BMP2、VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的观察转染BMP2和VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达情况。方法脂质体介导下将双基因真核表达质粒pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学方法观察BMP2和VEGF165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达。结果转染BMP2、VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞有明显的BMP2和VEGF165 mRNA及其蛋白表达。结论转染BMP2和VEGF165双基因的小鼠骨,髓基质干细胞能同时表达以上两种基因。     

转染bFGF基因对人骨髓间充质干细胞增殖特性的影响

目的 探讨作为组织工程种子细胞的人骨髓间充质干细胞,在体外培养条件下转染bFGF基因对其增殖特性的影响.方法 利用脂质体将含人pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代人BMSCs,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR和免疫荧光检测转染bFGF的骨髓间充质干细胞bFGF基因及其产物的表达,MTY法检测和流式细胞仪检测细胞的增殖情况和细胞增殖周期,并将转染和非转染BMSCs分别成骨诱导分化,对其碱性磷酸酶活性进行测定.结果 脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染BMSCs,经荧光定量PCR和免疫荧光检测.证实转染细胞表达bFGF.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高（P〈0.05）.碱性磷酸酶活性检测结果表明转染细胞的碱性磷酸酶活性高于非转染细胞（P〈0.05）.结论 用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的hBMSCs,bFGF基因改良的BMSCs可以改善其生存状态、促进其增殖,并可促进向成骨细胞分化.     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化鉴定

目的建立神经干细胞分离、培养和分化鉴定技术。观察神经干细胞生长、增殖特点。方法利用无血清培养,从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代观察。采用荧光免疫细胞化学检测技术,观察鉴定神经干细胞及其分化结果。结果从胚胎大鼠海马、纹状体等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有巢蛋白(nestin)表达阳性细胞,显微镜下观察见典型的干细胞特征。分化为3种神经细胞类型:神经元、胶质细胞、少突胶质细胞。结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,通过鉴定确为神经干细胞,并经过分化鉴定确认。     

IGF2在小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞过程中的表达

【摘要】目的观察印迹基因胰岛素样生长因子（IGF）2在小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞过程中的表达情况。方法体外诱导胚胎干细胞向胰岛样细胞分化,逆转录-PCR（RT-PCR）和细胞免疫荧光检测胰岛细胞标志基因表达;聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)检测印迹基因IGF2在诱导分化前后细胞中的亲本表达情况。结果诱导分化终末细胞能表达胰岛素、胰高糖素及C肽等胰岛细胞特异性标志物,PCRRFLP检测分析显示,体外诱导分化的细胞的印迹基因IGF2呈双等位基因表达,印迹丢失。结论体外诱导培养可导致胚胎干细胞印迹基因IGF2表达的改变。     

SV40T抗原基因永生化新生大鼠前软骨干细胞株的构建

目的建立永生化大鼠前软骨干细胞（PSCs）株，为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用LipofectamineTM2000介导基因转染，将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达，用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养，观察细胞形态及生长状况，绘制细胞生长曲线，用免疫细胞化学方法和RT PCR鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。结果分离获得转化细胞阳性克隆，用免疫组化证实FGFR 3表达阳性，提取RNA后用RT PCR法成功扩增出588 bp的片段。转染细胞经扩大培养，命名为永生化前软骨干细胞。贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为 (22.98±2.77) h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论在体外培养条件下，可以从新生大鼠干骺端分离、培养出前软骨干细胞，pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。     

超声介导心肌营养素1基因转移骨髓间充质干细胞及表达测定

目的 探讨超声介导白蛋白微泡破裂促进心肌营养素1(CT-1)基因转移骨髓间充质干细胞(MSC)表达的测定.方法 从分离培养的新生大鼠心肌细胞中克隆CT-1基因,构建其表达载体,与白蛋白微泡混合后,在超声作用下介导CT-1基因转染大鼠MSC,荧光显微镜及流式细胞术检测报告基因EGFP的表达,Western blot检测MSC中CT-1表达.结果 可获大鼠CT-1编码基因,并成功构建表达载体pIRES2-CT-1.体外实验结果示,以脉冲0.75 W/cm2作用30 s转染2次,可以有效地将CT-1基因转染MSC,经转染的MSC可以表达分泌CT-1及报告基因EGFP.结论 超声介导白蛋白微泡破裂可以有效促进CT-1基因转染MSC,该技术可能为临床应用基因联合干细胞移植治疗急性心肌梗死提供新的方法.     

骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质干细胞复合壳聚糖体外构建组织工程软骨的实验研究

目的观察转人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞方向分化的能力,并种植于壳聚糖体外构建组织工程软骨。方法应用慢病毒介导把人BMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因转入大鼠BMSCs,通过荧光观察、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot、免疫组织化学等方法检测BMP-2、Ⅱ型胶原表达及软骨基质分泌情况;噻唑蓝(MTT)检测转基因后细胞的增殖活力。结果BMP-2基因和eGFP基因成功转染BMSCs,Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达均显著增强,细胞种植壳聚糖支架后生长、粘附良好。结论BMP-2可在BMSCs内表达,并诱导其向软骨方向分化;与壳聚糖复合培养可构建组织工程骨。     

人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒转染C17.2神经干细胞增殖及分化的影响

目的观察人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒(Ad-IGF-1)转染对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法体外培养及鉴定C17.2神经干细胞,Ad-IGF-转染C17.2神经干细胞;Western-blotting法检测IGF-1蛋白的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IGF-1蛋白的表达曲线;MTT检测C17.2神经干细胞增殖,NSE及MBP免疫组化观察C17.2神经干细胞体外分化。结果转染AdIGF-1的C17.2神经干细胞成功表达IGF-1蛋白;IGF-1蛋白在病毒转染5～7d达高峰,13d仍高于转染前,Ad-IGF-1转染后各时间C17.2神经干细胞的增殖与对照组相比有显著差异,Ad-IGF-1转染对c17.2神经干细胞向神经元细胞及神经胶质细胞的分化与对照组相比有显著差异。结论Ad-IGF-1转染c17.2神经干细胞可稳定表达IGF-1,Ad-IGF-1转染促进C17.2神经干细胞的增殖及向神经元细胞和少突胶质细胞的分化。     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。     

超声辅助转基因治疗缺血性心脏病的骨髓间充质干细胞的实验研究

目的血管内皮生长因子（VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后出现表达高锋,持续3d左右,其后有些细胞荧光开始减退。结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

VEGF165在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达及鉴定

目的 探讨血管内皮生长因子（VEGF165）转染恒河猴间充质干细胞（MSCs）后的表达情况, 以及转染后对 MSCs 功能的影响。 方法 通过 Ficoll 法分离并培养恒河猴骨髓 MSCs, 进行细胞表型鉴定。 转染 pcDNA-eGFPVEGF165至 MSCs, 荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达情况, 同时流式细胞技术对转染成功的细胞进行细胞表型及 eGFP 表达鉴定, RT-PCR 法检测转染后 VEGF165表达情况。 结果 成功分离到纯度较高的 MSCs, 转染后的 MSCs 及子代细胞均有 eGFP 和 VEGF165 的表达, 且保留了 MSCs 的特性。 结论 VEGF165 基因转染 MSCs 后可以稳定表达外源基因, 且可以维持 MSCs 的特性。     

RNA干扰c-kit对K562细胞成瘤性的影响

目的：研究短干扰RNA（siRNA）对K562细胞中c—kit基因表达的影响。方法：构建针对c—kit基因的shRNA表达质粒pSilencer—kit，在脂质体介导下转染人白血病细胞系K562，应用RT—PCR检测c—kitmRNA水平变化，并将转染后的K562细胞注射裸小鼠体内检测成瘤能力的变化。结果：重组体pSilencer-kit转染细胞后显著下调c—kitmRNA水平及其在裸鼠体内成瘤能力，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）.结论：利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因c—kit的表达，为肿瘤的基因治疗提供新思路。     

SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

Pre-deliver chitosanase to cells: a novel strategy to improve gene expression by endocellular degradation-induced vector unpacking

A radio-labeled plasmid pTracer/Bsd/LacZ containing LacZ reporter gene was complexed with different molecular weights of chitosans (CS). Mouse myoblast cell line C2C12 was transfected by these chitosan-plasmid DNA complexes, and lipofectamine 2000 was used as control. Forty-eight hours after transfection, the activity of beta-galactosidase and radioactive count of cell lysis were determined. It was found that chitosan, especially low molecular weight species, had a surprising ability to deliver DNA into cells, since the radioactive count of cells transfected by chitosan-DNA complexes was even two times that of cells transfected by lipofectamine 2000. But the beta-galactosidase activity of chitosan/DNA complexes was much lower compared to that of lipofectamine 2000. Chitosanase which could degrade chitosan in specific mode was transported into C2C12 cells by osmotic lysis prior to gene delivery. Then these chitosanase-modified cells were transfected by CS-DNA complexes. The results indicated that beta-galactosidase activity in these cells increased markedly to 425.4 +/- 45.1 U/mg protein, nearly two-fold as that of cells transfected by liposome. This transfection protocol was also applied to 3T3 mouse fibroblast, 2T3 mouse osteoblast and MG63 human osteosarcoma cell lines, and an increased gene expression level was observed without exception. It is thought that the incorporated chitosanase could aid in chitosan degradation, which would promote gene unpacking, consequently increasing gene expression.     

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞

目的建立一种研究离子通道的有效模型。方法采用Lipofacta mine2000脂质体将人的超极化激活的环核苷酸门控（HCN）基因转染人胚胎肾（HEK）293细胞,利用全细胞膜片钳技术检测克隆人HCN2基因的表达。结果pcDNA3-hHCN2真核表达载体转染HEK293细胞3d后,全细胞膜片钳技术记录到克隆人HCN2基因编码的通道电流。结论全细胞膜片钳技术稳定、可靠,可为开展克隆离子通道结构和功能关系研究提供基础。     

携带人内皮一氧化氮合酶基因的AAV重组表达载体的构建

目的：构建一个新型的携带有人内皮一氧化氮合酶(eNOS)cDNA的质粒载体并研究其体外表达,以用于基因治疗．方法：eNOS cDNA插入到腺相关病毒质粒pSNAV-1的EcoR I位点．该质粒的启动子为CMV启动子,并携带有腺相关病毒的末端重复序列．构建好的质粒转染到两种哺乳动物细胞BHK和C2C12细胞中,通过PCR和RT—PCR分别检测eNOS cDNA和mRNA．结果：限制性内切酶分析证明,eNOS cDNA以正确的方向插入到pSNAV-1质粒中．PCR检测表明pSNAV—eNOS被转入BHK和C2C12细胞中．RT—PCR检测表明转染有pSNAV—eNOS的细胞可表达eNOS mRNA．结论：成功构建的pSNAV—eNOS可在体外培养的哺乳动物细胞中表达人eNOS mRNA．     

人VEGF165基因的克隆、表达和活性鉴定

目的 克隆人VEGF165基因,构建其真核表达质粒,转染293细胞,并鉴定表达VEGF的生物学活性。方法采用PCR法从人心脏cDNA文库钓取人VEGF165基因,插入pUC19载体测序后与真核表达质粒pAdTrackCMV连接,阳离子脂质体Lipofectamin介导VEGF基因转染293细胞,Northern blot和Western blot法分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达,Miles试验进行活性鉴定。结果(1)琼脂糖凝胶电泳分析得到两个片段,分别为582bp的VEGF165DNA和2．68kb的pUC19线性质粒,结果与理论值相符,VEGF165测序结果与GENE BANK中VEGF165序列完全一致。(2)转染293细胞后表达绿色荧光蛋白,转染后第3天(1024pg／ml)和5天(986pg／ml)VEGF表达最高,明显高于转染前(102pg／ml)。(3)Miles试验结果显示,用转染AdTrackCMV-VEGF165细胞培养上清皮下注射后10分钟左右皮丘变为蓝色,成倍连续稀释后,出现蓝斑的时间延长,蓝斑范围也相应缩小。而注射未转染293细胞培养上清和生理盐水组则未见蓝斑出现。结论成功克隆人VEGF165基因,并表达出具有生物学活性的VEGF蛋白。     

CD147siRNA对恶性黑色素瘤细胞VEGF及血管内皮细胞体外迁移活性的影响

目的研究CD147siRNA对恶性黑色素瘤细胞株A375中VEGF表达水平和血管内皮细胞体外迁移活性的影响。方法采用半定量RT-PCR法检测转染后A375细胞中VEGF mRNA表达的变化。采用ELISA法检测A375细胞与成纤维细胞共同培养后VEGF表达水平的变化。采用细胞迁移实验检测转染CD147siRNA前后的A375细胞对脐静脉内皮细胞株ECV-304在体外迁移活性的影响。结果转染CD147siRNA后,A375细胞中VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著降低,其下调率分别为10.77%（P〈0.05）和38.5%（P〈0.01）。转染CD147siRNA前后的A375细胞与成纤维细胞共同培养后VEGF的表达水平均较单独培养时显著升高,其升高率分别为98.5%（P〈0.01）和159.9%（P〈0.01）。转染CD147siRNA后的A375细胞使ECV-304细胞的体外迁移活性下降44.77%（P〈0.01）。结论 CD147siRNA能有效抑制恶性黑色素瘤细胞株A375中VEGF的表达水平和脐静脉内皮细胞株ECV-304在体外的迁移活性。