA,感染人膀胱癌T-24细胞.实验设空白对照组(Mock)、阴性对照组(Ad-siControl)和干扰组(Ad-CD147 siRNA).采用RT-PCR检测CD147和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) mRNA的表达水平;蛋白质印迹法检测CD147蛋白的表达水平;MTT法检测细胞增殖的情况,Transwell小室法和划痕实验检测对细胞侵袭和迁移能力的影响;明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9的分泌情况;ELISA法检测VEGF蛋白分泌水平.结果:成功构建了Ad-CD147 siRNA腺病毒表达载体,Ad-CD147 siRNA可使T-24细胞CD147 mRNA和蛋白表达量下调＞90％(P＜0.01),细胞增殖速率下降＞40％(P＜0.01),细胞侵袭力和迁移力明显下降(P＜0.01),MMP-2和MMP-9的分泌量分别下降了68.5％和37.1％(P＜ 0.01),VEGF mRNA和蛋白表达水平分别下降了57.2％(P＜ 0.01)和56.5％(P＜0.01).结论:Ad-CD147 siRNA能有效抑制T-24细胞中CD147基因的表达,继而降低细胞增殖、迁移及侵袭能力.因此,CD147有可能成为膀胱癌基因治疗的一个新靶点.     

siRNA沉默DNA聚合酶β基因对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的:观察siRNA沉默DNA聚合酶β(DNA polymerase β,pol β)基因后对胃癌BGC-823细胞增殖的影响.方法:用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测先前构建好的转染不同siRNA载体的各组细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平,用FCM法和裸鼠体内成瘤实验检测各组细胞的增殖情况.结果:转染pol β靶向siRNA的BGC-823细胞中pol β mRNA和蛋白质表达水平均明显降低,且siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ2(抑制程度83%)的沉默抑制作用强于siRNA载体pRNAT-U6.1-sipolβ1(抑制程度56%);与无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组相比,转染pRNAT-U6.1-sipolβ1组细胞的S期比例及细胞增殖速度明显下降,而转染pRNAT-U6.1-sipolβ2组细胞的S期比例以及细胞增殖则明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:DNA pol β高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;BGC-823细胞中pol β表达通过siRNA沉默到合适的低水平,对肿瘤的生长可以起到抑制作用.     

shRNA沉默RAGE基因表达对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

目的:构建针对人晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products , RAGE)基因的特异性短发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)表达载体,探讨其对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用.方法:设计并合成4种针对RAGE基因的特异性短链寡核苷酸,构建含shRNA RAGE的表达载体,转染高表达RAGE的亚克隆细胞株sub DU145-2C1.荧光显微镜下观察细胞转染后的情况,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)检测转染shRNA后对RAGE mRNA表达的影响,Western印迹法检测对RAGE蛋白表达的影响,CCK-8法检测对细胞增殖的影响,划痕实验观察对细胞迁移能力的影响.结果:构建获得的shRNA RAGE表达载体能够有效抑制RAGE基因的表达(P<0.05),其中以shRNA RAGE -1(R1)的抑制作用最强,其对RAGE mRNA表达的抑制率为84%,对蛋白表达的抑制率为27%.细胞增殖结果显示,转染shRNA RAGE后细胞增殖能力明显降低;而细胞迁移能力则无明显变化.结论:shRNA RAGE能有效下调RAGE基因的表达水平,抑制细胞增殖.     

应用RNA干扰技术抑制人膀胱癌细胞EGFR基因表达的研究

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人膀胱癌细胞(BIU-87)EGFR基因的表达,探索采用该技术干预膀胱癌的可行性.方法:制备3个针对人EGFR基因的shRNA表达质粒,转染BIU-87细胞48 h后,RT-PCR及蛋白质印迹法检测EGFR基因的表达.结果:酶切及测序鉴定证实,3个shRNA表达质粒构建成功,将其...     

沉默PLCε基因对人膀胱癌裸鼠移植瘤中Bcl-2及Bax蛋白表达水平的影响

目的:探讨应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默磷脂酶Cε (phospholipase C epsilon,PLCε)基因对人膀胱癌移植瘤生长及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响.方法:人膀胱癌BIU-87细胞种植于裸鼠皮下,待移植瘤体积达40 mm3左右时,在肿瘤部位分别直接注射建构有PLCε特异性shRNA的重组表达质粒pGenesil-PLCε、阴性对照重组pGenesil-NP质粒以及0.9%氯化钠溶液;观察肿瘤体积的变化情况,30 d后处死全部裸鼠,取瘤组织,称瘤质量;瘤组织制备病理切片,HE染色观察细胞形态的变化;RT-PCR鉴定瘤组织中PLCε mRNA的表达;Western 印迹法检测瘤组织中PLCε、Bcl-2、Bax、p-Akt1/ Akt1和p-Bad/Bad蛋白的表达.结果:pGenesil-PLCε组小鼠移植瘤生长明显缓慢,瘤组织体积和质量均明显小于对照组;HE染色结果显示,瘤组织中出现细胞核固缩和裂碎等凋亡征象;RT-PCR检测结果显示, PLCε mRNA表达明显降低(P<0.05);Western 印迹法结果提示,PLCε和Bcl-2蛋白表达量明显降低,Bax蛋白表达增加,与2个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而Akt1、Bad蛋白的表达在实验组以及对照组中差异均无统计学意义,p-Akt1和p-Bad在移植瘤中未见表达.结论:沉默PLCε基因可明显抑制PLCε的表达,并下调Bcl-2蛋白以及上调Bax蛋白的表达,促进膀胱癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长.     

靶向LASS2基因的小干扰RNA对人肝癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向人源性长寿保障基因2(homosapiens longevity assurance homologue 2,LASS 2)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人肝癌细胞MHCC97-L体外侵袭能力的影响.方法:通过脂质体转染将靶向LASS2的siRNA转染MHCC97-L细胞,运用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)检测转染后LASS2 mRNA的表达,筛选有效的siRNA片段;运用 BCECF氢离子敏感荧光探针检测MHCC97-L细胞跨膜运输氢离子的功能;采用Western印迹法分析MHCC97-L细胞及上清液中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)的表达情况;应用明胶酶谱法检测MHCC97-L细胞上清液中MMP-2的活性; Transwell法检测细胞体外侵袭能力.结果:筛选得到靶向LASS2的有效siRNA-1片段.MHCC97-L细胞转染LASS2 siRNA-1后,其跨膜运输氢离子的能力增强,与空白对照组比差异有统计学意义(P<0.05);MMP-2蛋白的表达及分泌无明显变化,但分泌的MMP-2活性形式增加,与空白对照组和无关序列组比明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);且细胞的体外侵袭能力明显高于无关序列组和空白对照组(P<0.05).结论:靶向LASS2的siRNA能有效下调其表达,并能提高MHCC97-L细胞在转染LASS2 siRNA后的体外侵袭能力.     

RNA干扰沉默AKT基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡影响研究

目的：通过小分子干扰RNA（siRNA）技术沉默卵巢癌SKOV3细胞中P13K／AKT信号通路关键基因蛋白激酶B（protein kinase B,PKB／AKT）基因的表达,探讨其对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响。方法：人卵巢癌SKOV3细胞体外培养,随机分为对照组、空白载体组和siRNA干扰组,siRNA干扰组通过脂质体介导AKTsiRNA转染SKOV3细胞。荧光定量PCR法检测AKT在干扰前后AKTmRNA的表达,免疫荧光细胞化学法检测P13K、AKT与PCNA蛋白在各组中的表达,MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞仪AnnexinV／pI法检测细胞凋亡率的变化。结果：siRNA干扰组AKTmRNA的表达量为（O．325±0．04）明显抑制,并显著低于对照组,q=58．96,P〈O．001;免疫荧光细胞化学结果示,siRNA干扰组的AKT、PCNA蛋白的荧光强度较对照组与空白载体组明显降低,而P13K蛋白在3组间差异无统计学意义,P=0．637;流式细胞仪AnnexinV／PI法检测结果示,siRNA干扰组细胞凋亡率高达（79．52±2．31）％,较对照组（27．35±2。01）％与空白载体组（28．64±1．96）％明显升高,约是空白载体组（q=60．880,P〈0．001）与对照组（q=58．553,P〈0．001）的3倍,差异有统计学意义。结论：AKTsiRNA可干扰AKT基因的表达,抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进其凋亡,有望成为治疗卵巢癌的新方法。     

shRNA干扰Bmi-1基因表达载体构建及其对膀胱癌5637细胞增殖抑制作用的研究

目的:构建shRNA体内表达载体pGeneClipTM-shRNA,研究抑制Bmi-1基因表达对膀胱癌5637细胞凋亡的影响.方法:构建靶向Bmi-1的shRNA真核表达质粒pGeneClipTM-B1、pGeneClipTM-B2以及pGeneClipTM-B-neg(阴性对照质粒),采用脂质体转染试剂转染膀胱癌5637细胞,采用RT-PCR、蛋白质印迹法技术检测转染前后5637细胞中Bmi-1基因表达的变化;利用MTT法检测表达质粒对5637细胞增殖的影响;并利用流式法和蛋白质印迹法技术检测表达质粒对5637细胞凋亡的作用及影响机制.结果:经酶切、测序鉴定,重组质粒均在1200 bp左右出现酶切条带,符合设计要求.RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,5637细胞经小RNA干扰后Bmi-1的mRNA和蛋白质表达水平明显降低,P＜0.05.与阴性对照组和未转染组相比,转染Bmi-1 shRNA组细胞增殖明显受到抑制,P＜0.05.转染Bmi-1 shRNA组细胞凋亡率分别为19.95%和27.27%,与未转染组7.23%和阴性对照组6.78%相比,转染Bmi-1 shRNA组细胞凋亡率明显增加,P＜0.05.结论:减少膀胱癌5637细胞Bmi-1基因的表达可抑制5637细胞增殖并促进细胞凋亡.     

泛素特异性肽酶22在胃癌细胞系中的表达和定位

目的:研究泛素特异性肽酶22(USP22)蛋白和信使核糖核酸(mRNA)在人胃癌细胞中的表达和定位.方法:分别用蛋白印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测USP22在人胃癌细胞系中蛋白和基因的表达,激光共聚焦扫描显微镜检测内源USP22在SGC7901胃癌细胞中的定位.结果:USP22在人胃癌细胞系SGC7901中蛋白和基因表达水平增高,激光共聚焦扫描显微镜观察发现USP22主要定位于SGC7901细胞核中.结论:USP22在人胃癌细胞系SGC7901中高表达,主要定位于胃癌细胞核内,可能参与人胃癌发生发展的进程.     

siRNA下调星形细胞上调基因1表达对胃癌SGC-7901细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨星形细胞上调基因1(AEG-1)表达水平对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响,研究其可能的分子机制.方法 以siRNA和AEG-1 siRNA转染胃癌SGC-7901细胞后48 h,将细胞分为未转染组、siRNA对照组和AEG-1 siRNA转染组.应用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染后SGC-7901细胞中AEG-1 mRNA和蛋白的表达,应用CCK-8检测细胞增殖能力,应用流式细胞术检测转染前后细胞周期的分布,应用Western blot检测细胞增殖和细胞周期相关蛋白表达的变化.结果 与未转染组和siRNA对照组比较,AEG-1 siRNA转染组胃癌细胞中AEG-1蛋白的表达水平下降(P＜0.05).与未转染组和siRNA对照组比较,AEG-1 siRNA转染组AEG-1 mRNA表达水平下降(P＜0.05).与未转染组和siRNA对照组比较,AEG-1 siRNA转染组转染AEG-1后的24h及其后续的各个时间点,SGC-7901细胞的增殖均明显受到抑制(均P＜0.05).AEG-1 siRNA转染组中G0/G1期细胞数比例[(61.26±1.25)％]显著高于未转染组[(46.17±1.91)％]和siRNA对照组[(46.46±1.96)％],差异均有统计学意义(均P ＜0.05).AEG-1表达水平下降可使cdk2和cyclinD1表达水平下降以及p21表达水平升高.结论 AEG-1表达水平下降抑制胃癌细胞的增殖和改变细胞周期分布,可能与cdk2、cyclin D1和p21蛋白的表达密切相关.     

RNA干扰CXCR7基因对结肠癌SW1116细胞增殖及迁移的影响

目的:探讨趋化因子受体7(chemokine receptor 7,CXCR7)基因沉默对结肠癌细胞株SW1116增殖和迁移能力的影响。方法:采用脂质体转染的方法将CXCR7基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转入人结肠癌SW1116细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测CXCR7mRNA和蛋白在SW1116细胞中的表达水平;采用CCK-8法检测对细胞增殖抑制率的影响;Transwell小室法检测干扰前后对细胞迁移能力的影响。结果:CXCR7-siRNA转染SW1116细胞24h后,CXCR7-siRNA干扰组SW1116细胞中CXCR7mRNA相对表达量为0.275±0.018,与空白对照组的0.635±0.024相比,mRNA表达抑制率为(56.6±3.8);转染48h后,CXCR7-siRNA干扰组的SW1116细胞中CXCR7蛋白的表达水平明显低于Negative-siRNA组和空白对照组(P<0.05);CXCR7-siRNA组的SW1116细胞增殖力在转染48、72、96和120h后明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P<0.05);CXCR7-siRNA干扰组SW1116细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为(22.73±2.01)个,明显少于阴性转染对照组的(49.20±3.82)个和空白对照组的(54.80±4.85)个(P<0.05)。结论:siRNA干扰下调CXCR7基因表达能抑制结肠癌细胞SW1116的增殖和迁移能力。     

小干扰RNA技术在胃肠肿瘤中的应用

小干扰RNA（siRNA）技术是具有高效性、高特异性和高成功率的基因敲除技术。近年来由于胃肠肿瘤发病率的提高,该项技术已广泛应用于胃肠肿瘤的基因研究、早期诊断、发生发展以及浸润转移和化疗药物耐药性逆转等领域。     

RNA干扰卷曲螺旋结构域蛋白34表达对膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨卷曲螺旋结构域蛋白34（CCDC34）的表达对膀胱癌细胞生物学行为包括增殖、凋亡、克隆形成和侵袭能力的影响。方法 选取膀胱癌5637细胞分别转染阴性对照siRNA（阴性对照组）和CCDC34 siRNA（CCDC34干扰组）慢病毒载体,荧光显微镜观察慢病毒感染效率;实时荧光定量PCR和Western blotting验证CCDC34的干扰效率;BrdU掺入实验、流式细胞术、克隆形成实验和Transwell小室侵袭实验检测干扰CCDC34表达对5637细胞增殖、凋亡、克隆形成及侵袭能力的影响。结果 阴性对照组与CCDC34干扰组的慢病毒感染效率均在85％以上。与阴性对照组相比,感染CCDC34 siRNA的细胞中CCDC34 mRNA表达水平受到显著抑制（1.00±0.06 vs. 0.16±0.01,P＜0.01）,且CCDC34蛋白表达下降。BrdU实验显示,CCDC34干扰组的细胞增殖能力较阴性对照组受到显著抑制（P＜0.05）,且细胞凋亡显著增加［（28.09±0.39）％ vs.（9.50±0.01）％,P＜0.01）］。克隆形成实验显示,CCDC34干扰组的克隆形成能力显著低于阴性对照组（22±4 vs.310±5,P＜0.01）。Transwell小室侵袭实验显示,CCDC34干扰组膀胱癌细胞的侵袭转移率显著低于阴性对照组（0.53±0.03 vs.2.58±0.10,P＜0.01）。结论 慢病毒介导的RNA干扰技术可下调CCDC34蛋白在膀胱癌5637细胞中的表达,并显著抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力;CCDC34有望成为膀胱癌的生物标记物和治疗的新靶点。     

沉默ELAVL1基因表达体外和体内抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖

目的:观察沉默胚胎致死性异常视觉1(embryonic lethal abnormal visionlike 1,ELAVL1)基因表达对前列腺癌PC-3细胞生长的影响,并探讨可能的分子作用机制.方法:分别采用实时荧光定量PCR法、蛋白质印迹法、免疫组织化学法及免疫荧光法检测前列腺癌PC-3和正常前列腺上皮RWPE-1...     

敲减USP39基因抑制人膀胱癌细胞增殖、促进细胞凋亡

目的:探讨慢病毒介导的RNA干扰敲减泛素特异性肽酶39(ubiquitin specific peptidase 39,USP39)对人膀胱癌细胞生长和细胞凋亡的影响,为膀胱癌的治疗提供新思路.方法:RT-qPCR确定5637和T24细胞系中USP39 mRNA的表达;设计合成针对USP39的特异性shRNA,利用脂质...