吡那地尔对人肺动脉平滑肌细胞KATP通道蛋白及ERK1/2磷酸化的影响

目的 探讨ATP敏感性钾(KA口)通道开放剂吡那地尔(Pin)对内皮素1(ET-1)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)KATe通道蛋白表达及细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)磷酸化的影响.方法 体外培养人PASMCs,用ET-1诱导其增殖,应用Westem blot方法评价Pin对ET-1诱导的人PASMCs KArP通道蛋白磺酰脲受体亚单位(SUR2B)和内向整流性孔区亚单位(Kir6.1)表达的影响以及ERK1/2的磷酸化作用.结果 ET-1显著下调SUR2B的表达,Pin呈浓度依赖性上调SUR2B表达;KATP通道拮抗剂格列本脲阻断Pin的作用,而Kir6.1的表达不受影响.ET-1呈时间依赖性促进人PASMCs ERK1/2磷酸化,10min时最明显,Pin(10μmol/L)拮抗ET-1对ERK1/2磷酸化的影响,格列本脲逆转Pin的作用.结论 KATP通道开放剂Pin通过上调KATP通道蛋白的表达,抑制ET-1诱导的人PASMCs ERK1/2的磷酸化.     

高浓度的staurosporine aglycone激活大鼠肺动脉平滑肌细胞中的ERK1/2

目的有报道表明staurosporine作为一种蛋白激酶C(PKC)的抑制剂,可以在多种细胞系内调节细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的活性,但是它的衍生物staurosporine agly-cone(SA)是否具有相同的作用还不清楚,本次实验旨在阐明其对ERK1/2活性的调节作用。方法培养至4~8代的大鼠肺动脉平滑肌细胞,经过SA处理后提取细胞蛋白,应用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的含量,观察不同浓度和时间点的SA对ERK1/2活性的影响。结果在纳摩尔浓度水平的SA可以降低大鼠肺动脉平滑肌细胞中ERK1/2的磷酸化水平,但是30μmol.L-1的SA可以激活ERK1/2,这种激活作用可以被丝裂素活化蛋白激酶的激酶(MEK)的抑制剂PD98059或蛋白激酶A(PKA)的激活剂异丙肾上腺素(isoproterenol)所抑制。结论SA对肺动脉平滑肌细胞中的ERK1/2活性有双向调节作用,这种作用是通过PKC和(或)PKA通路产生的。     

ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用

目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。     

PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导影响的研究

目的探讨MEK1抑制剂PD98059对HL60细胞Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导以及细胞增殖的影响。方法四唑盐比色试验(MTT)法检测PD98059对HL60细胞增殖的抑制作用,流式细胞术观察PD98059对HL60细胞凋亡和G0/G1期阻滞的影响,半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定PD98059对HL60细胞ERK2、p27、Skp2基因表达的影响,免疫组织化学SP法检测ERK2、p27、Skp2蛋白表达的改变情况。结果 PD98059能够抑制HL60细胞的生长,该抑制作用具有浓度及时间依赖性(P<0.05)。PD98059能够促进HL60细胞凋亡,该作用具有浓度及时间依赖性(P<0.05);PD98059作用HL60细胞48h,随着浓度的增加G0/G1期阻滞增强(P<0.05)。PD98059可使HL60细胞ERK2、Skp2的mRNA及蛋白表达量减少,p27的mR-NA及蛋白表达量增加(P<0.05)。结论 PD98059能够抑制HL60细胞的生长,诱导细胞发生G0/G1期阻滞,促进其凋亡,这可能是通过PD98059阻断Ras-MEK1/2-ERK1/2信号转导,影响了ERK2、Skp2、p27等的表达而实现的。     

间尼索地平对5-羟色胺诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的探讨间尼索地平(m-Nis)对5-羟色胺(5-HT)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖和迁移的影响,并深入研究其作用机制。方法采用植块法培养大鼠PASMCs。实验分为6组:空白对照组、5-HT(1μmol·L-1)组,m-Nis(10-5、10-6、10-7、10-8mol.L-1)组。噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell迁移小室法分别测定PASMCs的增殖和迁移,Western blot法检测大鼠PASMCs中增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达及细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)的磷酸化水平,研究m-Nis对ERK1/2/MAPK信号通路的影响。结果不同浓度m-Nis明显抑制了5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖(P<0.05或P<0.01)和迁移(P<0.01),并呈现一定的浓度依赖性;另外,Western blot结果显示m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs中PCNA的蛋白表达有不同程度的抑制作用(P<0.05或P<0.01),10-5,10-6,10-7mol.L-1m-Nis还明显抑制了5-HT诱导的大鼠PASMCs中ERK1/2磷酸化水平的升高,p-ERK1/2/ERK1/2比值均有不同程度地降低(P<0.05或P<0.01)。结论m-Nis对5-HT诱导的大鼠PASMCs增殖和迁移有明显的抑制作用,可能与其抑制PCNA蛋白表达及ERK1/2/MAPK信号通路有关。     

M-CSF促进RAW 264.7细胞MMP-9的分泌及其可能机制

目的探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)致动脉粥样硬化的作用是否与其影响基质金属蛋白酶(MMP)表达和活性改变有关及其可能机制。方法应用明胶酶图分析方法观察MCSF和(或)PD98059对体外培养的RAW264.7细胞MMP9活性的影响;Westerblot检测MCSF和(或)PD98059对体外培养的RAW264.7细胞pERK1/2表达的影响。结果MCSF能增强RAW264.7细胞MMP9的活性,并呈一定的剂量依赖性;同时MCSF也呈时间、浓度依赖性促进pERK1/2的表达;PD98059不仅阻断了ERK1/2的磷酸化,而且也降低了MMP9的活性。结论MCSF可诱导RAW264.7细胞MMP9的活性增加,其机制可能与MCSF激活MAPKERK1/2通路有关。     

抑制MEK对内质网应激诱导乳腺癌细胞凋亡的增敏作用

目的探讨抑制MEK/ERK信号通路对人乳腺癌细胞内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激途径细胞凋亡的影响,以期为乳腺癌化疗提供新的靶点。方法不同浓度(0、1.5、3、6、9、12μmol.L-1)衣霉素(tunicamycin,TM)处理乳腺癌细胞SK-BR-3,48h后溴化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测细胞凋亡率;TM(3μmol.L-1)处理SK-BR-3细胞不同时间(0、6、12、24、36h),Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)、ERK1/2、pERK1/2的表达;MEK抑制剂U0126(20μmol.L-1)预处理1h后再给予TM(3μmol.L-1)同上处理,检测上述指标,比较U0126作用前后上述指标的变化。结果SK-BR-3细胞对TM诱导的细胞凋亡率<20%,且TM上调GRP78的表达;TM没有诱导ERK1/2的进一步激活;U0126明显增加TM诱导的细胞凋亡率(78%),同时下调GRP78的表达和阻断TM对GRP78的上调作用。结论MEK/ERK信号通路的抑制增强人乳腺癌细胞SK-BR-3对ER应激途径细胞凋亡的敏感性,抑制非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的诱导。     

牛磺酸对肺动脉平滑肌中活性氧及ERK1/2通路的影响

目的：探讨牛磺酸（Taurine,Tau）对缺氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）中活性氧（ROS）及ERK1/2通路的影响。方法：原代培养大鼠PASMCs,选用第2-5代用于实验。Tau给药浓度80 mmol·L-1,作用时间24 h。实验分组为：1、常氧组2、常氧＋Tau组3、缺氧组4、缺氧＋Tau组。DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量,Westernblot检测磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达。结果：与常氧组比较,常氧＋Tau组中ROS含量没有显著性变化;缺氧组中ROS显著上升,Tau可逆转缺氧诱导的ROS上升。Tau可以逆转缺氧诱导的ERK1/2磷酸化。结论：Tau可维持正常的PASMCs中ROS水平,并且抑制缺氧诱导的ERK1/2磷酸化。     

抵抗素通过ERK 1/2信号途径诱导人血管平滑肌细胞增殖

抵抗素与动脉粥样硬化具有相关性。血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化形成的关键步骤。血管平滑肌表达抵抗素。研究旨在评估抵抗素是否诱导血管平滑肌增殖以及其具体机制。人血管平滑肌细胞以不同浓度抵抗素干预。3H-掺入法检测提示抵抗素呈剂量依赖性诱导细胞增殖。为获得更多抵抗素作用机制我们研究了细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号途径。抵抗素作用后人血管平滑肌细胞出现ERK 1/2磷酸化。ERK磷酸化特异抑制剂U0126显著抑制抵抗素诱导的人血管平滑肌细胞ERK 1/2磷酸化以及细胞增殖。研究结果表明抵抗素通过ERK 1/2信号途径诱导人血管平滑肌细胞增殖。这可能是抵抗素导致动脉粥样硬化的机制之一。     

15-HETE对肺动脉平滑肌细胞钙离子浓度的影响

目的　通过阻断细胞外钙离子 (Ca2+ )内流,观察 15 羟化二十烷四烯酸 ( 15 HETE)对兔肺动脉环收缩张力和肺动脉平滑肌细胞内游离钙浓度 ( [Ca2+ ]i)的影响,探讨缺氧时 15 HETE引起细胞钙动员的机制。方法　采用组织浴槽血管环方法观察L 型钙通道阻断剂硝苯地平和无钙液对15 HETE诱导的兔肺动脉环收缩力的影响;酶法分离培养兔肺动脉平滑肌细胞,激光扫描共聚焦显微镜测定 15 HETE对细胞内 [Ca2+ ]i的作用。结果　在正常组和缺氧组, 10μmol·L-1硝苯地平和无钙液对 1μmol·L-1 15 HETE引起的肺动脉环收缩均没有影响;培养的 15 HETE组细胞 (正常培养的细胞暴露于 1 μmol·L-1 15 HETE下继续孵育 8min)与正常对照组相比,细胞内 [Ca2+ ]i明显增加 (P<0 05)。结论　15 HETE可引起肺动脉平滑肌细胞 [Ca2+ ]i增加,且此钙来源于细胞内贮钙库的释放。     

Role of ERK1/2 signaling pathways in 4-aminopyridine-induced rat pulmonary vasoconstriction

The aim of the present study was to investigate the contribution of extracellular signal regulated kinase-1/2 (ERK1/2) to pulmonary artery contraction in response to 4-aminopyridione (4-AP), an inhibitor of a voltage-gated K(+) channels that regulate pulmonary vascular tone. Pulmonary artery rings 1-1.5 mm in diameter from male adult Wistar rat were isolated and cut into 3-mm in length. ERK1/2 up-stream kinase (MEK) inhibitors 2'-amino-3'-methoxyflavone (PD98059) and 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio)-butadiene (U0126), which block the activation of ERK1/2, were used to test the role of ERK1/2 in 4-AP induced pulmonary arterial vasoconstriction and the influences of 4-AP on expressions of phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) in cultured rat pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) and whole tissues. Our results show that 4-AP elicited concentration-dependent increases in tension of rat pulmonary artery rings, effects that were reduced by pretreatment of the rings with ERK inhibitors, PD98059 (20 microM) and U0126 (10 microM). Moreover, 4-AP increased the expressions of p-ERK1/2 in cultured PASMCs s and whole tissues, which were prevented by pretreatment of the cells or tissues with U0126. These results indicate that ERK1/2 signaling pathway contributes to pulmonary vasoconstriction induced by 4-AP.     

度洛西汀对大鼠胸主动脉环舒张功能的影响

目的研究度洛西汀(DLX)对血管舒张功能的影响并探讨其作用机制。方法采用离体血管环灌流装置,观察DLX对大鼠胸主动脉环的作用及不同工具药的影响。结果 DLX对KCl(30 mmol.L-1)和NE(1μmol.L-1)预收缩的血管环具有浓度依赖的舒张作用,对内皮完整和去内皮血管环舒张作用无差异,该舒张作用为非内皮依赖性。在KCl预收缩基础上,加入钾通道阻断剂格列苯脲Gli(10μmol.L-1)、四乙胺TEA(10 mmol.L-1)、氯化钡BaCl2(1 mmol.L-1)、四氨基吡啶4-AP(1 mmol.L-1)和5-HT2受体阻断剂赛庚啶(1μmol.L-1)均不能抑制DLX的舒血管效应;α1受体阻断剂哌唑嗪(1μmol.L-1)组对DLX舒血管作用有抑制作用。在无钙液中,DLX可以明显抑制NE和CaCl2收缩血管的作用。结论 DLX能够浓度依赖性的舒张血管,其机制可能与抑制经由血管平滑肌细胞膜VDC和ROC通道的钙离子内流,拮抗α1受体以及抑制胞质内钙离子释放有关。     

15-羟廿碳四烯酸对缺氧性大鼠颈内动脉环的收缩作用及机制

目的研究15-羟廿碳四烯酸(15-HETE)对正常及缺氧状态的离体大鼠颈内动脉环的作用,探讨15-HETE在缺血/缺氧性脑损伤的病理生理过程中的作用。方法16只W istar大鼠随机分为两组即对照组:其氧浓度(F iO2)为21%和缺氧组:置于F iO2为10%的缺氧箱中(n=8)。9 d后将大鼠处死,游离颈内动脉(ICA)制备血管环,KH液中分别加入不同浓度15-HETE以及2 mmol.L-14-AP、10-2mol.L-1TEA、10-6mol.L-1GLYB后平衡15 min后,再加入15-HETE,观察不同浓度15-HETE、不同K+通道阻断剂对颈内动脉环收缩反应程度的变化。结果15-HETE以浓度依赖方式(10-8mol.L-1~10-6mol.L-1)使游离颈内动脉环张力增加,对缺氧组大鼠颈内动脉环张力作用更为明显,与正常对照组相比差异有显著性(15-HETE浓度为10-8mol.L-1、10-7mol.L-1时,P<0.05,10-6mol.L-1时,P<0.01,n=8);2 mmol.L-14-AP使颈内动脉环血管张力增高(P<0.05,n=8),但预先应用2 mmol.L-14-AP后浴液中加入10-6mol.L-115-HETE,血管张力无进一步增加的趋势;10-2mol.L-1TEA、10-6mol.L-1GLYB,对血管环张力差异无显著性(P>0.05,n=8);但进一步应用15-HETE使血管环张力增加,变化幅度接近单纯应用15-HETE组。结论15-HETE收缩ICA,缺氧情况下尤为明显;Kv通道在15-HETE所致的ICA收缩中起作用。     

钾通道抑制剂减弱吉非罗齐对离体大鼠胸主动脉环的舒张作用

目的观察吉非罗齐对大鼠离体胸主动脉肌源性反应的影响,并探讨其作用机制。方法采用离体血管张力方法观察吉非罗齐对SD大鼠胸主动脉环静息张力及苯肾上腺素(PE)预收缩的影响;观察一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂、环氧合酶抑制剂和K+通道阻断剂对吉非罗齐作用的影响。结果吉非罗齐(1×10-5～3×10-4mol.L-1)对大鼠胸主动脉静息张力无影响,但对PE(10-6mol.L-1)所致的预收缩具有浓度依赖性舒张作用,其最大舒张率为最大舒张的80.42%±6.35%。电压依赖性钾通道(KV)阻断剂四氨基吡啶(4-AP,10-3mol.L-1)、钙激活钾通道(KCa)阻断剂四乙胺(TEA,10-2mol.L-1)、内向整流钾通道(KIR)阻断剂氯化钡(BaCl2,10-3mol.L-1)和ATP敏感钾通道(KATP)阻断剂格列苯脲(Gli,10-5mol.L-1)均可减弱吉非罗齐的血管舒张作用(P<0.05),而一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME(10-4mol.L-1)及环氧酶抑制剂吲哚美辛(10-5mol.L-1)对吉非罗齐的舒张作用无影响(P>0.05)。结论吉非罗齐对大鼠主动脉具有舒张作用,该舒张作用与NO及前列环素无关;可能与开放KV、KCa、KIR和KATP通道有关。     

The extracellular regulated kinases (ERK) 1/2 mediate cannabinoid-induced inhibition of gap junctional communication in endothelial cells

1. Cannabinoids are potent inhibitors of endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF)-mediated relaxations. We set out to study the mechanism underlying this effect and the possible role of cannabinoid-induced changes in intercellular gap junction communication. 2. In cultured endothelial cells, Delta(9)-tetrahydrocannabinol (Delta(9)-THC) and the cannabinoid receptor agonist HU210, increased the phosphorylation of extracellular regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and inhibited gap junctional communication, as determined by Lucifer Yellow dye transfer and electrical capacity measurements. 3. Delta(9)-THC elicited a pronounced increase in the phosphorylation of connexin 43, which was sensitive to PD98059 and U0126, two inhibitors of ERK1/2 activation. Inhibition of ERK1/2 also prevented the Delta(9)-THC-induced inhibition of gap junctional communication. 4. Delta(9)-THC prevented both the bradykinin-induced hyperpolarization and the nitric oxide and prostacyclin-independent relaxation of pre-contracted rings of porcine coronary artery. These effects were prevented by PD98059 as well as U0126. 5. In the absence of Delta(9)-THC, neither PD98059 nor U0126 affected the NO-mediated relaxation of coronary artery rings but both substances induced a leftward shift in the concentration - relaxation curve to bradykinin when diclofenac and N(omega)nitro-L-arginine were present. Moreover, PD98059 and U0126 prolonged the bradykinin-induced hyperpolarization of porcine coronary arteries, without affecting the magnitude of the response. 6. These results indicate that the cannabinoid-induced activation of ERK1/2, which leads to the phosphorylation of connexin 43 and inhibition of gap junctional communication, may partially account for the Delta(9)-THC-induced inhibition of EDHF-mediated relaxation. Moreover, the activation of ERK1/2 by endothelial cell agonists such as bradykinin, appears to exert a negative feedback inhibition on EDHF-mediated responses.     

PKC和血管内皮细胞在15-HETE收缩肺动脉中的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)信号转导途经及血管内皮完整性在15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)收缩肺动脉中的作用。方法采用组织浴槽血管环法与PKC、PKA抑制剂以及除去血管内皮细胞相结合的方法。结果用6·8mmol·L-1hypericin阻断PKC途径可使15-HETE收缩缺氧大鼠肺动脉量效曲线右移(P<0·01);用0·112mmol·L-1KT5720阻断PKA途径使15-HETE收缩缺氧大鼠肺动脉量效曲线右移不明显;除去血管内皮细胞可降低对照组和缺氧组肺动脉血管环对15-HETE的反应性。结论15-HETE收缩肺动脉的作用和PKC信号转导系统以及血管内皮细胞的完整性有关。     

肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌细胞内钙的改变

目的分析肺动脉高压时肺动脉平滑肌细胞Ryanod-ine受体[Ca2+]i释放功能的改变。方法腹腔注射野百合碱建立大鼠肺动脉高压模型,原代培养肺动脉平滑肌细胞,Fura-2/AM负载培养细胞,荧光测钙技术测量Ryanodine受体激动剂对[Ca2+]i变化的影响。结果10nmol.L-1Ry-anodine使对照组[Ca2+]i平均增加(93.31±12.41)nmol.L-1,使PAH组[Ca2+]i平均增加(141.71±13.59)nmol.L-1。两组样本[Ca2+]i增加的数值差异有显著性(P<0.01);10mmol.L-1Caffine使对照组[Ca2+]i平均增加(149.02±13.02)nmol.L-1,使PAH大鼠PASMC的[Ca2+]i平均增加(191.2±21.26)nmol.L-1,两组样本[Ca2+]i数值的变化差异有显著性(P<0.01)。结论肺动脉高压大鼠原代培养的肺动脉平滑肌细胞对Ryanodine受体激动剂的敏感性增强,提示肺动脉高压时Ryanodine受体释放[Ca2+]i的功能发生了异常改变。     

内源性一氧化碳调节肺动脉平滑肌细胞增殖的信号转导

目的　探讨内源性一氧化碳 (CO)抑制肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖的细胞内信号转导机制。方法　培养的大鼠PASMC低氧 2 4h ,采用3 H 胸腺嘧啶 (3 H TdR)参入法检测DNA合成率 ;Western Blot检测细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白表达。结果　低氧使PASMC的3 H TdR参入增加 137 2 8% (P <0 0 1) ;血红素氧合酶 (HO)诱导剂氯化血红素 (Hemin)以浓度依赖的方式抑制低氧PASMC的3 H TdR参入 ,分别降低 19 14 %、2 9 94 %、4 3 97% (P均 <0 0 1) ;HO抑制剂锌原卟啉 (ZnPP)促使低氧PASMC的3 H TdR参入增加 37 89% (P <0 0 1) ;MEK1抑制剂PD980 5 9降低了低氧和低氧 +ZnPP组PASMC的 3 H TdR参入34 88%和 2 3 94 % (P均 <0 0 1)。低氧使PASMC的ERK蛋白表达增加 4 0 9% ;Hemin以浓度依赖的方式抑制低氧PASMC的ERK表达 ,分别降低 33 99%、4 5 97%、6 6 0 1%(P均 <0 0 1) ;ZnPP促使低氧PASMC的ERK表达增加5 7 76 % ,(P <0 0 1) ,PD980 5 9降低了低氧和低氧 +ZnPP组PASMC的ERK表达 34 88%和 2 4 78% (P均 <0 0 1)。结论　内源性CO抑制低氧PASMC增殖的作用可能通过MAPK来介导