人参环氧炔醇对体外培养RSC96细胞的实验观察

目的研究人参环氧炔醇(Panaxydol,PND)对体外培养RSC96细胞神经营养因子及髓鞘蛋白表达的影响并探讨其机制。方法用含不同血清浓度的培养基培养RSC96细胞,MTT检测其增殖能力,以获取最适宜RSC96细胞体外生长的血清浓度。在适宜的血清培养基中加入PND(10μmol/L)处理RSC96细胞,以RT-PCR、western blot及ELISA检测RSC96细胞NGF和BDNF的表达。另外,预先在培养基中加入钙离子通道阻滞剂尼非地平探讨PND可能的作用途径。结果培养基血清浓度为4mmol/L时,RSC96细胞生长形态最接近于原代Schwann细胞。PND增强RSC96细胞表达和释放NGF和BDNF(P0.05)。尼非地平的使用,则削弱了PND对RSC96细胞的作用(P0.05)。结论在适宜的血清培养基中,体外培养的RSC96细胞可替代原代Schwann细胞,作为研究药物对它的影响及机制的细胞模型。PND增强RSC96细胞的生物活性的作用机制可能通过Ca2+信号途径介导。     

感觉神经和运动神经Schwann细胞的培养研究

为了建立应用于神经组织工程的感觉神经和运动神经的 Schwann细胞的体外培养方法 ,采用联合酶消化法对 SD乳鼠后根神经和股神经运动支的 Schwann细胞进行了培养 ,并经抗 S10 0荧光染色鉴定和双抗体夹心间接 Elisa法测量两种 Schwann细胞培养基中 NGF的表达。结果表明 ,两种培养细胞经荧光染色证明均为 Schwann细胞 ,细胞纯度均超过 95 % ,光镜观察未见形态学差异 ,但 NGF的表达量和表达模式均有显著性差别 (P<0 .0 5 )。提示 ,本实验方法可以获得高纯度的感觉神经和运动神经的 Schwann细胞 ,两者的生物学功能有一定差异。     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

电刺激对背根节神经元/Schwann细胞联合培养体系髓鞘蛋白P0表达的影响

目的:建立体外背根节神经元与Schwann细胞联合培养模型,观察短时低频电刺激对Schwann细胞髓鞘蛋白表达的影响。方法:培养和纯化背根节神经元与Schwann细胞,制成背根节神经元/Schwann细胞联合培养体系。于L-ascorbic acid诱导的同时,施予低频电刺激(20Hz,100μs,3V),持续作用1h,分别于L-ascorbicacid诱导后第0,2,4,8和10d取各组培养基上清以ELISA测定其中脑衍生物神经生长因子(BDNF)的水平。另外,于诱导后第7d和14d检测培养体系中髓鞘蛋白P0的表达。结果:电刺激组各时间点BDNF的浓度较对照组显著升高(P0.01)。经电刺激作用后,联合培养体系中P0表达上调(P0.05)。然而,电刺激结束后在培养液中加入TrkB-Fc,P0的表达水平则显著降低(P0.05)。结论:在神经元存在的条件下,短时低频电刺激可促进离体Schwann细胞合成P0,初步认为该作用通过刺激神经元分泌BDNF增多所致。     

人参环氧炔醇对体外培养施万细胞表达神经营养因子的影响及可能机制的研究

目的 研究人参环氧炔醇(PND)对体外培养施万细胞(SCs)神经营养因子(NTFs)表达的影响;并探讨其机制.方法 用含有不同浓度的PND培养液分别处理SCs,以免疫组织化学法检测PND对SCs NTFs表达的影响;放射免疫方法测定SOs内环磷酸腺苷(cAMP)水平的变化,并进行图像处理及统计学分析.结果 PND分别在2.5～20.0μmol/L及5.0～20.0μmol/L剂量范围内可分别促进体外培养SCs NGF及大脑衍生神经营养因子(BDNF) 的表达(P<0.05),在10μmol/L剂量对两者促进作用均最明显(P<0.01);在2.5～20.0μmol/L剂量范围内PND可提高体外培养SCs胞内cAMP含量(P<0.05),而在10μmol/L剂量作用最显著(P<0.01).结论 PND能明显促进体外培养SCs NGF、BDNF的表达和分泌;PND可提高SCs的胞内cAMP水平,并与PND促进体外培养SCs NGF、BDNF 表达之间存在相关性,提示其可能是PND提高体外培养SCs NGF、BDNF表达的调控机制及信号传导通路.     

IL-1β促进Schwann细胞增殖及分泌NGF的研究

为观察白介素-1β(IL-1β)对Schwann细胞增殖及分泌神经生长因子(NGF)的影响,本研究取3d龄的大鼠坐骨神经纯化培养Schwann细胞,然后分4组进行处理。处理方法为:A组加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,B组仅在纯化后第1d向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,C组每天向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,D组隔天向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,分别培养5d。倒置显微镜下观察Schwann细胞的形态,用抗S-100蛋白免疫组化鉴定Schwann细胞,经流式细胞仪(FCM)检测细胞的分裂增殖情况,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测NGFmRNA表达的变化,酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测细胞培养基中NGF蛋白的表达量。结果显示:D组Schwann细胞增殖率、NGFmRNA合成量和NGF蛋白表达量均显著高于其他三组(P<0.05)。此结果说明IL-1β能够促进Schwann细胞的分裂增殖,并且促进胞内NGFmRNA的合成及胞外NGF的分泌,其作用持续时间大约为2d。     

脂肪源性干细胞修复周围神经损伤潜能的研究

目的:体外原代培养脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC),并在细胞水平检测各种神经营养因子(neurotrophic factor,NF)的表达情况,探讨ADSC是否可以作为神经损伤修复的种子细胞。方法:体外原代培养和鉴定ADSC,应用RT-PCR方法检测ADSC细胞神经营养因子,包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin 3,NT-3);免疫组织化学法检测粘附因子(nerve cell adhesion molecule,NCAM)表达情况。结果:ADSC可以向脂肪和骨两方面分化;RT-PCR结果显示ADSC细胞NGF、BDNF、NT-3 mRNA水平明显升高;同时免疫荧光法检测到了高水平的NCAM。结论:ADSC具有干细胞分化潜能,并且能够表达NF和NCAM。     

嗅鞘细胞促进神经干细胞增殖的实验研究

目的 探索体外嗅鞘细胞对神经干细胞增殖的影响及其机制.方法 体外培养神经干细胞和嗅鞘细胞,分别采用共培养及共培养液培养,观察嗅鞘细胞对神经干细胞增殖的影响.用免疫组织化学和RT-PCR检测嗅鞘细胞表达的细胞因子及其受体的情况.结果 共培养及共培养液培养4d后,神经干细胞细胞数量明显增多并有部分细胞分化,与对照组相比有显著性差异(P<0.05).RT-PCR结果显示,嗅鞘细胞表达β-NGF、BDNF、NT-3、PDGF-B、trkA和trkB的mRNA,而不表达NT-4.免疫组织化学嗅鞘细胞呈NGF、BDNF和p75染色阳性.结论 嗅鞘细胞表达或分泌大量细胞因子,如NGF、BDNF、NT-3和PDGF,并可能通过旁分泌或靶源性模式作用于神经干细胞,促进其增殖.     

脑源性神经营养因子对雪旺细胞增殖和分泌的影响

目的:评价脑源性神经营养因子(BDNF)对雪旺细胞(SCs)增殖、分泌功能的影响。方法:取新生SD大鼠双侧臂丛神经,用双酶消化法体外培养SCs,并检测特异性标志蛋白S-100的表达。按培养基中BDNF终浓度的不同将所培养的SCs设立0、10、20、50、100 ng/mL组,共5组培养2周,每2 d用MTT法测细胞活力。并对不同浓度BDNF处理的SCs培养24 h后,取上清液,ELISA法测细胞分泌神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)水平。结果:培养出的细胞呈S-100阳性,为SCs。与0 ng/mL BDNF组比较,终浓度为50、100 ng/mL BDNF组的SCs细胞活力明显高于0 ng/mL组(均P<0.05),而浓度为10、20 ng/mL时虽有差异但无统计学意义(均P>0.05)。SCs能分泌NGF和FGF;其中终浓度为50 ng/mL BDNF组的SCs分泌NGF和FGF水平最高(P<0.05)。结论:BDNF对SCs的增殖和分泌功能有促进作用,终浓度为50 ng/mL时,SCs的活力与分泌能力最佳。     

BDNF、NGF对体外培养的胚胆碱能神经元生长发育的影响

本文用AChE组化方法，研究了BDNF、NGF对培养的胚鼠基底前脑胆碱能神经元的作用及BDNF和NGF的协同作用。结果表明BDNF和NGF都具有增加AChE阳性神经元数量的作用，二者的不同在于BDNF作用出现的时间较早、强度较小；而NGF作用出现的时间较迟但强度较大。并发现BDNF对体外培养的胚胆碱能神经元胞体早期的生长发育作用比较明显，而NGF的作用则不甚显著。BDNF对胚胆碱能神经元发出突起和突起的延伸作用较NGF强。BDNF和NGF的联合作用较单独使用BDNF或NGF为好。本文的结果提示在体外培养中两种营养因子联合应用较只用一种因子有益。     

巨噬细胞条件培养基影响新生鼠雪旺氏细胞表达神经生长因子的实验研究

为了研究巨噬细胞对雪旺氏细胞表达神经生长因子的影响，制备了脂多糖激活的和未激活的成年大鼠腹腔巨噬细胞的条件培养基，取3种不同浓度，分别施加于纯化培养的新生鼠雪旺氏细胞。作用24、48、72h，用神经生长因子单抗及间接免疫荧光法显示细胞，用流式细胞仪进行测试和统计分析。结果发现，脂多精激活的巨噬细胞条件培养基或未激活者，取其不同浓度、作用不同时间后，均能不同程度地提高新生鼠雪旺氏细胞的神经生长因子阳性表达率及细胞内的神经生长因子含量。提示巨噬细胞条件培养基中含有促进雪旺氏细胞表达神经生长因子的物质，巨噬细胞可能通过分泌细胞因子调节雪旺氏细胞对神经生长因子的表达．     

脊髓半横断损伤后腹角神经元神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3和神经营养因子-4表达的变化

目的:探讨大鼠脊髓半横断损伤(htSCI)后脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子(NT-3、NT-4)在脊髓腹角神经元表达的早期变化。方法:免疫组织化学ABC法分别染4种神经因子并作阳性细胞计数。结果:NGF主要分布于脊髓腹角神经元的胞核,BDNF、NT-4与NT-3主要分布于胞浆。htSCI前后它们在细胞内的分布范围没有变化。BDNF、NGF与NT-3的3 d在损伤尾侧段脊髓双侧腹角阳性神经元数与对照组相比显著减少。BDNF与NGF的14 d的双侧腹角阳性神经元数量均较正常组明显增多,NT-3与NT-4的14 d~21 d的双侧腹角阳性神经元数量均较正常组明显增多,BDNF7~21 d以及NGF14 d的健侧的阳性神经元数量均分别多于相应的伤侧。结论:内源性BDNF、NGF、NT-3、NT-4增加对脊髓损伤修复具有重要作用,BDNF和NGF在健侧表达的增加说明健侧代偿功能的活跃。     

Selective induction of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor by LPS and allergen in dendritic cells

Background Neurotrophins are produced by various cells upon different stimuli and participate in the initiation and regulation of inflammation in various diseases including allergy and asthma, but little is known about the production and control of neurotrophins by dendritic cells (DCs). The aim of this study was to assess whether DCs produce the neurotrophins nerve growth factor (NGF) and brain‐derived neurotrophic factor (BDNF), and whether inflammatory stimuli or allergens are able to induce the production of neurotrophic factors. Methods Monocyte‐derived dendritic cells (MoDCs) were generated from different donors. The neurotrophins NGF and BDNF were demonstrated by RT‐PCR, Western blotting, flow cytometry analysis and fluorescence microscopy. MoDCs were cultured and stimulated with lipopolysaccharide (LPS) or allergen for 24 h. The supernatants and cells were collected. Measurement for NGF and BDNF was performed by ELISA. Results DCs express mRNA for the neurotrophins NGF and BDNF. Proteins were detectable by Western blot, FACS analysis and fluorescence microscopy. LPS led to an up‐regulation of BDNF, while NGF was unaffected. Cell lysates demonstrated an increased amount of BDNF after stimulation with LPS or allergen, while NGF was not affected significantly. Conclusions DCs are a source of neurotrophins. LPS selectively regulates the production of BDNF. Allergen stimulation leads to an LPS‐independent regulation. This contributes to a complex involvement of neurotrophins in allergic diseases.     

Nerve growth factor prevents apoptosis of cord blood-derived human cultured mast cells synergistically with stem cell factor

BACKGROUND: Stem cell factor (SCF) has been identified as a critical survival factor of human mast cells. Other cytokines which possess survival promotion activity on human mast cells are less known. OBJECTIVE: We examined the survival promotion activity of nerve growth factor (NGF) on cord blood-derived human cultured mast cells. METHODS: Expression and function of NGF receptors on the mast cells were examined by RT PCR, flowcytometric analysis, immunoprecipitaion and western blotting. The survival promotion activity of NGF to the mast cells was examined. To evaluate the proliferating activity of NGF on the human cultured mast cells, flow cytometric analysis with propidium iodide staining was applied. To confirm whether the human mast cell growth activity of NGF was caused by a suppression of apoptosis, the proportion of the cells containing in situ DNA fragmentation was counted. RESULTS: The human cultured mast cells expressed the high affinity receptor p140trk but not the low affinity receptor p75LNGFR. NGF induced the phosphorylation of p140trk. NGF alone could not support the survival of the mast cells, however, the addition of NGF to the culture medium containing recombinant SCF led to a significant increase of the number of survival mast cells. No significant changes of the cell cycle from G0/G1 phase to the S/G2 + M phases were observed by NGF. In contrast, the addition of NGF to the medium with SCF showed a significant inhibitory effect on the apoptosis of the mast cells. CONCLUSION: NGF may act as a key factor to promote the survival of human mast cells synergistically with SCF through the prevention of apoptosis.     

施万样细胞对大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响

目的观察施万样细胞对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊神经节NGF和BDNF表达的影响,初步探讨施万样细胞对脊神经节的保护作用。方法先将脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)诱导分化为施万样细胞并对后者进行鉴定,后将二者分别植入脱细胞神经移植物(ANA)中,构建组织工程神经。大鼠随机分为正常对照组、ADSC组和施万样细胞组。后两组建立SNI模型并用相应的组织工程神经桥接损伤的神经。术后4周采用Western Blot和Real-time PCR检测各组大鼠脊神经节神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)蛋白和m RNA的表达。结果 ADSCs能够诱导分化为施万样细胞并表达施万细胞标记物S100β和GFAP蛋白。施万样细胞组大鼠脊神经节内NGF和BDNF蛋白及m RNA表达量均高于ADSC组(P0.05)。结论施万样细胞可上调脊神经节NGF和BDNF的表达,对SNI所致的脊神经节内神经元损伤有保护作用。