TRAIL基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的:获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体.方法:利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPreTMH-Tb中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌DH-5α中获得表达,并将TRAIL蛋白免疫家兔,通过Dot blot及Western blot检测抗TRAIL抗体的产生.结果:成功构建TRAIL基因原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11.8%,Dot blot及Western blot检测证实获得了抗TRAIL抗体.结论:成功制备抗TRAIL抗体,这为TRAIL在真核细胞水平研究奠定了实验基础.     

表达小鼠CD1D基因的重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达小鼠CD1D基因的重组逆转录病毒载体并加以酶切鉴定。方法提取小鼠脾总RNA进行RT—PCR反应获基因，酶切真核表达载体得到目的基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，使用酶切方法加以鉴定。结果酶切所得片段与所需相符，经测序证明为所需载体。结论获得重组的逆转录病毒载体，为今后进一步的研究奠定基础。     

靶向人Pokemon基因的shRNA重组质粒的构建

目的构建靶向Pokemon基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,为研究Pokemon基因在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。方法利用基因重组技术,依据siRNA的设计原则,针对目的基因的mRNA序列筛选了3对siRNA序列以及一对阴性对照序列,将其分别插入真核表达载体psiRNA-hHlneo H1启动子下游,经α互补筛选、酶切和DNA测序鉴定,构建靶向Pokemon基因的RNAi真核表达载体。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示siRNA片断正确,与设计序列一致,且成功插入预定位点。结论靶向Pokemon基因的shRNA重组质粒成功构建,为进一步研究Pokemon基因在多种疾病中的作用以及探索肿瘤的基因治疗奠定基础。     

人NIT1基因原核表达载体的构建和鉴定

背景与目的目前已知FHIT基因为抑癌基因，其结构和功能的异常与肺癌的发生、发展有密切关系，而且可能与NIT1基因存在功能上的相关性。但是．FHIT基因与NIT1基因调控肺癌发生发展的分子机制尚未明了。本研究旨在构建人NIT1基因原核表达载体．为进一步研究人肺癌细胞株中NIT1基因和FHIT基因的关系打下基础。方法应用RT—PCR法获得NIT1基因cDNA．定向克隆到融合表达载体pET-32a中．作双酶切和测序鉴定。结果①克隆的cDNA片断包含了人NIT1基因翻译区的全部序列，翻译区序列与GenBank登录的人NIT1 cDNA序列完全一致。②对构建的原核表达载体做双酶切．获得了预期的目的条带。结论通过RT—PCR和定向克隆的方法．成功构建了人NIT1基因的原核表达载体，为研究人NIT1蛋白的表达和进一步研究人肺癌细胞中NIT1基因和抑癌基因FHIT的关系奠定了基础。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的:构建人胰腺核糖核酸酶(hpRNase)原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础.方法:针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX-HTb;在大肠杆菌B121中经IPTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性.结果:经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆入pPROEX-HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20 kD的蛋白产物,经Western blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA.结论:成功构建hpR-Nase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础.     

HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆HBV 3′末端缺失preS/S基因,构建真核表达载体,转染真核细胞,为进一步进行功能研究奠定基础.方法采用PCR方法从乙型肝炎病毒全基因组中克隆preS/S基因,构建真核表达载体pcDNA3-preS/S,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,通过脂质体转染Hela细胞系进行表达研究.结果1)克隆了3′末端缺失的preS/S基因;2)构建preS/S真核表达载体;3)转染细胞及G418筛选后得到preS/S基因稳定表达的细胞株.结论3′末端缺失的preS/S基因能够在胞内表达,此研究为基因的功能研究奠定了一定的基础.     

凋亡抑制蛋白Livin 两种异构体原核表达载体的构建及融合表达

 目的 构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体（Livinα和β）的原核细胞表达载体pET32a（＋）-livinα和pET32a（＋）-livinβ。方法 设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以Hela细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,用限制性内切酶BamHⅠ和HandⅢ双酶切取所需目的片段,并插入原核表达载体pET32a（＋）的多克隆位点,经酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体（pET32a（＋）-livinα、β）。将重组质粒转入表达菌株BL21,诱导表达收集菌液,超声碎菌,取其上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。结果 成功获得Livinα和β全长cDNA序列,并克隆到原核表达载体pET32a（＋）上;成功获得大小为55kd左右的融合蛋白。结论 Livin基因两种异构体原核表达载体的构建及其融合蛋白的制备,为进一步研究Livin异构体功能及在肿瘤细胞中的抗凋亡效应奠定了基础。此蛋白也可用于进一步抗体制备、免疫鉴定和诊断等研究。     

MBP序列特异性shRNA质粒载体的构建及鉴定

目的:以pGenesil-1质粒为介导,构建针对MBP基因的shRNA表达载体。方法:设计特异性表达MBP shRNA结构的互补DNA序列3个及1个阴性对照序列,退火并克隆至质粒载体pGenesil-1中,转化DH5α菌株,进行重组质粒的酶切鉴定及测序分析。结果:经酶切鉴定及测序分析,筛选出的重组体测序结果和靶序列相同,成功构建了shRNA重组质粒载体pGenesil-1-MBP-1、pGenesil-1-MBP-2、pGenesil-1-MBP-3及pGenesil-1-MBP-neg。结论:成功构建MBP shRNA表达载体,为进一步研究MBP基因在细胞中的作用机制奠定基础。     

人canstatin基因的克隆及其真核载体的构建

[目的]克隆人canstatin基因,构建并鉴定其真核表达载体pSecTag2/canstatin.[方法]采用RT-PCR方法从中国人胎盘脐带组织中扩增canstatin cDNA,T-A克隆到pUCm-T载体中,酶切后将人canstatin cDNA亚克隆入pSecTag2,构建真核表达载体pSecTag2/canstatin,重组质粒经限制性内切酶鉴定并进行测序分析.[结果]人canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致.[结论]pSecTag2/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达、活性鉴定和作用机制研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础.     

靶向人类WT1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 制备编码人类WT1基因的shRNA(short hairpin RNA)质粒表达载体.方法 设计合成WT1shRNA的DNA模板单链,在两端加入限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,退火形成双链,质粒pGenesil-1的BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切线性化,稀释退火片段与线性化Pgenesil-1质粒表达载体经T4DNA连接酶连接,酶切、测序鉴定.结果 经酶切、测序鉴定,pWT1shRNA构建成功.结论 成功构建了针对人类WT1基因的shRNA质粒表达载体,为探讨WT1的生物学功能及白血病的基因治疗奠定了基础.     

TNF家族的新成员TRAIL cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

目的：克隆Ｔｒａｉｌ基因ＣＤＮＡ全长,构建Ｔｒａｉｌ的原核表达载体,从而建立其原核表达体系。方法：通过抽提我周血淋巴细胞总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ克隆ＴｒａｉｌｃＤＮＡ,构建Ｔｒａｉｌ的原核表达载体,用限制性酶切和ＤＮＡ测序进行鉴定,以温度进行诱导表达,通过ＳＤＳ－ｐａｇｅ分析表达产物。结果：（１）克隆了Ｔｒａｉｌ基因ＣＤＮＡ全长,ＤＮＡ测序结果与报道的完全一致;（２）构建了Ｔｒａｉｌ基因核表达载体     

E2F3基因腺相关病毒干扰载体的构建

目的:构建针对E2F3基因的腺相关病毒干扰穿梭质粒载体,为进一步包装能够表达干扰序列的病毒奠定基础.方法:通过已经合成的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo干扰质粒载体,进行限制性内切酶Mlu酶切,将干扰片段克隆入线性质粒pAAV-MCS中,构建具有表达沉默E2F3基因的RNA干扰穿梭质粒.通过BglⅡ及Mlu单酶切,BamH1和HandⅢ双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建是否成功.结果:pAAV-siE2F3线性化后,片段大小约6 300bp;以Mlu为两边酶切位点设计的引物对重组质粒进行PCR,可获得的产物大小1700bp;应用ITR专用引物进行重组质粒的PCR后证实本研究所构建的重组质粒ITR片段存在,大小约3500bp,上述指标均与预期设计结果相符.基因测序结果表明插入序列无基因突变,序列完整.结论:穿梭质粒载体的成功构建,为进一步包装能够表达针对E2F3基因干扰序列的腺相关病毒,进一步研究E2F3基因在肿瘤中的功能奠定基础.     

肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体的构建及蛋白表达

背景与目的肺癌细胞对化疗药物的耐受是肺癌患者生存率低的重要原因之一。我们在前期研究中发现了一条肺腺癌耐药相关的基因BC006151,本研究拟构建肺腺癌耐药相关基因的原核表达载体PGEX-4T-1-BC006151,诱导其表达及鉴定目的蛋白,从而揭示该基因与肺腺癌耐药的关系。方法以RNA为模板RT-PCR扩增,产物与质粒PGEX-4T-1用BamHI和EcoRI双酶切,用T4DNA连接酶将二者连接,连接物转化DH5α菌,重组克隆菌经测序鉴定确认。将带有目的片段的重组克隆载体转化BL21表达菌,SDS-PAGE电泳检测表达产物,Western blot检测GST融合蛋白表达。结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片段,与GenBank中公布的BC006151基因序列一致。重组克隆载体经BL21表达菌表达,获得40KD的条带(其中目的蛋白13KD,GST标签26KD)。结论成功构建了肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体,并成功诱导了目的蛋白表达,GST亲和纯化,为进一步制备该基因的多克隆、单克隆抗体奠定了基础。     

野生型和突变型nm23-H1基因原核表达载体的构建、表达及纯化

背景与目的 nm23-H1基因是一个肿瘤转移抑制基因,但关于nm23-H1基因抑制肿瘤转移的生化机理目前并不清楚.该实验目的就是构建nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 通过PCR方法扩增野生型和突变型nm23-H1目的片断,利用基因重组技术构建pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,鉴定正确克隆转化BL21(DE3)溶源菌,进行蛋白表达及可溶性分析,同时采用镍柱亲和层析法进行纯化,应用Western blot方法对纯化后蛋白进行鉴定检测.结果 通过酶切和测序鉴定,pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体序列正确,编码框正确.转化溶源菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高,且均为可溶性蛋白,Western blot检测结果提示野生型和突变型nm23-H1蛋白分子量为20 kDa,与预计值相符.结论 成功构建pET28a-nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,所表达蛋白可用于下一步实验研究.     

CD1_D基因与B7-1基因真核表达载体的构建

目的构建表达小鼠CD1_D基因和B7-1基因的真核表达载体。方法用PCR方法获得基因,定向克隆连接到真核表达载体上,得到重组真核表达载体,使用酶切方法加以鉴定。结果酶切得到的片段与所需相符,得到重组的逆转录病毒载体。结论重组小鼠CD1_D基因和B7-1基因真核表达载体的构建为今后进一步的研究奠定了基础。     

人胰腺核糖核酸酶的基因克隆、蛋白表达与活性测定

目的：构建人胰腺核糖核酸酶（hpRNase）原核表达载体、获得纯化hpRNase蛋白,为构建乳腺癌单链免疫毒素奠定基础。方法：针对编码hpRNase成熟蛋白基因的cDNA序列设计相应的引物,通过反转录PCR技术,从一例胰腺切除患者的组织标本中,扩增出编码hpRNase成熟蛋白的cDNA序列,亚克隆入表达载体pPROEX—HTb;在大肠杆菌BL21中经1PTG诱导融合蛋白表达,并用镍离子交换树脂进行蛋白纯化;通过RNA水解实验验证hpRNase重组蛋白的活性。结果：经PCR、酶切、测序等方法鉴定,hpRNase cDNA正确克隆人pPROEX—HTb表达载体;IPTG可诱导载体表达分子量约20kD的蛋白产物,经Westerm blot验证可与抗hpRNase抗体发生特异性反应;经镍离子交换树脂纯化后的重组蛋白可有效降解RNA。结论：成功构建hpRNase原核表达载体,并获得有RNA降解活性的hpRNase重组蛋白,为进一步构建乳腺癌单链免疫毒素奠定了基础。     

抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体的构建

目的 在哺乳动物细胞中构建并鉴定抑制CDC25A表达的siRNA真核表达载体.方法 根据CDC25A的基因序列,设计特异性的siRNA,将合成的siRNA 核酸片段退火形成双链后连接到经Bam HI和HindⅢ双酶切后的psilencer4.1真核表达载体,命名为psilencer4.1-CDC25A以及psilencer4.1-Control,并进行酶切及测序鉴定.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功地构建出抑制CDC25A表达的siRNA载体及其阴性对照载体.结论 成功构建和验证了siRNA真核表达载体,为下一步研究奠定了良好的基础.     

原核表达重组质粒pUC57－CTP－PTEN的构建及鉴定

目的：合成基因CTP及PTEN基因,构建其原核表达重组质粒pUC57－CTP－PTEN,为后续研究其功能做准备。方法：合成基因CTP－PTEN,将该基因定向克隆到原核表达载体pUC57中,构建pUC57－CTP－PTEN重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒进行双酶切、测序鉴定后,用Western blotting检验表达。结果：测序鉴定CTP－PTEN基因合成成功。经双酶切、测序鉴定证实重组质粒pUC57－CTP－PTEN 成功转入DH5α,Western blotting检验pUC57－CTP－PTEN成功表达。结论：成功构建了重组质粒pUC57－CTP－PTEN,并在大肠杆菌DH5α中成功表达。     

重组人canstatin真核载体的构建及鉴定

目的 构荧光蛋白和canstatin融合蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N1／canstatin，以深化研究血管生成抑制剂canstatin的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性。方法 提取人胚肝总RNA，RT—PCR扩增canstatin基因片断，T—A克隆到pGEM—T中，从pGEM—T／canstatin克隆载体中，将人canstatin cDNA亚克隆入真核表达载体pEGFP-N1，构建含人canstatin cDNA的重组质粒pEGFP-N1／canstatin，通过酶切鉴定出重组体并测序分析。结果 成功构建pEGFP—N1／canstatin真核表达载体，双酶切及测序鉴定显示canstatin基因片断正确插入载体，与Genebank中报道的序列一致。结论 pEGFP—N1／canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达和活性研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础。     

pDC316-HGFK1病毒穿梭载体的构建及鉴定

[目的]构建携带人HGFK1基因的病毒穿梭载体pDC316-HGFK1.[方法]通过RT-PCR方法从人新鲜胎盘组织中扩增出HGFK1基因,构建pDC316-HGFK1病毒穿梭载体,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定.[结果]酶切、PCR及测序证实pDC316-HGFK1载体序列正确.[结论]成功构建pDC316-HGFK1病毒穿梭载体,可为后续病毒包装及对肝癌细胞的生物学影响研究奠定基础.