小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。     

构建内皮型一氧化氮合酶真核表达载体及在内皮细胞的表达

背景:内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题,对于生物人工血管的研制有重要意义。目的:构建内皮型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS,以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率,评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2005-07/2007-05在南京大学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成。材料:质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠。pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博士后贾立军馈赠,pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供。大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存。方法:采用分子生物学技术,先用限制性核酸内切酶EcorⅠ酶切质粒PCMV/eNOS,电泳回收3.6kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列,克隆入质粒pcDNA3.1的EcorⅠ酶切位点,通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的XhoⅠ酶切位点筛选其插入载体的方向,构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒。以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)。主要观察指标:①观察转染后对ECV304生长的影响,在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率。②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶基因的表达,测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量。③观察施加不同因素(L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME)对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响;同时检测此时ECV304生长所受影响。结果:以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后,其转染效率为(32.6±2.6)%,反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达,与对照组有明显差别;同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别;随着培养液一氧化氮浓度升高,ECV304生长曲线下降。结论:成功构建pcDNA3.1/eNOS,在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达,Ca2 是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件,ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制。     

人肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建人肝细胞生长因子(hHGF)与肝再生增强因子(hALR)融合基因的真核表达质粒并进行鉴定,为促肝细胞再生研究奠定实验基础.方法:首先分别以重组质粒pUC18-hHGF和Puc18-hALR为模板,进行PCR扩增,获得hHGF和hALR的基因序列,然后利用重叠延伸PCR方法将获得的基因序列通过一个连接序列进行连接,构建融合基因hHGF/hALR.最后将融合基因定向插入到真核表达质粒pcDNA3.1的Nhe I和Xba I酶切住点之间,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-hHGF/hALR,并进行双酶切及测序鉴定.结果:hHGF和hALR的PCR扩增产物电泳后分别观察到2.2 kb和0.4kb的单一DNA条带,与理论值相符.重叠延伸PCR扩增后的融合基因产物电泳后观察到2.6kb的单一DNA条带,与预期值一致.重组真核表达质粒pcDNA3.1-hHGF/hALR经双酶切,电泳后观察到2.6 kb和5.4kb的两条DNA条带,与预期值相符,测序鉴定结果表明序列正确.结论:成功构建了hHGF与hALR融合基因的真核表达质粒,为促肝细胞再生研究奠定实验基础.     

Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究

本研究探讨血管细胞黏附分子（vcam-1）修饰的人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood derived strom cells，CBDSC）在造血调控中的作用。采用DNA重组技术，将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒；在BJ5183细胞中与pAdeasy—1质粒进行同源重组，产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定。结果表明：vcam-1基因与pAdTrack—CMV载体成功连接，经NotⅠ／XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带，经PCR法扩增后电泳可见1个600bp左右条带，证明pAdTrack—CMV—vcam-1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—vcam-1质粒与pAdeasy—1质粒同源重组后，产物经PACⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb、4kb左右条带，与预期结果相符。腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT—PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达。结论：构建ad—vcam-1-gfP重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高。     

构建永生化人肝细胞系人端粒酶反转录酶真核表达质粒

目的:构建人端粒酶反转录酶真核表达质粒,为人端粒酶反转录酶稳定转染细胞提供简单、快速的检测方法。方法:实验于2005-06/2006-03在解放军第三○二医院病毒研究室完成。①聚合酶链反应扩增人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白基因。②利用基因重组技术构建真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT,筛选阳性克隆进行双酶切、聚合酶链反应和序列测定。③转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶基因和绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①聚合酶链反应扩增目的基因:电泳显示人端粒酶反转录酶基因的聚合酶链反应产物在3.5kb处有特异性目的条带,绿色荧光蛋白基因的聚合酶链反应产物在750bp处显示特异性目的条带。②质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建和鉴定结果:双酶切、聚合酶链反应鉴定和测序结果与预期完全相符。③转染HepG2细胞结果:荧光显微镜下观察人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白主要分布在细胞核内。结论:①初步验证所构建的真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的正确性。两种质粒可使转染细胞同时表达人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白,通过观察绿色荧光蛋白的表达对转染效率和结果进行及时、快捷的观察。②重组真核表达质粒VR1012-GFP-hTERT和pEGFP-C1-hTERT的构建成功,为人端粒酶反转录酶转染细胞提供简洁、快速、实时的检测方法,并为建立永生化人肝细胞系奠定基础。     

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法.目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性.设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成.材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供.pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pint.AV.spaT质粒、pint.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司.方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165.将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pint.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pint,AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B转染293细胞.主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率.结果:重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒.荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%.线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B共转染293细胞,12-14 d后会出现细胞病变效应.分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带.结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒.     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。     

Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid

Delivery of plasmid DNA can be enhanced by treatment with ultrasound (US); acoustic cavitation appears to play an important role in the process. Ultrasound contrast agents (UCAs; stabilized microbubbles) nucleate acoustic cavitation, and lower the acoustic pressure threshold for inertial cavitation occurrence. Fifty micrograms of a liver-specific, high-expressing human factor IX plasmid, pBS-HCRHP-FIXIA, mixed with UCA or phosphate-buffered saline was delivered to mouse livers by intrahepatic injection, with simultaneous exposure to 1 MHz-pulsed US using various acoustic protocols. Variable pulse duration (PD) at constant treatment time, pulse repetition frequency, and an acoustic peak negative pressure amplitude of 1.8 MPa produced 2- to 13-fold enhancements in hFIX gene expression, but PD was not a strong determinant. In contrast, a dose-response relationship was demonstrated for the peak negative pressure (P-), with significant enhancement of gene transduction at P- >/= 2 MPa. Up to 63 ng/ml (approaching the therapeutic range for treating hemophilia patients) could be achieved by transducing one liver lobe at 4-MPa P-, corresponding to a 66- fold increment relative to treatment with naked DNA alone. Under the same conditions, mouse livers could also be transduced with a GFP plasmid. Histology showed transient liver damage caused by intrahepatic injection and US exposure at 4-MPa P-; however, the damage was repaired in a few days. We conclude that therapeutic US in combination with UCA has the potential to promote safe and efficient nonviral gene transfer of hFIX for the treatment of hemophilia.     

I. Poloxamer-formulated plasmid DNA-based human cytomegalovirus vaccine: evaluation of plasmid DNA biodistribution/persistence and integration

Preclinical studies were conducted in mice and rabbits to evaluate biodistribution/persistence and potential integration of plasmid DNA (pDNA) after intramuscular administration of a poloxamer-formulated pDNAbased vaccine, VCL-CT01, encoding gB, pp65, and IE1 human cytomegalovirus (hCMV) immunogens. Tissue distribution in mice vaccinated with VCL-CT01 was compared with that in mice vaccinated with a phosphate- buffered saline (PBS)-formulated control pDNA vaccine. Residual pDNA copy number (PCN), in selected tissues collected on days 3, 30, and 60 after vaccination, was measured by quantitative polymerase chain reaction. In VCL-CT01-vaccinated mice and in control pDNA-vaccinated mice, pDNA was below the limit of detection by day 60 in all tissues except the injection site. Clearance of pDNA from the injection site was slower in VCL-CT01-vaccinated mice compared with PBS-pDNA-vaccinated mice. An integration study was conducted in rabbits to determine whether pDNA integration into the genome of the vaccinated animal contributed to pDNA persistence. Residual pDNA in VCL-CT01-injected rabbit muscle collected 60 days after vaccination (geometric mean of 1085 PCN/microg total DNA) was comparable to that observed in VCL-CT01- injected mouse muscle (geometric mean of 1471 PCN/microg total DNA) collected at the same time point. pDNA integration was not detectable by column agarose gel electrophoresis despite the persistence of pDNA at the injection site 60 days after vaccination. Therefore the risk of genomic integration of hCMV pDNA formulated with poloxamer was considered negligible.     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒在软骨细胞的表达

背景:白细胞介素1受体拮抗蛋白能延缓骨性关节炎进程,通过转基因方法可以使白细胞介素1受体拮抗蛋白表达的增加。目的:观察重组人重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况。方法:双酶切法切取重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的c-DNA片段,通过T4DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上。体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白质粒经脂质体转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果与结论:获得重组人pEGFP-C1-IL-1Ra真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确。荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞基因得到表达。     

重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒在软骨细胞的表达

背景：白细胞介素1受体拮抗蛋白能延缓骨性关节炎进程,通过转基因方法可以使白细胞介素1受体拮抗蛋白表达的增加。目的：观察重组人重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况。方法：双酶切法切取重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的c-DNA片段,通过T4DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上。体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白质粒经脂质体转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果与结论：获得重组人pEGFP-C1-IL-1Ra真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确。荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞基因得到表达。     

人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达

目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

DKK1真核表达质粒的构建及表达产物鉴定

目的构建人DKK1基因的真核表达质粒,表达、纯化、鉴定其表达产物。方法自宫颈癌组织提取癌细胞,抽提mRNA,RT-PCR获得人DKK1基因片断,构建重组质粒pCMV-HA2/DKK1,EcoRⅠ酶切、测序鉴定重组质粒;借助脂质体将载体瞬时转染入Free-Style293-F细胞(无血清培养)蛋白印迹法检测DKK1蛋白。结果 RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pCMV-HA2/DKK1重组质粒构建成功;DKK1蛋白分泌表达在Free-Style293-F细胞培养液中,WesternBlot鉴定表达产物为DKK1蛋白。结论成功构建了人DKK1的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步的DKK1蛋白对肿瘤发生中的生物学活性研究奠定基础。     

人白细胞介素12重组基因抗肿瘤作用的初步研究

目的研究重组人白细胞介素12真核表达基因(pEGFP-C1_IL-12)在体内外的抗肿瘤作用。方法将pEGFP-C1_IL-12基因转染入体外培养的肝癌细胞HepG_2,MTT法检测肝癌细胞的增殖能力,半定量PCR法检测肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。进一步经动脉导入重组基因至VX_2移植性肝癌组织,观察与化疗栓塞联合应用时在体内对VX_2肝癌的生长的影响。结果在体外实验中,肝癌细胞的增殖能力及VEGF表达与对照组相比无显著性差异。在体内,基因治疗与化疗栓塞联合应用时,肿瘤生长速度明显减慢。结论重组基因pEGFP-C1_IL-12在体外并不表现出抗肿瘤作用,但在体内抗肿瘤作用明显,这种抗肿瘤作用可能并非重组基因表达产物的直接作用,可能是由间接途径介导的。