人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的　对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法　本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因,并和Ｔ４ 载体相连接,经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆,并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果　凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论　阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确     

人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子cDNA的克隆与表达

目的：克隆与表达人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子ｃＤＮＡ。方法和结果：用逆转录－聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了人及大鼠ＧＤＮＦ成熟序列的ｃＤＮＡ片段，并将人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ重组到表达质粒ｐＢＰＬ中，分别在大肠杆菌中获得了较高表达。结论：人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ的克隆与表达获得成功，为研究ＧＤＮＦ在神经损伤修复中的作用奠定了基础。     

人GDNF基因的克隆

克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法；从脑胶质细胞瘤患术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了一般约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的ＧＤＮＦ基因。     

人GDNF基因的克隆

目的：克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法：从脑胶质细胞瘤患者术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴＰＣＲ方法扩增出了一段约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的人ＧＤＮＦ基因。与发表于ＧｅｎｅＢａｎｋ上的序列相比，发现该研究克隆的基因有一段７８ｂｐ的核苷酸序列缺失，但不影响密码子的阅读框。结论：克隆到了编码正确的人ＧＤＮＦ的ｃＤＮＡ全序列，对帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义。     

人白细胞介素2、β干扰素基因逆转录病毒载体的构建和在人肾细胞癌及其TIL中的表达

从ｐｃＤ－５．１质粒和ｐＳＰＧＮＨＩＦＮＢ１０质粒分别切下人白细胞介素２（ＨｕＩＬ－２）ｃＤＮＡ和人β干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）ｃＤＮＡ，分别克隆到ｐＮＭＳＭ逆转录病毒载体多克隆位点，经酶切鉴定确定正确插入方向。经ＰＡ３１７包装细胞包装成重组病毒，测转染效率。用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测重组病毒感染效率。在８μｇ／ｍｌ鱼精蛋白存在的条件下分别感染人新鲜肾透明细胞癌体外建株细胞以及人肾细胞癌肿瘤浸润性淋巴细胞（ＴＩＬ）。经Ｇ４１８选择阳性克隆后测上清表达ＨｕＩＬ－２及ＨｕＩＦＮ－β活性。结果ＨｕＩＬ－２和ＨｕＩＦＮ分别在转ＨｕＩＬ－２基因和ＨｕＩＦＮ－β基因肾细胞癌细胞的表达量达２５０Ｕ／１０６细胞·ｄ－１和６４００Ｕ／１０６细胞·ｄ－１，在经目的基因转染ＴＩＬ细胞中的表达量分别比未经目的基因转染的ＴＩＬ高２～３倍和４～８倍。ＴＩＬ生长状况未有明显改变，抗肿瘤活性未见明显增强。     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

IGF－I受体cDNA的克隆及序列分析

ＩＧＦ－Ｉ受体在心血管病及肿瘤的发病过程中具有重要作用。本文应用逆转录—聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，克隆了人胎肝组织中ＩＧＦ－Ｉ受体的β亚基ｃＤＮＡ，并对这一ｃＤＮＡ进行了亚克隆和序列分析。本工作为进一步探讨ＩＧＦ－Ｉ受体在动脉粥样硬化、心肌肥厚以及肝癌中的作用奠定了基础。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基cDNA的克隆初步报告

用新鲜的人绒毛膜组织，抽提组织总ＲＮＡ并通过逆转录反应合成ｃＤＮＡ第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术特异性地扩增ｈＣＧ－β－ｃＤＮＡ。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段大小为５００ｂｐ，同预计的片段长度相符。将此片段利用Ｔ－Ａ载体克隆至ＰＣＲⅡ质粒上并进行全序列分析，结果显示克隆片段包含ｈＣＧ－βｃＤＮＡ５’端和３’端非编码区及完整的编码区。     

人腱细胞Smad2、Smad4基因MH2结构域的克隆和序列鉴定

目的从人腱细胞内克隆转化生长因子－β特异的细胞内信号转导基因Ｓｍａｄ２、４的功能性结构域－ＭＨ２结构域。 方法　原代培养人腱细胞,从培养的细胞中提取总 ＲＮＡ,逆转录合成单链 ｃＤＮＡ;设计引物进行 ＰＣＲ,扩增 Ｓｍａｄ２、４基 因ＭＨ２结构域的基因片段,将其定向插入ｐＧＥＭ－Ｔ载体,转化大肠杆菌ＤＨ５α。挑选阳性克隆并进行核苷酸序列测定 分析。结果测序结果与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中克隆的基因序列完全一致。结论从人腱细胞中克隆成功 Ｓｍａｄ２、４基因的 ＭＨ２结 构域,证实了 Ｓｍａｄ２、４基因在人腱细胞中的表达;提示人腱细胞内存在 ＳＭＡＤ２、４信号转导途径,ＴＧＦ－β对人腱细胞 分化的调节可能是通过ＳＭＡＤ２、４信号转导途径实现的。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３－磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳＰＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα     

中国人神经生长因子基因（β—NGF）的扩增,克隆及序列分析

从正常人血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，以此基因组ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ方法扩增神经生长因子基因，把得到的基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２上，经转化、筛选和鉴定得到含有中国人神经生长因子基因（β－ＮＧＦ）的克隆。用双链末端终止法测定其全部３５４ｂｐ核苷酸顺序。测出的核苷酸与文献报道的顺序有６处不同，据此推导出的氨基酸顺序有３处变化。推测中国人神经生长因子基因具有特殊性。     

人抗惭肝表面抗原抗体Fab片段／αA—干扰素融合蛋白原核表达 …

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗。我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α，方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５；引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡＧ抗体Ｆａｂ表达载体ＰＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ＰＨＳ／ＩＦＮ－α，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实     

细胞因子基因修饰人口腔鳞癌细胞株的建立及鉴定

用ＰＡ３１７包装的携带人ＩＦＮ－α，ＴＮＦ－或ＩＬ－２ｃＤＮＡ３种逆转录病毒载体用来转染人口脸鳞癌细胞株Ｔｃａ－８１１３。经新霉素衍生物Ｇ４１８筛选出抗性克隆并扩增产生子代株。ＰＣＲ和细胞因子生物活性测定证实细胞因子基因整合入基因修饰细胞并通过分泌相应活性的蛋白产物。     

人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αA-干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗，我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α。方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５端引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ表达载体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入载体相应酶位点，片段与ＰＣＲ扩增片段大小相同，硷基序列正确。结论：ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ的成功构建，为人抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素融合蛋白在大肠杆菌的表达打下基础     

中国人神经生长因子基因（β－NGF）的扩增、克隆及序列分析

从正常人血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，以此基因组ＤＮＡ为模板，应用ＰＣＲ方法扩增神经生长因子基因，把得到的基因片段重组到质粒ｐＵＣ１２上，经转化、筛选和鉴定得到含有中国人神经生长因子基因（β－ＮＧＦ）的克隆。用双链末端终止法测定其全部３５４ｂｐ核苷酸顺序。测出的核苷酸顺序与文献报道的顺序有６处不同，据此推导出的氨基酸顺序有３处变化。推测中国人神经生长因子基因具有特殊性。     

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2基因的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶－２（ＭＡＳＰ－２）编码区基因。方法采用 ＲＴ－巢式 ＰＣＲ技术从 人胎肝组织总ＲＮＡ扩增目的cＤＮＡ片段,克隆人ｐＧＥＭ－Ｔ载体,酶切图谱分析和测序鉴定。结果获得了编码合信号 顺序的ＭＡＳＰ－２肽链全长cＤＮＡ,将其与pＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－２的重组克隆。酶切图 谱与微机分析结果无异;序列分析表明,与报道的人 ＭＡＳＰ－２ｃＤＮＡ序列一致。结论成功克隆了人 ＭＡＳＰ－２基因,为深 入研究补体凝集素途径的激活机制和甘露聚糖结合凝集素基因突变引起免疫缺损的发病机制奠定了基础。     

未知人Na( )-K( )-Exchanging ATPase α1亚基基因第一内含子的获得及鉴定

目的研究人Ｎａ（＋）－Ｋ（＋）－ＥｘｃｈａｎｇｉｎｇＡＴＰａｓｅα１亚单位基因胞外区约８０～１３０位氨基酸编码序列的未知基因组结构。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对人基因组ＤＮＡ及ｃＤＮＡ文库进行扩增,限制性酶切分析扩增产物,并进行荧光测序,对测序结果进行同源性分析及剪接位点的搜索并对得到的核苷酸序列进行分析。结果人基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ经扩增后分别得到８３３和１９５ｂｐ两种不同大小的片段Ｆｇ,Ｆｃ。分析序列发现Ｆｇ与Ｆｃ相比在１３８～７７５ｂｐ处含有一６３８ｂｐ的插入片段,此片段与ＧｅｎＢａｎｋ中的任何已知序列均无明显同源性。结论本研究发现了一段全新未知的人Ｎａ（＋）－Ｋ（＋）－ＥｘｃｈａｎｇｉｎｇＡＴＰａｓｅα１亚单位基因的内含子全序列,并得到了第一外显子同第二外显子之间的相对位置和序列,其在Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ的基因检索号为Ｌ７６９３８。序列分析表明该内含子可能具有潜在的调控基因表达的功能,并含有一个可能的编码序列。     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应从人脐静内皮细胞ＲＮＡ中扩增了表皮生长因子的ｃＤＮＡ，采用基因重组技术克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在ＰＣＲ扩增引物上分别加有起始密码子和终止密码子，以利于原核表达。经亚克隆，ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的Ｅｃｏ ＲＩ，ＳｍａⅠ位点上，在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。     

携带HuIL—3基因的人肝癌特异性逆转录病毒转体的构建

构建携带人白细胞介素ｃＤＮＡ的人肝癌特异性闻生转录病毒载体。将ＨｕＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，构建ＳＶ４０早期启动子驱动的载体ｐＭＮＳ－ＩＬ－３；从质粒ｐＧＥＭ，７Ｚｆ－ＡＦＰｅ中游离人甲胎蛋白增强子核心序列，先克隆 到ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点上，