子宫内膜癌患者miR-30b和miR-96水平及与预后的关系

目的 检测子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)miR-30b、miR-96水平,探究其与临床病理及预后的关系.方法 选择2012年10月-2014年8月温州市中西医结合医院收治的EC患者及门诊健康体检...     

miR-449a/b在Ⅱ型子宫内膜癌中表达下调

目的分析Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌及良性子宫内膜组织间MicroRNA(miRNA)表达谱差异。方法收集子宫内膜癌手术患者内膜及良性患者内膜组织,利用免疫组化法分组,分别提取总RNA,基因芯片检测差异表达的miRNA,并经反转录PCR和荧光定量PCR验证差异表达的miRNA。结果芯片检测发现Ⅱ型子宫内膜癌与Ⅰ型子宫内膜癌及良性内膜组织间存在显著下调的miRNA分别有12个和9个,均下调的有miR-449a/b和miR-20b,显著上调的miRNA分别有18个和4个,均上调的有miR-29a。经反转录PCR和荧光定量PCR验证后发现miR-449a在Ⅱ型子宫内膜癌比Ⅰ型子宫内膜癌及良性内膜组织分别下调347倍和288倍,miR-449b分别下调461倍和424倍。结论Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌间miRNA的表达差异可能与不同类型子宫内膜癌的发生发展相关,而miR-449a/b可能与Ⅱ型子宫内膜癌的发病机制有关,可为进一步研究子宫内膜癌发生的分子机制提供依据。     

微小RNA-148b在乳腺癌中的表达及意义

目的探讨微小RNA(miRNA)-148b在乳腺癌中的表达及意义。方法选取2008年3月—2010年3月我院肿瘤外科乳腺癌患者手术切除标本80例(乳腺肿瘤组织)、乳腺癌旁组织标本80例及正常乳腺组织标本20例。采用real-time PCR技术检测miRNA-148b水平;乳腺肿瘤细胞培养,分为空白对照组不加任何药物,阴性对照组加入安慰剂处理细胞,抑制剂组加入5-氟尿嘧啶10μg/ml预先处理细胞48 h,进行MDA-MB-231细胞培养与转染。结果正常乳腺组织、乳腺癌旁组织、乳腺肿瘤组织中miRNA-148b表达量比较,差异有统计学意义(P<0.001);其中乳腺肿瘤组织中miRNA-148b表达量较正常乳腺组织和乳腺癌旁组织均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。转染24 h后,空白对照组、阴性对照组、抑制剂组中miRNA-148b表达量比较,差异有统计学意义(P<0.001);其中抑制剂组中miRNA-148b表达量较空白对照组和阴性对照组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。3组转染24 h后MDA-MB-231细胞增殖比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组转染48、72 h后MDA-MB-231细胞增殖比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其中转染48、72 h后抑制剂组较空白对照组和阴性对照组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 miRNA-148b在人乳腺癌组织及MDA-MB-231细胞株中的表达较正常及癌旁组织低,并且在高表达水平的同时也伴有细胞增殖升高的特点。通过转染miRNA-148b抑制剂后,miRNA-148b表达水平明显上调,细胞增殖现象下降。miRNA-148b可能在乳腺癌的发生及发展阶段都发挥着重要的作用。     

微小RNA-200a在肝癌中的表达及其功能

目的观察miR-200a在肝癌细胞HepG2和正常肝细胞QSG-7701中的表达,以及对肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响。方法运用荧光定量PCR检测肝癌细胞HepG2和正常肝细胞QSG-7701中的miR-200a的表达量。运用MTT法、流式细胞仪和Transwell试验分析miR-200a对细胞增殖、周期、凋亡和侵袭能力的影响。结果肝癌细胞HepG2中miR-200a表达水平为正常肝细胞4.79倍,癌细胞中miR-200a表达明显高于正常细胞(P<0.01)。在72 h浓度为150 nmol/L时,miR-200a对肝癌细胞增殖的促进作用最明显,促进率为38.40%。与空对照组和负对照组比较,G0/G1期细胞未见明显增多(57.13±0.02)%,S期无明显减少(26.55±0.8)%,早期凋亡细胞比例未见明显升高(0.5±0.06)%(P>0.05)。Transw ell实验结果显示100 nmol/L miR-200a mimics实验组相对穿出小室膜肿瘤细胞数为(0.348+0.005 657),与空对照组(0.296±0.006 364),负对照组(0.287±0.005 364)差异明显(P<0.05)。结论 miR-200a在肝癌细胞株中异常表达,癌细胞中的表达明显高于正常细胞,miR-200a对肝癌细胞株的增殖和侵袭能力有着明显的促进作用,其在肿瘤发生发展中可能担任着原癌基因的角色。     

微小RNA-133b对心肌纤维化的影响

目的 研究微小RNA-133b(miR-133b)对心肌纤维化的影响。方法 选取人心肌成纤维细胞(CFs),采用CCK8检测过表达及敲低miR-133b时细胞增殖情况,qRT-PCR及Western blot检测结缔组织生长因子(CTGF)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)及Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)的表达水平;生物学软件预测miR-133b的靶基因,双荧光素酶报告实验证实miR-133b与靶基因的直接调控作用。 结果 qRT-PCR检测结果显示,转染miR-133b mimic后miR-133b的表达水平明显高于阴性对照组(t=26.219,P=0.000),转染miR-133b inhibitor后miR-133b的表达水平明显低于阴性对照组(t=6.738,P=0.003)。转染CFs 21、45、69、93和117 h后,与阴性对照组相比,miR-133b mimic组CFs增殖能力明显降低,而miR-133b inhibitor组CFs增殖水平明显上升(P均<0.05)。与阴性对照组相比,过表达miR-133b后,CTGF(t=9.213,P=0.001;t=8.195,P=0.001)、α-SMA(t=6.511,P=0.003;t=4.434,P=0.011)、collagenⅠ(t=3.172,P=0.034;t=4.053,P=0.015)及collagen Ⅲ(t=6.404,P=0.003;t=5.319,P=0.006)的mRNA和蛋白表达水平均明显下调;敲低miR-133b后,CTGF(t=9.439,P=0.001;t=14.100,P=0.000)、α-SMA(t=4.519,P=0.011;t=4.377,P=0.012)、collagenⅠ(t=5.966,P=0.004;t=5.514,P=0.005)及collagen Ⅲ(t=4.622,P=0.010;t=4.996,P=0.008)的mRNA和蛋白表达水平均明显上升。共转染miR-133b mimic和WT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性明显低于共转染mimic control和WT 3’UTR表达载体的细胞(t=5.654,P=0.005),共转染miR-133b mimic和MUT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性与共转染mimic control和MUT 3’UTR表达载体的细胞差异无统计学意义(t=0.380,P=0.724)。结论 miR-133b可能是通过靶向抑制CTGF来影响CFs的活化增殖,从而改善心肌纤维化。     

PDCD5在子宫内膜癌中的表达及临床意义

目的：检测程序性细胞死亡因子5（programmed cell death 5,PDCD5）在子宫内膜癌（Endometrial carcinoma ,EC）组织中的表达水平,结合临床资料,并分析其意义,初步探讨PDCD5的表达与子宫内膜癌发生的相关性。方法分别采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学法检测PDCD5 mRNA和蛋白的表达水平。结果子宫内膜癌中PDCD5 mRNA的表达明显低于对照组,且差异有统计学意义,P＜0.05。结果显示PDCD5的表达水平和EC患者的临床分期、组织学分级、肌层浸润以及有无淋巴结转移有相关性（P均＜0.05）,而与子宫内膜癌患者的年龄未发现明显的关联性（P＞0.05）。结论 PDCD5;可能成为一种潜在的子宫内膜癌的早期诊断分子标记物。     

早期食管癌患者外周血微小RNA-15b和微小RNA-34c的表达水平及其临床意义

目的探讨早期食管癌患者外周血中微小RNA(miRNA)-15b和miRNA-34c表达水平及其临床意义。方法纳入113例早期食管癌患者(食管癌组)及113例健康者(对照组)。检测两组血清miRNA-15b、miRNA-34c表达水平。分析miRAN-15b和miRAN-34c与早期食管癌发生及临床病理特征关系,并评估两者对早期食管癌诊断价值。结果食管癌组血清miRNA-15b、miRNA-34c表达水平均低于对照组(均P<0.05)。低分化早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c水平低于高、中分化患者(均P<0.05),TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-15b、miRNA-34c水平低于TNM分期Ⅰ期患者(均P<0.05)。miRNA-15b相对表达水平≤0.78、miRNA-34c相对表达水平≤0.69是早期食管癌发生的危险因素(均P<0.05)。外周血血清miRNA-15b相对表达水平与miRNA-34c相对表达水平联合预测早期食管癌的曲线下面积为0.949(P<0.001),敏感度为93.00%,特异度为81.80%,均高于单一指标。...     

MicroRNA-15b在子宫内膜癌组织中的表达及其对子宫内膜癌细胞增殖的影响

目的探讨microRNA-15b(miR-15b)在子宫内膜癌组织中的表达及其对子宫内膜癌细胞增殖的影响。方法选取2013年2月至2017年2月新乡市中心医院收治的87例子宫内膜癌患者手术切除的子宫内膜癌组织,另选取45例因子宫肌瘤行子宫全切术患者的正常子宫内膜组织作为对照,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中miR-15b的表达,并分析miR-15b表达与患者临床病理特征的关系。培养人子宫内膜癌HEC-1A细胞,随机分为miR-15b模拟物组、对照序列组和空白对照组,采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-15b表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率和细胞周期变化。结果子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中miR-15b相对表达量分别为1.32±0.13、2.49±0.16,子宫内膜癌组织中miR-15b相对表达量低于正常子宫内膜组织(t=46.184,P<0.05);子宫内膜癌组织中miR-15b相对表达量与国际妇产科联合会分期、肌层浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、组织学类型、分化程度、是否累及淋巴管和血管无关(P>0.05)。与空白对照组和对照序列组比较,miR-15b模拟物组人子宫内膜癌细胞中miR-15b相对表达量显著增加(P<0.05),培养24、48、72、96 h时细胞增殖能力均降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),G_0+G_1期细胞比例显著增加(P<0.05),而G_2+M期细胞比例减少(P<0.05)。空白对照组与对照序列组人子宫内膜癌细胞中miR-156相对表达量、培养12、24、48、72、96 h时细胞增殖能力、细胞凋亡率及G_0+G期、S期和G_2+M期细胞比例比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-15b在子宫内膜癌组织中呈低表达,上调子宫内膜癌细胞中miR-15b基因表达可抑制细胞增殖,其机制可能与阻滞细胞周期及促进细胞凋亡有关。     

miR-193b对子宫内膜癌侵袭的影响

目的 探讨miR-193b对人子宫内膜癌细胞侵袭的影响及其机制.方法 人子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞转染miR-193b抑制剂(miR-193b inhibitor) 24h后,利用Transwell小室评价分析其侵袭能力的变化.进一步,我们利用Western blot验证侵袭相关基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease,MMP)-2、MMP-9蛋白的表达.结果 miR-193b inhibitor有效抑制HEC-1A细胞细胞内miR-193b表达,并且其侵袭能力较对照组明显下降(P＜0.05).Western blot验证miR-193b inhibitor可有效抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达.结论 miR-193b通过可调节侵袭相关MMP-2、MMP-9蛋白表达有效调控HEC-1A细胞细胞侵袭能力.     

MicroRNA-29b在动脉粥样硬化血管中的表达

目的应用荧光定量PCR技术分析MicroRNA-29b（miR-29b）在Apo-E基因敲除小鼠的动脉粥样硬化（atheroscle—rosis）模型斑块血管中的表达情况,探讨miR-29b在动脉粥样硬化发生、发展过程中的作用。方法8只5周龄、雄性SPF级载脂蛋白E基因敲除小鼠（C57BL／6J—ApoE-／-,apolipoproteinE—deficientmice）为实验组（FS组）。8只雄性、SPF级、相同周龄的C57BL／6J小鼠为对照组（NS组）。高脂（1％胆固醇＋15％猪油）喂食15、20周龄取材检测。结果FS组和NS组体重[（29．10±2．53）g和（33．20±5．18）羽无明显差异（P〉0．05）;FS组较NS组血清总胆固醇（（13．52±1．58）mmol／L和（2．12±0．35）mmol／L]显著增高（P〈0．01）;FS组主动脉出现典型的无动脉粥样硬化斑块;NS组主动脉管壁正常,无动脉粥样硬化斑块;FS组主动脉弓miR-29b的表达较NS组[平均吸光度值：（2．10±0．27）和（17．56±1．07）1明显降低（P〈0．01）。结论在高脂喂食的载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型中．miR-29低表达可能与动脉粥样硬化斑块的形成有关。     

miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨miR-200b与miR-200c靶向DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A和DNMT3B对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。方法以人卵巢癌细胞株(A2780)、人卵巢癌顺铂耐药细胞株(A2780/DDP)作为研究对象,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测A2780、A2780/DDP细胞株中miR-200b与miR-200c表达量。耐药细胞株A2780/DDP转染后分为si-miR-200b组、si-miR-200c组、si-NC组,MTT法检测转染后3组细胞IC50值;蛋白印迹免疫法(Western blotting)检测转染后3组细胞DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平;流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果qRT-PCR结果显示A2780细胞系中miR-200b与miR-200c表达高于A2780/DDP细胞系(P＜0.05)。 si-miR-200b组和si-miR-200c组IC50值、DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B 蛋白表达水平低于si-NC组(P＜0.05)。结论miR-200b与miR-200c高表达能抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B基因表达,从而逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。     

miR-200b靶向VEGF抑制肺癌细胞侵袭

目的 探讨miR-200b是否通过靶向调控血管内皮生长因子(VEGF)抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭,以揭示miR-200b的抑瘤机制。方法运用qRT-PCR检测miR-200b在非小细胞肺癌和癌旁正常肺组织中的表达;将非小细胞肺癌A549细胞分为miR-200b mimics组、miR-200b inhibitors组、scramble组、VEGF-siRNA组和control-siRNA组,分别将miR-200b mimics、miR-200b inhibitors、scramble、VEGF-siRNA、control-siRNA转染于A549细胞;采用Western blot检测A549细胞中VEGF蛋白表达,采用Transwell侵袭实验分别检测A549细胞侵袭能力。结果qRT-PCR检测结果显示,miR-200b在A549、16HBE细胞的表达分别为0.704±0.053、1.582±0.071,两者比较,差异有显著性(P<0.01);Western blot结果显示,外源过表达miR-200b或沉默VEGF能明显下调A549细胞中VEGF蛋白的表达水平;Transwell侵袭实验显示,转染miR-200b mimics或沉默VEGF 36 h后穿过基底膜的细胞数分别为(127±6)和(136±8),与对照组(189±14)比较能明显抑制A549细胞的穿膜能力(P<0.05),而转染miR-200b inhibitors可拮抗VEGF-siRNA对A549细胞的侵袭抑制作用。结论miR-200b通过靶向调控VEGF抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭。     

miR200家族在乳腺癌患者血浆中表达水平的检测及其临床意义

目的：检测microRNA200（miR200）家族在乳腺癌患者和正常人血浆中表达水平,评价其对乳腺癌筛查、进展和预后评估的潜在价值。方法：收集82例乳腺癌患者（乳腺癌组）和30名健康女性（对照组）的血浆标本,提取血浆中的微小RNAs （miRNAs）,逆转录后采用实时荧光定量PCR法检测2组受试对象血浆中miR200家族（miR200a、miR200b、miR200c、miR141和miR429）的表达水平;采用受试者工作特征（ROC）曲线评价血浆中miRNAs的诊断价值,分析乳腺癌患者血浆miRNAs表达水平与临床病理参数的关系;采用Cox风险比例模型进行生存分析。结果：乳腺癌组患者血浆中miR141表达水平低于对照组（P<0.01）,ROC曲线下面积（AUC）为0.717（P<0.01）;miR200b表达水平低于对照组（P=0.006）,AUC为0.685（P=0.003）;但miR200a、miR200c和miR429表达水平与对照组比较差异无统计学意义（P=0.268,P=0.075,P=0.872）。联用miR141和miR200b时,AUC为0.735,比单用miR141稍有提升。miR200家族的表达水平与乳腺癌临床病理特征和术后总生存期无关联（P>0.05）。结论：miR200b和miR141有可能作为乳腺癌诊断的分子生物学指标。     

CD200在皮肤鳞癌进展过程中的表达

目的研究CD200蛋白在皮肤鳞癌不同进展阶段中的变化趋势。方法收集正常皮肤、日光性角化病、鲍温病、鳞癌、浸润鳞癌的皮肤组织标本各20例,免疫组织化学法检测CD200蛋白在组织中的表达。结果日光性角化、鲍温病、鳞癌和浸润鳞癌组织CD200的表达比例均较正常组织显著增高（P〈0.01）;鳞癌和浸润鳞癌组织CD200的表达比例较日光性角化及鲍温病均显著增高（P〈0.01）。结论 CD200的高表达可能促进了皮肤鳞癌的进展。     

原发性开角型青光眼患者血清 miR-29b 差异性表达

目的检测散发原发性开角型青光眼（POAG）患者血清miR-29b表达,探讨miR-29b在分子水平致病机制中的作用。方法通过qRT—PCR技术检测并比较20例散发POAG患者及20例健康对照者血清miR-29b表达的差异性。结果散发POAG组血清miR-29b相对表达量是健康对照组的0．15倍,差异有统计学意义（P=0．03）。结论散发POAG组血清miR-29b表达较健康对照组明显下调,提示miR-29b在POAG致病机制中可能起重要作用。     

DADS上调miR-200b抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长与侵袭

目的 探索miR-200b和二烯丙基二硫(DADS)相关的抑瘤机制,为揭示DADS抑制视网膜母细胞瘤生长及侵袭的内在分子机制提供理论依据.方法 采用qRT-PCR分别检测不同浓度的DADS对Y79细胞miR-200b表达的影响,DADS分别设置六种浓度:0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L.MTT和Transwell侵袭实验分别检测DADS和miR-200b对Y79细胞生长及侵袭能力的影响,将实验设置成五个组,即miRNA阴性对照组(瞬时转染scramble 40μmol/L);miR-200b组(瞬时转染miR-200b-mimics 40μmol/L);DADS阴性对照组(DMSO 10μmol/L,即mock组);DADS组(DADS 200μmol/L)和DADS+miR-200b组(瞬时共转染miR-200b-mimics 40μmol/L)和DADS (200μmol/L).结果 DADS可上调Y79细胞中miR-200b的表达,且其呈剂量依赖性(P<0.05);在MTT实验中,miR-200b组的OD值(0.549±0.057)较miRNA阴性对照组(0.737±0.135)明显降低;DADS组的OD值(0.508±0.064)较DADS阴性对照组(0.722±0.145)明显降低;而DADS+miR-200b组的OD值(0.362±0.081)较miRNA阴性对照组和DADS阴性对照组降低最为显著(P<0.05),即DADS可以通过上调miR-200b抑制Y79细胞的增殖能力.在Transwell侵袭实验中,外源性的高表达miR-200b组(105±13)较miRNA阴性对照组(162±12)能够显著抑制Y79细胞的穿膜细胞数,DADS组(102±13)较DADS阴性对照组(154±8)能够显著降低Y79的穿膜细胞数,且DADS+miR-200b组(77±8),细胞穿膜细胞数较miRNA阴性对照组和DADS阴性对照组减少最显著(P<0.05),即DADS通过上调miR-200b抑制Y79细胞侵袭.结论 DADS通过上调miR-200b的表达抑制视网膜母细胞瘤细胞的生长及侵袭.     

PTEN蛋白及P53蛋白在子宫内膜癌中的异常表达

目的 探讨子宫内膜癌组织中抑癌基因PTEN、P53的异常表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测子宫内膜单纯性增生20例、子宫内膜复杂性非典型增生20例、子宫内膜癌35例中PTEN及P53的表达,表达率的差异采用卡方检验.结果 PTEN在子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性非典型增生、子宫内膜癌中的表达缺失率逐渐上升,表达缺失率与组织学分级有关,差异有统计学意义(0.05).P53在子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性非典型增生、子宫内膜癌中的阳性表达率逐渐上升,阳性率与组织学分级有关,差异有统计学意义(0.05).结论 PTEN、P53均与子宫内膜癌的发生、发展有关.     

人CD200基因克隆及pcDNA3-CD200表达质粒的构建

目的：克隆人CD200基因并构建pcDNA3-CD200表达质粒。 方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法,从用200 μg Con A刺激62 h后的正常人外周血白细胞中扩增出CD200基因,与pMD18T载体连接后,做全自动DNA测序,并用亚克隆的方法构建pcDNA3-CD200表达质粒。 结果：从正常人外周血白细胞扩增的人CD200基因与GenBank中人CD200序列（NM -005944）完全相同。 结论：成功地克隆人CD200基因并构建了pcDNA3-CD200表达质粒。