散发性耳聋患者GJB2基因与mtDNA、A1555G基因的研究

目的分析散发性耳聋患者GJB2基因突变率和线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA、A1555G基因突变率。方法 2009年12月-2012年3月收治散发性耳聋患者135例与健康对照人群162名外周血样本,PCR扩增GJB2和mtDNA12SrRNA基因,通过限制性内切酶酶切鉴定突变热点,对PCR产物直接测序进行突变确定。结果对GJB2检测结果显示,散发性耳聋患者样本中发现9种碱基改变(V27I、E114G、I203T V37I、176-191del16、235delC、299-300delAT、T123N和504insGCAA),其中235delC为主要突变方式,携带率为27.41%,其中纯合突变18例,杂合突变19例;162例正常对照中发现了15种碱基改变,其中4种为常见多态。所有297例样本中未发现有mtDNA 12SrRNA A1555G位点突变存在。结论 GJB2基因突变是引起散发性非综合征耳聋患者听力损失发生的重要原因,不同人种GJB2基因的突变热点存在差异,235delC是GJB2基因在中国人中的主要致病突变位点;GJB2基因在人群中存在较多类型的突变和较多形式的多态性;在散发性耳聋中mtDNA、12SrRNA A1555G位点的突变率明显低于全国平均水平。     

浙江汉族人群线粒体DNA ND1基因G3316A突变与2型糖尿病

目的：研究与日本人2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）相关的线粒体DNA（mitochondria DNA,mtDNA）ND1基因G3316A突变在浙江汉族T2DM人群中的发生率及其临床意义。方法：采用PCR产物直接测序法对浙江籍汉族人群中无血缘关系的315名T2DM患者及158名正常对照的外周血mtDNA进行检测,并用DNASTAR和Antheprot 5.0软件分析突变位点。结果：在T2DM患者中检测到6例（占1.90%）G3316A突变,对照组中发现3例（占1.90%）突变,突变发生率在两组间差异无显著性（P＆gt;0.05）。携带G3316A位点突变的T2DM组与无该突变的T2DM组之间的临床特点（发病年龄、体重指数和血糖水平等）比较差异亦无显著性。蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲的构成比没有发生改变。结论：线粒体DNA ND1基因G3316A突变可能与浙江汉族人群T2DM的发生无关,仅为人群中的基因多态性。     

97例线粒体肌病/脑肌病患者的线粒体DNA突变分析

目的 探讨我国不同临床类型的线粒体脑肌病的线粒体DNA(mtDNA)突变特点以及基因型和表型之间的相关性.方法 对经临床和病理诊断为线粒体肌病/线粒体脑肌病的97例患者,提取其肌肉和/(或)白细胞mtDNA,用Southern杂交检测mtDNA的大片段缺失、以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测常见类型的点突变(包括A3243G、A8344G、T8993G、　T8993C、T3271C突变)、并对部分患者进行mtDNA伞长测序寻找有无其他的突变位点.结果 97例患者中有81例患者存在mtDNA突变,突变类型包括单一的大片段缺失21例,多发的大片段缺失4例,A3243G突变43例,A8344G突变6例,T8993G、T8993C、T3271C突变各1例.KSS/CPEO与单发的mtDNA大片段缺失相关、MELAS与A3243G点突变、MERRF与A8344G点突变、母系遗传的Leigh　病与8993位点的突变相关.另外在4例线粒体肌病患者中发现细胞色素b编码基因A15316G　(T194A)、G15221A(D159N),ATPase6编码基因G9196A(D224N)和16SrRNA C2835T突变各1例.结论 国人不同类型线粒体肭肌病的mtDNA突变类型与国外外的报道道基本一致.虽然线粒体脑肌病的临床表刑和基因型之间有一定的相关件,但不同的基因型和临床表型之间也存在一定的交叉,反映了线粒体病的异质性特点.     

非综合征型耳聋GJB2基因和mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变分析

目的:分析南京聋校散发性耳聋患者GJB2基因突变率和线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA A1555G基因突变率.方法:收集聋校学生135名和健康对照人群162名外周血样本,PCR扩增GJB2和mtDNA 12SrRNA基因,通过限制性内切酶酶切鉴定突变热点,对PCR产物直接测序进行突变确定.结果:对GJB2检测结果显示:散发性耳聋患者样本中发现9种碱基改变(V27I、E114G、I203T V37I、176-191del16、235delC、299-300delAT、T123N和504insGCAA),其中235delC为主要突变方式,携带率为27.41%,其中纯合突变18例,杂合突变19例;162例正常对照中发现了15种碱基改变,其中4种为常见多态.散发聋135例和正常对照162例共计297例样本中未发现有mtDNA 12SrRNA A1555G位点突变存在;结论:GJB2基因突变是引起散发性非综合征耳聋患者听力损失发生的重要原因,不同人种GJB2基因的突变热点存在差异,235delC是GJB2基因在中国人中的主要致病突变位点;GJB2基因在人群中存在较多类型的突变和较多形式的多态性;在散发性耳聋中mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变率明显低于全国平均水平.     

线粒体DNA 3243、3316、3394位点突变与精神分裂症相关分析

目的分析线粒体tRNALeu(UUR)基因3243位点及ND1基因3316、3394位点突变对精神分裂症(SZ)发病的影响。方法采用PCR扩增、限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分型检测、DNA测序等方法,对随机抽取的无亲缘关系的250例患者(SZ组)和292例对照组的外周血mtDNA进行3243、3316和3394位点的突变检测。结果在SZ组中发现8例3316G/A突变,对照组中3例,两组相比差异无统计学意义(P=0.138)。在SZ组中发现15例3394T/C突变,对照组中有4例,两组相比差异有统计学意义(P=0.007)。在精神分裂症患者组和对照组中均未发现3243A/G突变。结论 mtDNA3394T/C突变可能与SZ发生有一定关系,mtDNA 3243A/G、3316G/A突变可能与SZ发生无关。     

云南省部分聋生线粒体DNA 12S rRNA A1555G和C1494T的突变

目的探讨云南省部分特教学校聋生携带氨基糖甙类抗生素致聋相关基因线粒体DNA(mitochondri-al DNA,mtDNA)12S rRNA A1555G和C1494T的突变率.方法采集413名耳聋学生及232名健康人群的外周静脉血,提取基因组DNA,PCR扩增含mtDNA 12S rRNA A1555G和C1494T的基因片段,扩增产物经直接测序进行基因突变位点的鉴定.结果在413名耳聋学生中有10例携带mtDNA 12S rRNA A1555G均质突变,携带率为2.42%.对照组中未检测到该位点的突变.2组人群中均未检测到mtDNA 12S rRNA C1494T突变.结论云南省部分特教学校聋生携带mtDNA 12S rRNA A1555G的突变率与全国平均水平一致,本研究为明确该地区耳聋的病因、防治及干预提供科学依据.     

中国福建线粒体耳聋患者线粒体DNA A1555G突变检测及其与耳聋严重程度的关系

背景 已知突变型与野生型线粒体DNA的比例与耳聋的临床表型有关。本研究建立高灵敏度的RT-ARMS-qPCR（real time-amplification refractory mutation system-quantitative PCR）系统定量测定含A1555G位点突变的线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）,探讨突变型mtDNA的比例变化与中国福建线粒体耳聋（mitochondrial deafness, MD）患者耳聋严重程度的关系。 方法 以PCR扩增含mtDNA 1555位点的片段,并将其克隆到pGEMT Easy载体上,构建质粒标准品,建立RT-ARMS-qPCR系统定量检测126个中国福建MD患者含突变型和野生型mtDNA 1555位点的片段的拷贝数。结合患者的临床资料,分析耳聋严重程度与突变型mtDNA所占比例的关系。 结果　RT-ARMS-qPCR系统在检测1个含野生型mtDNA 1555的重组质粒DNA模板时,其批内变异系数（CV）为1.21%,批间CV为1.78%,线性范围为102～108拷贝数/μl;突变型或野生型引物只特异扩增相对应的序列,特异性好;散发组mtDNA A1555G同质性突变的患者中,突变拷贝数与耳聋轻重程度无关（R=0.007,P=0.989）;散发组mtDNA A1555G异质性突变的患者中,突变型与野生型的比例与耳聋轻重程度相关（R=0.811,P=0.003）;家系组mtDNA A1555G同质性突变的拷贝数与耳聋轻重程度相关（R=0.352,P=0.023）;家系组mtDNA A1555G异质性突变的拷贝数与耳聋轻重程度相关（R=0.90,P=0.012）。 结论　RT-ARMS-qPCR系统适合于定量检测mtDNA A1555G点突变的线粒体DNA片段,结果特异、稳定、准确。线粒体耳聋的严重程度与突变型mtDNA 1555所占比例有关。     

线粒体脑肌病的线粒体3271T＞C、8356T＞C、9176T＞C/G和13513G＞A位点突变筛查

目的 了解中国线粒体脑肌病患儿的线粒体DNA(mtDNA)3271T＞C、8356T＞C、9176T＞C/G和13513G＞A位点的突变情况.方法 选择2005年10月至2009年10月500例线粒体脑肌病患儿,提取外周血DNA,用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)方法进行mtDNA 3271T＞C、8356T＞C、9176T＞C/G和13513G＞A位点的突变筛查分析;用DNA直接测序方法验证PCR-RFLP的结果.结果 在500例线粒体脑肌病患儿中未发现3271T＞C、8356T＞C、9176T＞C/G和13513G＞A位点的突变.结论 在中国线粒体脑肌病患儿中线粒体3271T＞C、8356T＞C、9176T＞C/G和13513G＞A位点不是常见突变.

Abstract：

Objective To investigate the spectrum of mitochondrial DNA (deoxyribonucleic acid)3271T＞C, 8356T ＞ C, 9176T ＞ C/G and 13513G ＞ A mutations in Chinese patients with mitochondrial encephalomyopathies. Methods Peripheral blood samples were collected from 500 mitochondrial encephalomyopathic patients clinically diagnosed as mitochondrial encephalomyopathy lactic acidosis & stroke-like episodes (MELAS), myoclonus epilepsy & ragged-red fibers (MERRF) or Leigh's syndrome from October 2005 to October 2009. The methods of PCR- polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism ( RFLP ) and PCR-sequencing were performed to identify the mutations. Results No patients with the 3271T ＞ C, 8356T ＞ C, 9176T ＞ C/G or 13513G ＞ A mutations were identified.Conclusion The mutations of 3271T ＞ C, 8356T ＞ C, 9176T ＞ C/G and 13513G ＞ A are rare causes of mitochondrial encephalomyopathies in Chinese patients.     

G6PD缺陷症基因型分析：一种新的错义突变

目的对葡萄糖-6磷-酸脱氢酶（G6PD）缺陷症患者进行G6PD基因型分析,分析基因突变类型。方法选取经G6PD活性测定确诊为G6PD缺陷症的49例患者和100名G6PD活性正常的体检者的全血标本,PCR和DNA测序法对G6PD基因外显子2~13进行序列分析。结果 49例G6PD缺陷症患者中,共发现12种错义突变,其中常见的三种为G6PD G1388A（26.5%）、G1376T（28.6%）和A95G（14.3%）,此三类基因型患者G6PD活性仅为正常人群的5%~18%。临床主要表现为新生儿黄疸、进食蚕豆后发生急性溶血性贫血等。其余突变类型包括C1024T（4.1%）、C1225T（2.0%）、C1159T（2.0%）、G487A（4.1%）、G392T（4.1%）、G1160A（6.1%）、G871A/C1311T（4.1%）和C406T/C1311T（2.0%）;在外显子7上发现了一种新的错义突变即G691C,该突变造成G6PD第231位丙氨酸（A la）被脯氨酸（Pro）替代。正常对照标本未发现相同的基因改变。结论 G6PD基因G1388A、G1376T和A95G是G6PD缺陷症患者最常见的三种突变类型。新发现的G691C突变导致A la231Pro,是引起红细胞G6PD活性降低,患者临床出现溶血症状的主要原因。     

基因芯片筛查糖尿病线粒体基因突变

目的建立一种快速、准确的高通量检测线粒体DNA突变的基因芯片技术,并探讨这些突变与糖尿病的关系。方法以尼龙膜为介质,通过紫外交联固定28个待测突变位点的野生型和突变型探针,并采用该基因芯片对200例2型糖尿病患者和210名健康对照的线粒体tRNA leu（UUR）基因及ND1基因进行筛查,DNA测序进一步确证突变位点,Mfold和Antheprot软件预测变异型基因及蛋白质二级结构。结果成功研制可检测28个突变位点的线粒体DNA芯片,在糖尿病组检出tRNA leu（UUR）基因13290C突变2例（1．0％）,ND1基因突变23例：G3316A突变6例（3．0％）、13394C突变5例（2．5％）、A4164G突变8例（4．0％）,T4216C突变2例（1．0％）,T3593C（0．5％）和A3606G突变各1例（0．5％）;对照组检出G3316A突变1例（0．5％）、A4164G突变5例（2．4％）。这些突变位点的测序结果与基因芯片检测结果一致。两组间仅13394C突变率差异有统计学意义（P=0．027）。G3316A突变导致丙氨酸→苏氨酸,13394C突变导致酪氨酸→组氨酸,13593C突变导致缬氨酸→丙氨酸,T4216C突变导致酪氨酸→组氨酸,A3606G和A4164G突变分别为亮氨酸和蛋氨酸的无意义突变,前4种突变型的ND1蛋白二级结构不同于野生型。结论线粒体DNA芯片是一种快速可靠的高通量基因突变检测方法,ND1基因13394C突变可能参与了线粒体基因缺陷型糖尿病的发病。     

Detection of A3243G point mutation in mitochondrial DNA from 10 cases of MELAS

目的：对10例MELAS型线粒体脑肌病患者进行线粒体DNA A3243G点突变的检测。方法：用PCR-限制性内切酶分析法（restriction analysis）,检测10例MELAS患者及其8名母系亲属的肌肉和/或外周血细胞中有无mtDNA的A3243G点突变,并进行突变型mtDNA的定量。结果：在10例患者的肌肉和/血细胞中,均检测到A3243点突变。突变型mtDNA的比例在血细胞（7例）中为10.8％-47.8％,在肌肉（5例）中为39.4％-67.7％。有2例患者同时进行了肌肉和血细胞标本的检测,突变型mtDNA的比例肌肉组织均高于血细胞。在血细胞中,年轻患者的突变型比例通常较高。在1个家系中可证实为母系遗传 。但在3例先证者的母亲及2例先证者抽胞均未检测到此突变。结论：10例MELAS综合征患者均携有mtDNA A3243G点突变。在6个家庭中,只有1个家庭可证实为母系遗传,另外5个家庭中此突变可能为散发性,提示在中国人MELAS的发病机制中,mtDNAA3243G点突变为新生突变的居多。     

线粒体DNA13731点突变与脊髓小脑性共济失调相关性研究

目的探索线粒体DNA（mtDNA）突变位点与脊髓小脑性共济失调（SCA）的关系。方法采用聚合酶链反应（PER）对基因确诊的四个SCA家系10例患者及其亲属共34例与40例健康对照的线粒体ND5基因片段进行扩增,扩增产物进行单链构象多态性分析（SSCP）,对SSCP出现异常的样本进行相应mtDNA片段测序。结果在一家系的1名确诊患者及1名症状前患者检测到mtDNA13731（T〉C）点突变。结论脊髓小脑性共济失调的发生、发展可能与mtDNA突变有关。     

线粒体DNA3160-3755区域基因突变与2型糖尿病的关系

目的研究线粒体DNA3160-3755区域基因在延边地区2型糖尿病（T2DM）患者中的突变情况,探讨该区域线粒体基因突变与2型糖尿病的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymorphismchainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）技术和直接测序法对延边地区人群108例正常健康体检者、328例T2DM患者（其中2例合并耳聋）,进行线粒体DNA3160-3755区域基因突变筛查。结果线粒体DNA3316G-A在糖尿病组和正常对照组中的突变率分别为3．7％和3．8％。两组间差异无统计学意义（P〉0．05）;3394T→C在糖尿病组和正常对照组中的突变率分别为7．3％和1．9％,两组间差异有统计学意义（P〈0．05）;在糖尿病组及正常对照组中均未检测到线粒体DNA3243A→G、3593T→C和3714A→G突变。结论线粒体DNA3316G→A突变与延边地区T2DM的发生无关;线粒体DNA3,394T→C突变与延边地区T2DM的发生有关;线粒体DNA3423A→G,3593T→C,3714A→G突变在延边地区T2DM中的发生率为0,提示上述位点基因突变率极低。     

弱精子症精子线粒体DNAA3243G，G3316A和T3394C突变的检测

目的：检测弱精子症精子线拉体tRNA^1eu3243位点、线粒体NDI3316位点和3394位点碱基突变频率,分析三个位点突变与弱精子症的相关性。方法：按WHO标准随机收集了69例弱精子症患者精子标本和60例正常人正常活动力精子标本,以聚合酶链反应、ApaⅠ和HaeⅢ限制性内切酶长度多态性分析和测序检测mtDNAA3243G、G3 316A和T3 394C三个位点的突变,比较两组突变频率的差异。分析G3316A和T3394C突变的氨基酸变异情况并结合生物信息学工具分析错义突变氨基酸进化保守性。结果：弱精子症精子mtDNAG3316A突变率（4．35％）、T3394C突变率（2．90％）和总突变率（7．25％）与正常对照纽（分别为5．00％、1．67名和6．67％）比较,差异无显著性。氨基酸变异分析发现,G3316A（Ala-〉Thr）、T3394C（Tyr-〉His）均为错义突变,其中T3394C突变位点所编码的氨基酸在人、牛、小鼠、爪蟾4种生物中进化具有高度保守性。结论：G3316A和T3394C突变可能不是影响人类精子活动力的主要因素。     

锰中毒性帕金森综合征与线粒体基因部分点突变的关系

目的：研究线粒体基因的点突变和锰中毒性帕金森综合征之间的关系，并了解其是否与锰中毒性帕金森综合征发病有关。方法：采用聚合酶链反应（PCR）、单链构象多态性分析（SSCP），测序方法对临床诊断为锰中毒性帕金森综合征的28例患者和37例在相同环境下接触锰未发病的对照组的线粒体基因的点突变1709、3397、G3196A、T4216C、A4336G、G5460A、G9055A、A10398G，、G13708A所在的片段进行分析。结果：在28例锰中毒性帕金森综合征患者中发现4例患者存在CA253G点突变，2例存在A10398G、CIlM00T点突变，在37例锰接触对照组中发现15例存在A10398G、C10400T点突变，两组之间的C4253G、A10398G、C10400T的突变率有统计学意义。所有研究对象均未检测到1709、3397、G3196A、T4216C、A4336G、G5460A、G9055A、G13708A突变。结论：线粒体基因CA253G点突变可能是锰中毒性帕金森综合征的一个致病突变；线粒体基因A10398G、C10400T可能是锰中毒性帕金森综合征的一个保护性突变，也可能是一个保护性联合突变。而线粒体基因的点突变1709、3397、G3196A、T4216C、A4336G、G5460A、G9055A、G13708A可能与锰中毒性帕金森综合征无相关。     

线粒体DNA A3243G点突变的临床异质性表现

目的探讨线粒体DNA A3243G点突变的临床表现特点.方法以25例临床怀疑为线粒体病,经血或肌肉线粒体DNA检查证实有A3243G点突变的线粒体脑肌病患者为研究对象,分析其临床表现、脑影像学特点、血乳酸水平和肌肉病理检查结果.结果基因检测证实25例患者均存在比例不同的线粒体DNA A3243G点突变,但临床表型有很大不同,其中19例为线粒体脑肌病伴乳酸血症和卒中样发作(MELAS),2例为无法分类的线粒体脑病,2例为松软儿,1例为Kearns-Sayer综合征(KSS),1例为线粒体胃肠肌病.大部分患者脑影像学检查可见病灶,肌肉活检可见蓬毛样红纤维改变,所有患者均有血乳酸水平增高.结论线粒体DNA A3243G点突变的临床表现和脑影像学均呈高度的异质性.对表现为多系统受累的患者,如果同时合并高乳酸血症,就应考虑线粒体病的可能,应进行线粒体DNA突变的检查以明确诊断.