骨肉瘤细胞与成纤维细胞共培养刺激基质金属蛋白酶-2的产生和激活

目的：了解骨肉瘤细胞表达的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（CD147）是否能刺激临近间质细胞产生和激活细胞外基质金属蛋白酶（MMP）。方法：骨肉瘤细胞MG63和人成纤维细胞（hFb）以及抗CD147抗体共培养，用凝胶电泳和Western blot的方法检测细胞培养液和细胞膜提取物。结果：首次证实骨肉瘤细胞表达CD147，并刺激成纤维细胞产生MMP-2的激活因子MT1-MMP、MT2-MMP、前体MMP-2（ProMMP-2）和激活ProMMP-2。结论：骨肉瘤细胞高表达CD147，并刺激成纤维细胞产生和激活MMP-2。     

人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞的生物学特性研究

目的 获得人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞,了解其生物学特性.方法 采用本室建立的人永生化成骨细胞(hFOB1.19)恶性转化细胞株(转化细胞),用抗黏附培养法,模拟脱离基质情况,获得抗失巢凋亡细胞.电子显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪观察悬浮培养后不同时相点细胞的形态学改变和凋亡率.MTT法、Transwell小室分别检测细胞增殖情况和细胞的迁移能力.结果 形态学观察可见到典型的凋亡细胞,流式细胞仪检测细胞悬浮后24、48、72 h的凋亡(PI染色)情况,凋亡率逐渐升高.抗失巢凋亡细胞再次悬浮同时相凋亡率与转化株相比下降;抗失巢凋亡细胞较对照组(转化细胞)的细胞增殖能力增强,迁移能力增强,转化细胞差异有统计学意义(P＜0.05).结论 经过14 d的悬浮培养处理后,获得的人骨肉瘤抗失巢凋亡细胞小仅抗失巢凋亡能力有所增强,增殖能力和迁移能力也有增强.     

Stathmin基因反义核酸对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用

目的　探讨 Stathmin基因的反义核酸 (AS- ODN)对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用 ,并观察与化疗药物合用后的协同作用 .方法　以高表达 Stathm in的人成骨肉瘤细胞系 SOSP- 96 0 7为靶细胞、反义 Stathmin(AS- ODN)为阻断剂 ,通过 MTT试验观察 AS- ODN对成骨肉瘤细胞的生长抑制作用及与紫杉醇 (PTX)的协同作用 ,流式细胞仪分析细胞增殖周期的影响 .结果　 AS- ODN及 AS- ODN与 PTX联合应用均明显抑制成骨肉瘤细胞的生长 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) .SOSP- 96 0 7在 AS- ODN作用下 ,细胞分裂阻滞在分裂期的中期 ,并诱导细胞发生凋亡 .结论　 Stathmin基因的反义核酸(AS- ODN)对成骨肉瘤细胞的生长可能起十分重要的作用 ,它有望成为成骨肉瘤治疗的新靶点 ,与抗癌药联合应用有协同作用     

siRNA对骨肉瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖的抑制作用

目的: 研究siRNA对人骨肉瘤U20S细胞MDM2基因表达及肿瘤细胞增殖的抑制作用。 方法: 构建可表达针对MDM2的siRNA质粒(PGCsilencer^TM-MDM2-siRNA)。转染siRNA MDM2(简称siMDM2),阴性对照质粒到U20S,并设只加转染试剂作空白对照组,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting法检测siMDM2对MDM2基因和蛋白表达的抑制作用,并用MTT法检测siMDM2对细胞增殖的抑制作用。 结果: RT-PCR结果显示,转染siMDM2-1和 -2组MDM2的mRNA表达量分别下调到空白对照组的32.61%和39.06%;Western blotting结果显示,转染siMDM2-1和 -2组蛋白表达量下调到空白对照组的35.76%和42.20%;转染阴性对照质粒的MDM2基因和蛋白与转染试剂组比较差异均无显著性(P>0.05)。MTT结果显示,转染siMDM2后细胞生长受到明显抑制,与转染试剂组比较差异具有显著性(P<0.05),阴性对照组抑制率与转染试剂组比较差异无显著性(P>0.05)。结论：siRNA可以有效地抑制U20S细胞中MDM2的表达,并抑制细胞增殖。     

稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定

目的建立稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤细胞株(U-2 OS),为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用提供体外实验模型建立与鉴定的方法。方法利用分子生物学基因克隆技术将人类野生型p53基因cDNA片段插入到表达载体pIRES-EGFP中,得到重组质粒pIRES-EGFP-p53,并通过PCR、酶切电泳等方法进行质粒鉴定;然后用该重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增后,将提取的质粒DNA用脂质体介导的转染方法导入U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系。结果成功地构建出包含有野生型p53 cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-p53,通过PCR、酶切电泳等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计;并将该重组质粒成功导入人骨肉瘤细胞株U-2 OS细胞中,经荧光显微镜下人工筛选得到稳定转染的骨肉瘤细胞系,命名为U-2-p53 OS。转染后的骨肉瘤细胞出现散在的凋亡现象。结论利用基因转染技术,建立了稳定表达外源性野生型p53基因的人骨肉瘤U-2-p53 OS细胞系,为进一步研究野生型p53基因在骨肉瘤自杀基因治疗中的协同作用奠定了基础。     

稳定表达糖皮质激素受体β的人骨肉瘤细胞系的建立

目的:建立稳定表达糖皮质激素受体β的细胞系.方法:构建糖皮质激素受体β的真核表达载体,用Lipotransfectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS-8603,经G418筛选后得到稳定转染细胞株;用极限稀释法获取亚克隆细胞株;用定量RT-PCR方法鉴定糖皮质激素受体β mRNA的表达.结果与结论: 建立了稳定表达糖皮质激素受体β的细胞株,为进一步研究糖皮质激素受体β的生物学意义打下了基础.     

血管内皮生长因子在内皮细胞的稳定表达促进一氧化氮分泌

目的：建立稳定表达血管内皮生长因子的人脐静脉内皮细胞系，研究转染后对内皮细胞生长和一氧化氮分泌的影响。方法：将真核表达载体PCD2－VEGF121，用阳离脂质介导，转染人脐静内皮细胞系细胞，分别用RT－PCR、免疫组化，Miles实验检测血管内皮生长因子的转录，蛋白质的表达及其生长物学活性，检测转染后内皮细胞生长状况和培养基中一氧化氮水平，结果：RT－PCR检测出了转录血内皮生长因子的稳定转染细胞克隆，该单克隆细胞的免疫组化检测血管内皮生长因子蛋白质表达结果呈阳性，Miles实验表明其表达产物具有生物学活性，而作为对照的转空白质粒细胞和未转染细胞上述实验结果皆为阴性；转染后内皮细胞生长明显加快，一氧化氮水平在48h和72h时明显增高，结论：成功建立了稳定表达血管内皮生长因子的内皮细胞系，血管内皮生长因子转染可促进内皮细胞生长和一氧化氮分泌。     

顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞株作用的分子机制

目的探讨顺铂与卡铂对骨肉瘤细胞(MG-63)作用的分子机制。方法骨肉瘤细胞混悬液与不同浓度顺铂和卡铂分别作用24、48、72 h后,用倒置显微镜观察细胞生长情况。用噻唑蓝法测定每孔的吸光度值,制作生长曲线,并求出顺铂和卡铂的半抑制浓度(IC_(50))。用IC_(50)顺铂、卡铂作用于骨肉瘤细胞24、48、72 h后用流式细胞仪进行细胞周期分析。免疫印迹技术观察细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Bax的表达。结果相同浓度顺铂和卡铂作用的骨肉瘤细胞死亡数量随时间增加而增加。不同浓度顺铂和卡铂对骨肉瘤细胞分别作用24、48、72 h后,对细胞的生长均起到抑制作用,相同时间内,药物浓度越高,生长抑制作用越明显(P<0.05)。骨肉瘤细胞与IC_(50)顺铂和卡铂作用24、48、72 h后,在细胞各期均未见明显凋亡峰,但随着时间增加,G_1、S、G_2期所占比例逐渐下降;顺铂和卡铂作用后不同时间点凋亡细胞所占比例比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,顺铂组和卡铂组PCNA表达下降,Bax表达增加,Bcl-2表达略减少。结论顺铂和卡铂对肿瘤细胞生长各期均有抑制作用,对于骨肉瘤细胞来说,卡铂的浓度约需25倍于顺铂才能产生相似的生长抑制效应。顺铂、卡铂与骨肉瘤细胞作用后存在凋亡现象,但是未能形成凋亡峰,这可能与铂类化合物能够对处于任何生长周期的细胞均能产生杀伤作用有关。     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。     

益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞分泌细胞外基质的调节作用

①目的观察自拟中药复方益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）分泌细胞外基质的抑制作用。②方法将1×10^-3、1×10^-2和1×10^-1mg/mL益肾蠲湿合剂的提取液作用于含10%血清DMEM培养的GMC,分别于24、48和72h后收集培养上清,采用Elisa法检测上清中透明质酸（hyaluronic acid,HA）、纤维连结蛋白（FN）及Ⅳ型胶原（ColⅣ）含量。③结果 10%血清促进了GMC分泌HA、FN和ColIV,但这种作用可明显被不同浓度的益肾蠲湿合剂所抑制,并且其抑制程度随药物浓度的增加而增加。④结论益肾蠲湿合剂可以抑制体外培养的GMC分泌HA、FN和ColIV,推测这种作用是其治疗慢性肾小球疾病的主要机制之一。     

MMP-2,MMP-9,TIMP-1和TIMP-2在肝癌中原位表达

目的 :探讨肝癌中基质金属蛋白酶MMP 2 ,MMP 9和组织金属蛋白酶抑制剂TIMP 1 ,TIMP 2的mRNA和蛋白质表达与临床病理特征和预后的关系。方法 :在 5 6例有完整随访资料的原发性肝癌标本中原位杂交检测MMP 2mRNA ,TIMP 2mRNA ;免疫组化检测MMP 2 ,MMP 9,TIMP 1 ,TIMP 2蛋白质的表达。结果 :MMP 2mRNA ,TIMP 2mRNA ,MMP 2 ,MMP 9,TIMP 1和TIMP 2蛋白质在肝癌中的阳性表达分别为 4 8(85 .7% )例 ,35 (6 2 .5 % )例 ,4 4 (78.6 % )例 ,4 1 (73.2 % )例 ,30 (5 3.6 % )例 ,38(6 8% )例。MMP 2mRNA ,MMP 2 ,MMP 9在肝癌中呈高表达 ,而TIMP 1蛋白呈低表达 (P <0 .0 1 ,P <0 .0 5 )。TIMP 2mRNA与TIMP 2蛋白 ;MMP 2mRNA与MMP 2蛋白在肝癌中的表达呈正相关 (分别为r=0 .31 6 ,P <0 .0 5 ;r=0 .35 6 ,P <0 .0 5 )。MMP 2mRNA的表达与肝癌肿瘤大小和临床分期呈正相关 (分别为r =0 .4 4 1 ,P <0 .0 1 ;r=0 .340 ,P <0 .0 5 ) ;MMP 9蛋白表达阳性的肝癌患者术后生存时间缩短 (P <0 .0 5 )。Kaplan Meier单因素分析发现MMP 2 ,MMP 9表达阳性患者的预后差 (P <0 .0 1 ,P <0 .0 5 )。多因素Cox回归分析显示MMP 2 ,MMP 9的蛋白表达可作为肝癌估测预后的指标。结论 :基质金属蛋白酶MMP 2 ,MMP 9的过表达以及其与TIMP 2 ,MMP     

活化抗原提呈细胞对人骨肉瘤PL-11细胞凋亡后体外免疫原性的影响

目的：研究人骨肉瘤细胞PL－11被诱发凋亡后,体外活化的抗原提呈细胞（APC）对其免疫原性的影响,方法：（1）H2O2诱发PL－11凋亡的浓度和时间筛选,流式细胞仪分析。（2）正常献血粗分白细胞悬液离心沉降法得人外周血单个核细胞,粘附法分离单核细胞并预激活,同时分离得混合淋巴细胞并预培养,激活单核细胞分别与凋亡细胞多次冻溶物（PL－11a)和未发生凋亡之PL－11的多次冻溶物（PL－11u)和淋巴细胞孵育7d(pl-11a组及pl-11u组）,另设单纯淋巴细胞与凋亡PL－11多次冻溶物培养组（对照组）和激活单核细胞与淋巴细胞共培养（MON组）组,计数法测量增殖,（3）各组培养的淋巴细胞进行体外杀伤实验（效靶比100：1）,改良MTT（thiazolyl blue)法测量杀伤及抑制率,结果：（1）低于100nmol.L^-1H2O2在7h之内均无明显诱导凋亡作用,于14h后均诱导凋亡,且存在量效差别,100nmol.L^-1处理36h最明显。（2）PL－11a组淋巴细胞休外增殖显,PL-11u组仅有较弱的增殖作用,对照组和MON组均明明显增殖作用,（3）pl-11u组仅有较弱的淋巴细胞杀伤作用,pl-11a组则有明显在增强,而对照组及MON组均无作用,结论：人骨肉瘤细胞在H2O2诱发凋亡后,如经活化APC吞噬,可显提高其体外免疫原性而引出肿瘤杀伤效力,提示外周血中活化单核细胞处理凋亡骨肉瘤细胞将可能成为个体化的骨肿瘤疫苗方案。     

表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系的建立及其在HL-60细胞分化过程中的作用

目的:建立表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系,并研究Jagged1基因表达在HL-60细胞诱导分化过程中的作用.方法:构建含有人全长Jagged1基因的逆转录病毒载体MSCV-Jagged1/neoR,将其导入包装细胞PT67并收获病毒上清,用病毒上清转染骨髓基质细胞系HFCL,经G418筛选得HFCL-pMSCV-Jagged1细胞,用Western印迹方法检测Jagged1基因的表达;将HL-60细胞与HFCL-pMSCV-Jagged1细胞、HFCL细胞在含有全反式维甲酸(ATRA)的培养液中共培养,流式细胞仪检测不同时间点HL-60细胞CD11b的阳性率.结果:Western印迹方法证明HFCL-pMSCV-Jagged1细胞Jagged1表达水平明显高于HFCL细胞;HL-60细胞与HFCL-pMSCV-Jagged1、HFCL共培养48和72 h后,CD11b阳性率在Jagged1组明显低于HFCL组(P<0.05).结论:Jagged1基因表达可以较为显著地抑制ATRA诱导的HL-60细胞的分化.     

Transforming growth factor-α promotes mouse blastocyst outgrowth and secreti on of matrix metalloproteinases

Objective To study the effect of transforming growth factor-α (TGF-α) on early stage of embryo implantation.Methods Mouse blastocysts were cultured in vitro in medium containing various concentrat ions of TGF-α. Blastocyst implantation capacity was evaluated by calculating the percentage of embryos with attachment or outgrowth. Matrix metalloprotein ases (MMPs) secretion of blastocysts was observed using gelatin zymography. Results There was no significant difference in the percentage of attachment betwee n control and TGF-α treated groups, but the percentage of outgrowth of TGF-α treated groups was significantly higher than that of the control group after 24 h culturing. Gelatin zymography showed that blastocysts cultured in TGF-α treated groups started secreting MMPs earlier than those in the control group.Conclusion TGF-α is involved in regulating the mouse embryo implantation process by promo ting blastocyst outgrowth and secreting matrix matalloproteinases.     

基质金属蛋白酶及其抑制物在口腔鳞状细胞癌中的表达和意义

目的　探讨口腔鳞状细胞癌 (oralsquamouscellcarcinoma ,OSCC)组织中基质金属蛋白酶 9(matrixmetallo proteinase 9,MMP 9) ,基质金属蛋白酶组织抑制因子 1(tissueinhibitorofmetalloproteinase 1,TIMP 1)的表达及其与肿瘤分化、转移的关系。方法　采用免疫组织化学SP法检测 4 5例口腔鳞癌标本 ,9例正常口腔粘膜标本中MMP 9TIMP 1的表达情况。结果　①口腔鳞癌中MMP 9、TIMP 1的阳性表达率分别为 6 4 .4 %和 4 2 .2 % ,与对照组比较有显著性差异。②口腔鳞癌低分化组中MMP 9、TIMP 1的阳性表达率高于高分化组 (P <0 .0 5 )。③颈淋巴结转移组中MMP 9、TIMP 1的阳性表达率高于无淋巴结转移组 (P <0 .0 5 )。结论　口腔鳞癌组织中MMP 9、TIMP 1的表达与肿瘤分化程度及颈淋巴结转移有关 ,与肿瘤发生部位无关。     

人肺腺癌多药耐药细胞系的建立及其生物学特征

目的 建立人肺腺癌多药耐药细胞系。方法 以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系SPC-A-1为诱导对象,采用大剂量冲击与逐步增加剂量相结合的方法,诱导建立人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP;MTT法测定药物敏感性,透射和扫描电镜观察形态变化,常规染色体检测分析染色体变化。结果 用192d建成人肺腺癌多药耐药细胞系SPC-A-1/CDDP,它对顺铂的耐药指数为11.2,对顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、长春新碱和足叶乙甙等药物有不同程度的耐药性,但对羧基喜树碱无耐药性,电镜观察可见SPC0-A-1/CDDP细胞胞核不规则,较大,有丰富的微绒毛。结论 本研究建立了稳定的人肺腺癌多药耐药细胞系（SPC-A-1/CDDP）,可应用于下游实验。     

探讨不同实验条件对U87细胞体外增殖的影响

目的:探讨RNA干扰肝癌衍生生长因子(HDGF)后,U87细胞增殖抑制的最佳实验条件。方法:用LipofectamineTM2000将HDGF siRNA转染U87细胞后,将细胞接种于96孔板中,分别在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,采用MTS法检测细胞增殖能力。结果:HDGF表达水平下调后,U87细胞增殖能力受到抑制。在无血清、含10%FBS和无血清Matrigel胶预处理细胞培养板条件下,细胞增殖抑制率分别是18%、9%和28%。结论:在无血清Matrigel胶预先处理的培养条件下,能最大程度上反映出HDGFsiRNA对U87细胞增殖能力的抑制。     

基质金属蛋白酶与食管鳞癌预后的关联研究

目的：识别新的与食管鳞癌预后紧密相关的分子标志物,构建预测效力更高的食管鳞癌预后模型。方法：系统分析基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MMPs）中核心成员MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9及MMP10在食管鳞癌中的表达情况。采用免疫组织化学方法检测MMP3在315例（训练集197例;验证集118例）食管鳞癌患者癌组织及癌旁组织中的表达情况,Cox回归分析评价MMP3蛋白表达与食管鳞癌预后的关联。整合临床病理因素,构建食管鳞癌预后预测模型。结果：MMP1、MMP3及MMP10在食管鳞癌组织中呈异常表达,免疫组织化学分析结果表明MMP3蛋白在食管鳞癌组织表达显著高于癌旁组织。训练集中,MMP3阳性表达的患者总体存活率（22.22%）显著低于MMP3阴性表达患者（49.25%,HR=2.09,95%CI：1.45~3.03,P < 0.001）,这一结果在验证集及合并集中得到进一步验证。此外,整合MMP3表达与临床病理信息构建的预后预测模型,其预测能力显著优于TNM分期模型（AUC：0.733 vs. 0.689）。结论：MMP3可作为食管鳞癌预后相关分子标志物,整合临床病理因素构建的模型可更加准确地预测食管鳞癌患者的预后。