酶分层消化法获取视网膜纯感光细胞

目的：探讨分离视网膜感光细胞的方法。方法：采用0．25％胰酶（视网膜感光细胞面朝下法）和2．5％胰酶＋0．2％胶原酶＋0．4％EDTA的消化液（视网膜感光细胞面朝上法）酶分层消化法分离获取纯视网膜感光细胞。结果：酶分层消化法可分离获取纯视网膜感光细胞。结论：酶分层消化法是一种可靠、费用廉价的获取纯视网膜感光细胞的新方法。     

人胚眼视网膜光感受器细胞的体外培养和鉴定

目的：探讨人胚眼视网膜光感受器细胞的获得和体外培养方法,为进行人类视网膜光感受器细胞移植提供理论依据。方法：采用酶分层消化法分离获取了胚眼纯视网膜光感受器细胞,使用视网膜色素上细胞的条件培养液,在体外长期培养并进行形态学鉴别;用苏木素－伊红染色显示消化后的视网膜组织结构层次,以确定所获得取的视网膜光感受器细胞的纯度;用抗视杆细胞特异性视紫质蛋白抗体（rhodopsin4D2,Rho4D2)免疫细胞化学染色做细胞鉴定,结果：酶分层消化法能获取较纯的视网膜光感受器细胞,抗Rho4D2阳性,并能在体外存活较长时间,结论：酶分层消化法所获取的人胚眼纯视网膜光感受感器细胞能在体外较长时间存活,并可表达光感受器细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞特异性视紫质蛋白,将为人类视网膜光感受器细胞的移植和各种体外研究提供细胞来源。     

缺氧对视网膜Müller细胞促红细胞生成素mRNA和蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧条件下促红细胞生成素（EPO）mRNA及蛋白在体外培养的Müller细胞的表达情况。 方法 胰酶消化新生大鼠视网膜组织制成单细胞悬液，机械震荡、吹打法分离纯化视网膜Müller细胞，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学方法对缺氧条件下视网膜Müller细胞EPO基因和蛋白的表达进行测定。 结果 成功获得视网膜Müller细胞，传代后95%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。EPO蛋白的阳性染色位于视网膜Müller细胞的细胞浆及突起上。在正常的视网膜Müller细胞中仅见微弱的EPO mRNA和蛋白表达，而缺氧后表达明显上调，且呈时间依赖性。 结论 Müller细胞在缺氧条件下EPO mRNA和蛋白表达增强，EPO表达水平的升高可能是缺氧性视网膜病变的神经保护因素之一。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 196-199)     

大鼠视网膜神经细胞的原代培养

目的:在前人建立的方法上优化SD大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法,为后续研究提供实验基础。方法:使用胰酶消化法分离新生1～3dSD大鼠视网膜神经细胞,以DMEM/F12为培养基体外培养,免疫组织化学染色的方法进行鉴定。结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接。免疫细胞化学染色显示,培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)抗体反应阳性。结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。     

玻璃体内注射庆大霉素致视网膜损伤的实验研究Ⅱ.组织化学定量分析

为探讨庆大霉素致视网膜损伤后视网膜组织内酶化学组份改变，采用微机分析组化定量方法，分析了注射5种不同剂量庆大霉素的兔视网膜内细胞色素氧化酶和乙酰胆碱酯酶改变，并通过超微结构观察进行比较。结果：100μg庆大霉素注射后3天即可引起细胞色素氧化酶流行性下降，随注入剂量增加或注射后观察时间延长，均呈逐渐下降趋势。100~500μg注射后3天乙酰胆碱酯酶活性变化轻微，7天后其活性受到明显抑制。1000~3000μg注射后3天两种酶活性即完全受到抑制。 （中华眼底病杂志，1994，10：232-235）     

兔胚胎视网膜前体细胞体外培养纯化方法探究

目的 探讨新西兰白兔的胚胎视网膜前体细胞的培养、增殖与纯化方法,并对其性质及体外分化进行鉴定。方法 来源于19d、20d及26d不同孕龄的兔胚胎,用内路法取出含视网膜前体细胞的组织,采用胰酶/EDTA消化,利用组织中不同类型细胞对消化液不同的反应,去除混入的间质细胞等成分,达到逐步分离纯化胚胎视网膜前体细胞的目的。对分离所得的细胞,利用倒置相差显微镜观察其生长5情况,同时对相关类型细胞行免疫细胞化学染色,以鉴定视网膜前体细胞。结果 从兔胚胎视网膜神经部分离出的原代视网膜前体细胞具有明显的生物学特性：所培养细胞可形成悬浮生长的细胞团,刚贴壁的细胞成簇状生长,这些细胞用免疫细胞化学染色神经上皮干细胞蛋白（Nestin）表达呈阳性。经传代几代后细胞生长趋同,细胞生长呈长梭形,逐渐有细胞分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞等,同时Nestin表达下调。结论 不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞均具有相同的形态,这种利用酶消化时间的不同能够分离纯化视网膜前体细胞,为将来研究此类细胞的性质及干细胞的相关研究打下良好的细胞生物学基础。     

恒温摇动法纯化培养大鼠视网膜Mǖller细胞的技术研究

目的 建立一种新的纯化Mueller细胞的技术方法。方法 将原代培养后的混合性视网膜细胞固定在一个摇床平台上，保持在37℃，摇床转速调整到使培养液不生成泡沫的速度，过夜（18-24h)摇动后，将培养液上清弃去，通过免疫细胞化学的方法鉴定原代和摇动法得到的Mueller细胞的纯度。结果 原代培养的视网膜细胞有大量神经元和Mueller细胞混杂，摇动过程使得附着于Mueller细胞上的神经元细胞脱落，Mueller细胞的纯度通过GFAP确定可达95%以上。结论 恒温摇床摇动的方法，提供了一种快速可靠的纯化视网膜Mueller细胞手段。     

视网膜感光细胞纯化方法的研究

目的　探讨改进获取视网膜纯感光细胞的方法。方法　应用改良的准分子激光切削法和酶分层消化法来分离纯化视网膜感光细胞层。结果　由两种方法获取的视网膜组织片经苏木素 -伊红染色均证实为单一的纯感光细胞层并保持生物活性。结论　改良的准分子激光切削法和酶分层消化法均能获取视网膜纯感光细胞 ,且对细胞损伤小 ,内外节段保持完好 ,可为视网膜的移植创造条件。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞,用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的 研究豚鼠近视眼视网膜Muller细胞原代培养的方法.方法 用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型.采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞.用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定.结果 半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成.原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性.结论 酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法.     

增殖性视网膜病变玻璃体切割物的细胞学免疫组化研究

探讨不同视网膜增殖性疾病细胞增殖的特征及其异同。方法 采用３种特异性抗原，即抗人细胞角蛋白，抗胶质纤维酸性蛋白，抗肌动蛋白对２８例临床上不同的视网膜疾病的增殖膜及玻璃体切除液样本进行免疫细胞化学研究。增殖性玻璃体视网膜病变的增殖特征以胶质细胞和视网膜色素上皮细胞为主，二者在ＰＶＲ发病中作用不同。     

Caspase 与视网膜细胞凋亡的研究进展

Caspase作为凋亡执行和效应过程中的关键酶,其级联活化反应是导致视网膜上光感受器细胞、神经节细胞等发生凋亡的共同途径,与多种常见眼病如青光眼、视网膜脱离、年龄相关性黄斑变性、缺血性视网膜损伤、视网膜母细胞瘤等的发生发展密切相关,有关Caspase抑制剂的实验研究近年来也备受关注,本文围绕Caspase在视网膜细胞凋亡中的作用及其相关机制进行综述。     

兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的：探索用改良的二步酶法制备视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液，经改良的内路法，不经玻璃体切割的情况下进行视网膜下间隙的移植，方法：用酶1（含220kU/L透明质酸酶和0．1％的胰蛋白酶）松解视网膜神经上皮细胞与RPE细胞之间的联接，再用酶II（含0．25％胰蛋白酶）从Bruch膜上离散RPE细胞，制成细胞悬液，用特制的注射针头，通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙，结果：术后2周供体RPE细胞层呈单层排列于受体视网膜下间隙，并存活，未见明显炎症反应，电镜观察，术后7周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘模型成镶嵌关系。结论：改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间隙，并至少存活7周，改良的内路法渴望为视网膜移植的实验室研究提供一条可供借鉴的途径。     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

一氧化氮与形觉剥夺性近视眼

一氧化氮是近年来发展的视网膜神经递质。一氧化氮合酶是合成一氧化氮的关键酶，在视网膜分布广泛。一氧化氮不仅参与了视觉信息的形成，整合和传导，具有重要的生理功能，而且在形觉剥夺实验性近视眼的发生中起重要作用。其作用机制尚不清楚，可能与一氧化氮抑制细胞增殖，调节巩膜基质中金属蛋白酶的活性，影响视网膜中其他生物活性物质的合成和释放密切相关。     

去乙酰化酶抑制与视网膜病变

组蛋白乙酰化酶（HATs）与组蛋白去乙酰化酶（HDACs）分别催化组蛋白的乙酰化与去乙酰化过程，组蛋白及特定基因的乙酰化修饰对于基因的激活或抑制发挥着调节作用，在糖尿病视网膜病变（DR）、缺血性视网膜病变、退行性视网膜病变、感染性视网膜病变、视网膜肿瘤等视网膜疾病的发生发展过程中均可发生相关基因的乙酰化水平下调，从而启动凋亡程序，导致视网膜细胞的死亡，引起视网膜功能障碍，因此，视网膜的病理生理与乙酰化修饰联系紧密。由于基因表观修饰的复杂多样性，乙酰化与去乙酰化作用在视网膜病变中所发挥的作用仍在进一步探索中。就乙酰化酶与去乙酰化酶的分类、功能及其与视网膜病变的关系及去乙酰化酶抑制对视网膜病变潜在的保护作用进行综述。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的原代培养

目的研究豚鼠近视眼视网膜Müller细胞原代培养的方法。方法用半透明眼罩遮盖法建立豚鼠的近视眼模型。采用酶消化法培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞,用倒置相差显微镜观察Müller细胞的生长状况,以GFAP、Vimentin免疫组化染色进行细胞鉴定。结果半透明眼罩遮盖豚鼠右眼2周后,遮盖眼眼轴延长,近视形成。原代培养的视网膜Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,GFAP、Vimentin免疫组化染色呈阳性。结论酶消化法是培养豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

细胞凋亡与视网膜脱离

细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的特殊死亡形式，具有典型的形态学及生化特征；细胞凋亡与细胞生长发育关系密切，同时也与疾病过程有关；细胞凋亡的发生既需要多种基因共同协调又需要多种信号传递系统。本文总结了细胞凋亡的概念形成，形态特征及生物化学、分子生物学方面的研究进展。同时阐述了细胞凋亡与视网膜发育及视网膜脱离的关系     

视网膜母细胞瘤瘤细胞对角膜上皮和实南细胞侵袭的研究

目的研究视网膜母细胞瘤瘤细胞对角膜上皮和实质细胞的侵袭能力。方法将视网膜母细胞瘤细胞株ＳＯ－Ｒｂ５０瘤细胞与角膜上皮和实质细胞共同培养，用形态学方法观察其粘附能力，以电镜组织化学方法观察这些细胞表面蛋白聚糖的变化。结果ＳＯ－Ｒｂ５０瘤细胞能粘以角膜的纤维细胞上，呈贴壁生长敏殖，但与角膜上皮不粘附。电镜组织化学方法显示角膜上皮细胞和ＳＯ－Ｒｂ５０瘤细胞表面均有抗透明质酸酶和软骨素裂解酶消化的蛋白聚糖     

大鼠视网膜神经细胞体外培养

目的 建立视网膜神经层分散细胞的培养方法，以进一步对视网膜神经元细胞(尤其是视网膜神经节细胞)和神经胶质细胞进行体外实验研究。方法 取出生后1～3d的SD乳鼠的视网膜，用胰酶消化法制备分散细胞悬液后，接种于置有包被poly-D-lysine玻片的24孔培养板中培养，倒置相差显微镜观察细胞生长规律。培养第7d，用抗神经元特异性核(NeuN)抗体和抗神经丝(Neurofilament-200，NF-200)抗体分别标记视网膜神经元细胞和神经节细胞(RGCs)，并计算每10个高倍镜下的细胞数以及RGCs所占百分数。结果 体外培养的视网膜神经元细胞经历了贴壁、重聚、迁移和相互接触的过程，有突起样生长，其中RGCs占神经元的55％左右。结论 视网膜神经层分散细胞体外培养成功，并有较好的RGCs生长率，为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。