寡核苷酸芯片用于HLA-A基因分型的研究

目的 应用寡核苷酸芯片分型方法，对HLA-A基因进行分型研究。方法 采用不对称PCR方法，扩增HLA-A基因的第2，3外显子，荧光标记扩增产物，作为杂交模板。设计分型检测寡核苷酸探针，制备HLA-A基因分型检测芯片。采取差异选择法，筛选强杂交信号和高特异性的分型探针。探索了探针长度、探针位置等对杂交信号的影响。杂交结果经荧光扫描，并用分型软件分析判断阳性探针和HLA-A基因型。结果 30例临床样本芯片分型结果与PCR-SSP及DNA测序分型结果相符。结论 采用寡核苷酸芯片技术对HL-A基因分型是种好的方法，具有测速快、成本低、高通量的优点。     

DNA微阵列技术检测HLA-DRB1基因分型

目的采用DNA微阵列分型方法,对HLA-DRB1基因进行分型研究。方法设计分型检测寡核苷酸探针,制备HLA-DRB1基因分型微阵列。设计PCR引物,以1:20引物比例不对称扩增HLA-DRB1基因的第2外显子,Cy3荧光标记扩增产物,作为杂交模板。用差异选择法杂交信号强且特异性好的探针。Cy3荧光标记PCR扩增产物与微阵列探针杂交反应,结果经荧光扫描,并用分型软件分析判断阳性探针和HLA-DRB1基因型。结果10例临床血样的DNA微阵列分型结果与PCR-SSP分型结果相符,20例未知血样的DNA微阵列分型结果与DNA测序分型结果符合率为97%。结论DNA微阵列技术具有高通量、简便、低成本的优势,采用DNA微阵列分型方法,对HLA-DRB1基因进行分型研究,表明HLA-DRB1DNA微阵列分型为一种可行的基因分型新技术。     

应用寡核苷酸芯片进行HLA-DQA1位点基因分型

为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HIA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明：100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DNA与其模板相符，另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95％。结论：研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。     

寡核苷酸芯片用于HLA-B分型的初步研究

HLA基因具有复杂的多态性。本研究根据HLA-B基因序列的多态性，设计了一套寡核苷酸探针，井用基因芯片点样仪点样到醛基修饰的载玻片上，制成寡核苷酸芯片用于HLA-B基因的分型。本研究以克隆井已测序的HLA—B基因序列作为标准样品，经PCR分别扩增其具有多态性的第二和第三外显子，PCR扩增产物与芯片进行杂交，利用分析软件将杂交模式转变成为HLA—B基因型。结果表明，利用芯片进行分型的结果与标准样品序列结果完全符合。结论：寡核苷酸芯片用于HLA—B基因分型是一种简便、快捷和有前景的方法。     

DNA芯片快速检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 开发快速检测耐利福平结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因突变的DNA芯片。方法 根据结核菌rpoB基因序列设计探针并制作基因芯片，从临床样品中分离出结核菌的基因组DNA，PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段，荧光标记后与芯片上含有的检测特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交，同时与DNA直接测序法测定序列比较。结果 35株耐利福平结核菌中有91．4％(32／35)用直接测序法检测出存在rpoB基因突变，DNA芯片的检测效率为71．4％(25／35)。结论 用DNA芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和敏感性，可用于临床结核菌耐药性检测。     

丙型肝炎病毒基因分型芯片的研制和临床应用

目的　研制丙型肝炎病毒 (HCV)基因分型的寡核苷酸探针芯片 ,并用此方法对 76例HCVRNA阳性的肝炎患者进行检测。方法　根据HCV 5′ 非编码区和核心抗原区序列设计聚合酶链反应 (PCR)引物和寡核苷酸探针 ,探针经一定修饰后固定到尼龙膜上 ,即成为HCV基因芯片。采用PCR参入法标记地高辛分子 ,其中 6份标本PCR产物同时进行测序分析。结果　此芯片可分析HCV 11个基因型的 15种亚型。 76例HCV肝炎患者芯片杂交结果均阳性 ,而 2 0名健康对照血清均阴性。 76例患者阳性标本的分型结果 :1b型 6 4例 ,2a型 11例 ,3a型 1例 ,未见混合型感染。 6份标本的序列分析表明 ,芯片杂交和测序的分型结果完全一致。结论　此芯片可初步用于检测血清HCVRNA ,并对HCV基因 (亚 )型进行准确分析     

PCR-SSP基因分型技术在ABO疑难血型定型中的应用

目的 研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(PC-SSP)基因分型技术在ABO疑难血型鉴定中的应用.方法 收集8例来自广东省肇庆市无偿献血者的ABO疑难血型样本,采用正反定型实验、吸收放散试验等一系列血型血清学方法进行检测;提取基因组DNA,并用PCR-SSP基因分型技术,特异性扩增ABO基因片段,根据有无PCR产物以及产物长度,判断样本的基因型.结果 通过凝胶电泳检测PCR反应的特异性产物,判断样本1～6号ABO基因型为A/O型,样本7,8号为B/O型.8例疑难ABO基因分型结果与其血型的血清学分型结果吻合.结论 ABO疑难血型定型的解决是一个复杂的难题,而PCR-SSP基因分型是一种方便、快速、可靠的技术,对于解决ABO疑难血型鉴定非常有用.     

肽核酸芯片技术初探

目的 研究解决以DNA为探针的寡核苷酸芯片特异性、重复性差等问题。方法 用肽核酸（PNA）探针制备PNA芯片，以荧光标记的寡核苷酸（ODN）及HBV DNA的PCR产物为检测对象，探讨PNA芯片的杂交条件。用PNA芯片检测HBV DNA及单碱基突变，并与DNA芯片做一对比。结果 PNA探针对单碱基突变的识别力比相应的DNA探针更强；用其检测HBV DNA，得到了与常规PCR试剂盒一致的检测结果。结论 PNA探针独特的结构决定了它在杂交中具有与靶DNA结合的稳定性高及特异性强等优点。     

孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术的建立

本研究目的是建立孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术,用于ABO血型不合引起的新生儿溶血病的产前诊断。根据ABO血型基因DNA全序列和mRNA序列设计4对引物,选择20例健康供者血浆,提取血浆中DNA进行扩增,探索最佳的血浆DNA提取及PCR扩增条件,初步建立单人ABO血型基因分型技术。将O型血浆DNA与A型或B型血浆DNA按1：1、2：1、4：1、8：1、10：1、20：1、40：1、100：1进行混合,模拟孕妇外周血胎儿与孕妇自身ABO基因混合状态,建立混合ABO血型基因分型技术。选取14例孕30周以上的孕妇外周血标本,进行胎儿ABO血型基因型鉴定,并对孕妇进行追踪,尽量获取胎儿出生以后的外周血标本进行ABO血型鉴定,以评价孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术的灵敏度与准确性。结果表明：单人血浆进行准确血型鉴定的最少模板DNA量约为0．625ng,500μl血浆提取的DNA量即可达到PCR扩增要求;当混合血浆中O型DNA所占比例≤10时,可以准确检测出非0基因的存在;14名O型孕妇外周血标本中9例标本扩增出非O型基因,5例未扩增出非0基因;通过血清学方法对5例胎儿出生后外周血进行ABO血型鉴定,其中A型3例,B型1例,O型1例,与其基因分型结果一致,符合率100％。结论：本研究建立的孕妇外周血胎儿ABO血型基因提取、分型技术,可以对妊娠中晚期胎儿ABO血型基因型进行准确鉴定,从而为新生儿溶血病的产前诊断与预防提供指导意见。     

聚合酶链反应技术应用进展

全血不需分离细胞，将红细胞低渗溶解，直接取细胞胞溶物进行PCR基因分型，结果可靠；血管紧张素转换酶（ACE)等位基因缺失在缺血性心肌病中有重要意义，而ACE基因插入/缺失（I/D)多态性检测由Ferenc Somogy Vari提出的迅速PCR,在Light cycler仪器上采用荧光标记的寡核苷酸杂交探针能准确快速的进行基因分型;DNA模板无需变性，进行HBV DNA扩增。     

常见ABO抗原和稀有A2抗原同步基因分型的研究

目的建立人类ABO血型系统的同步基因分型法研究ABO血型。方法采用PCR-SSP技术,设计合成13对序列特异性引物,摸索最佳退火温度,通过调整引物浓度、Mg2+浓度等,使ABO系统等位基因在同一条件下进行同步扩增和扩增产物在同一凝胶中进行同步电泳;使用此方法,检测34例已知血清学ABO血型的与20例已知序列的A2亚型标本。结果用基因分型法检测出的ABO常见基因和A2基因,与已知血清学ABO分型结果相符合。结论该ABO基因分型方法适合中国人ABO基因常规鉴定与研究。     

人白细胞抗原B位点基因芯片分型技术研究

目的 探讨基因芯片技术在进行北方汉族人群人白细胞抗原B位点（HLA-B）分辨度分型的价值.方法 根据中国北方汉族人群HLA-B常见基因位点及临床分型分辨度特征,设计特异性寡核苷酸中分辨度分型探针,制成HLA-B基因分型芯片.采用荧光标记引物和不对称聚合酶链反应（PCR）扩增HLA-B 2、3外显子,产物与芯片探针杂交后经荧光扫描,并用特定软件分析判断阳性探针,以确定样品基因型.结果 用中分辨度探针从30份北方汉族人标本中可分出HLA-B 7～83范围的42个B抗原等位基因,与顺序特异引物聚合酶链反应（PCR-SSP）分型方法对比,多检出3个HLA-B14、73和82新等位基因.结论 HLA-B基因芯片具有较高的精确度和特异性,可一张芯片多人份检测,适合用于临床HLA-B抗原分型.     

ABO blood group genotyping by quenching probe method

We developed a multiplex ABO genotyping method with quenching probes (Q-probe). In this method, it is possible to discriminate the mutations, not only frequently used positions 261 and 796 but also position 703 in a single PCR. Each probe was designed to have cytosine residue at 5' or 3' end and labeled with three different fluorescence dyes, enabling the triplex detections of these polymorphisms. All polymorphisms were successfully detected by using fluorescence labeled Q-probe in a specifically amplified PCR product. Each Q-probe showed unique dissociation patterns depending on the polymorphism types. All of the results obtained with Q-probe were compared with standard serotyping and TaqMan PCR method and resulted in complete match with each other. Consequently, these results indicated that multiplex ABO genotyping method is quite accurate and convenient method for the determination of ABO genotype.     

高分辨率熔解曲线在ABO血型基因526位点单核苷酸多态性检测中的应用

目的建立高分辨率熔解(HRM)曲线检测ABO血型基因526位点单核苷酸多态性(SNP)的方法。方法随机提取35例待检血型标本的DNA,运用HRM曲线检测ABO血型基因526位点的SNP,通过PCR-DNA测序以及血型血清学试验验证HRM检测结果的准确性。结果 35例血型标本中,共检出526位点杂合子13例,纯合子22例。经测序分析和血清学试验验证13例G/C杂合中B型8例、AB型5例,22例CC纯合子中A型10例,O型12例。HRM法检测结果与测序结果及血清学结果相符。结论 HRM法是一种低成本、简便、准确的SNP检测技术,有望成为临床ABO血型基因分型的新方法。     

微流体芯片技术在ABO血型基因分型中的应用

本研究建立一种简单、可靠的ABO基因检测结果报告评估方法。利用微流体芯片检测技术代替凝胶电泳,通过对实验条件的优化,进行multiplex—PCR—RFLP的ABO基因分型结果判读,并通过对150份标本进行测试．对该检测方法的稳定性和准确性进行评估。结果显示,全部检测结果与血清学分析结果一致,并且检测出1例因肿瘤引起的B型抗原减弱病例。结论：建立的微流芯片基因检测系统稳定、可靠,实现了ABO基因分型检测结果的客观化、标准化和自动化。     

HIV检测基因芯片的研制和应用评价

目的研制用于HIV检测的基因芯片,并评价其在临床诊断和出人境检疫中的应用价值。方法针对HIV-1gags基因相对保守区域,设计检测探针,并设计内标和对照探针,制备HIV检测微阵列基因芯片;设计引物,以1：20引物比例不对称扩增HIV基因靶标,Cy3荧光标记扩增产物,作为杂交模板。Cy3荧光标记PCR扩增产物与微阵列探针杂交反应,结果经荧光扫描,并用分型软件分析判断阳性探针和样本HIV阴阳性。采用信号放大、梯度临界值技术,增加了检测的灵敏度和特异性。采用70例临床样本实样检测与DNA测序作对照,评价试剂盒的性能和应用价值。结果70例样本,采用本试剂盒与DNAN序并行检测,两者符合率为98．57％。结论本HIV检测基因芯片试剂盒具有高通量、操作简便、低成本、准确度好等优点,应用研究表明,在临床HIV诊断检测和出入境检测方面具有很高的应用价值。     

中国汉族人群检出新的B(A)641T>C等位基因

目的明确稀有ABO表现型的遗传学基础。方法对ABO血清学常规定型正反不一致的样本,采用PCR-RFLP方法作初步基因分型,对8例血清学表现为AwB,而基因分型具有O基因的个体,进行ABO基因第6和7外显子PCR产物的TA克隆及核苷酸序列测定。结果8例样本除1对为母女关系外,其余无任何亲缘关系,血清学表现相似,红细胞上含有接近正常的B抗原和少量A抗原,H抗原含量较正常B细胞显著增高,血清中存在抗-A,初定为AwB,基因分型均为BO。克隆测序表明除具有正常O1或者O1V基因外,他们的B基因第7外显子在正常B等位基因的基础上,均发生单碱基突变,4例发生nt700C>G点突变,导致Pro234Ala,2例无关个体为nt640A>G点突变,导致Met214Val,1对母女均表现nt641T>C点突变,导致Met214Thr。证实所有8例样本真正血型应为B(A)表现型,其基因型均为B(A)/O型。结论在中国汉族人群中检出3种B(A)血型,除了已在我国台湾首先被发现的B(A)700C>G和笔者以前报道的B(A)640A>G之外,新发现1种B(A)641T>C等位基因。     

Molecular identification of Yersinia enterocolitica isolated from pasteurized whole milk using DNA microarray chip hybridization

A DNA microarray chip of four virulence genes and 16S ribosomal DNA gene conserved region among all Gram negative species, including Yersinia, as a positive control was developed and evaluated using 22 Yersinia enterocolitica isolates. Eight different oligonucleotide probes (oligoprobes) with an average size of 22 bp, complementary to the unique sequences of each gene, were designed and immobilized on the surface of chemically modified slides. Multiplex PCR was used to simultaneously amplify DNA target regions of all five genes, and single stranded DNA (ssDNA) samples for microarray analysis were prepared by using a primer extension of amplicons in the presence of one primer of all genes. The presence of genes in Y. enterocolitica was established by hybridization of the fluorescently labeled ssDNA representing different samples of the microarray gene-specific oligoprobes and confirmed by PCR. Results of the study showed specificity of genotyping Y. enterocolitica using multiple microarray-based assays. Final validation of the chip's ability to identify Y. enterocolitica genes from adulterated pasteurized whole milk was confirmed and successful. The limit of chip detection of virulence genes in pasteurized whole milk was found to be 1000 CFU per hybridization.