兔退变椎间盘模型中髓核细胞凋亡的实验研究

目的：研究细胞凋亡在兔退变椎间盘模型中的作用。方法：用针刺法制作兔退变椎间盘模型,磁共振检查鉴定模型的建立,HE染色计数髓核细胞,TUNEL法染色标记凋亡髓核细胞,并通过激光共聚焦显微镜计数凋亡细胞比例,RT-PCR检测Bax和Bcl-2凋亡相关基因的表达水平。结果：兔退变模型建立成功,退变组髓核细胞计数低于正常组,凋亡细胞比例高于正常组,退变组抗凋亡基因表达低于正常组,凋亡基因水平高于正常组。结论：凋亡在椎间盘退变模型中存在,并起重要作用。     

微载体旋转立体培养对成人退变髓核细胞凋亡调控的研究

目的 采用微载体旋转立体培养法对成人退变髓核细胞进行扩增,研究细胞凋亡情况,探讨髓核细胞凋亡在椎间盘退变中的作用。方法 手术切除的退变髓核组织行原代培养,传代后随机进行单层培养和微载体旋转立体培养,采用Annexin-V-PI染色,流式细胞仪定量检测早期细胞凋亡,应用免疫组化方法检测凋亡抑制因子Bcl 2的表达,DeadEndTM比色法检测细胞晚期凋亡情况。结果 流式细胞仪定量检测可见细胞在稳定生长期时,微载体旋转立体培养法较单层培养法髓核细胞的凋亡率低（P<0.05）,在对数生长期两种培养方法无明显差别（P>0.05）。Bcl-2指标及DeathEndTM比色法检测显示在两个时期内,微载体旋转立体培养法培养的细胞凋亡率较低（P<0.05）。结论 微载体旋转立体培养法可较好地降低髓核细胞凋亡率,是一种较有前途的髓核细胞培养方法,为组织工程化椎间盘髓核种子细胞的研究奠定了基础。     

正常与退变髓核细胞II型胶原蛋白和番红染色的研究

目的对正常与退变椎间盘髓核细胞（Nucleus pulposus of intervertebraldiSC）II型胶原蛋白免疫荧光染色及番红“O”染色进行比较。方法对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色及细胞内II型胶原蛋白行免疫荧光染色。结果（1）免疫荧光染色：退变椎间盘髓核细胞轻度染色,呈类圆形,染色模糊,细胞内仅有极少量荧光颗粒;（2）番红“O”染色：退变盘髓核细胞形态不规则,细胞核染色较淡,形态不规则,细胞突起及胞浆染色不均匀,部分细胞组织结构分解,完整性消失,细胞稀疏,排列混乱,有的可见少量细胞坏死区。结论正常与退变椎间盘髓核细胞比较,在退变的椎间盘中髓核细胞数量减少、部分凋亡,髓核细胞内的Ⅱ型胶原蛋白含量明显减少。     

血红素氧合酶-1通过NF-κB信号通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡

目的 探讨血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及机制.方法 采用免疫组化和Western blot检测正常(LVF组,标本来源于年轻的椎体骨折行手术治疗的患者)及退变(IDD组,标本来源于椎间盘退变性疾病行手术治疗的患者)人椎间盘髓核组织中HO-1和磷酸化的P65(p-P65)的表达差异;体外培养退变髓核细胞,通过IL-1β处理增加髓核细胞凋亡,再用载HO-1质粒的慢病毒及小干扰RNA处理髓核细胞后检测凋亡的变化;通过P65抑制剂PDTC抑制p-P65表达后检测髓核细胞凋亡的变化.结果 免疫组化结果显示,HO-1在IDD组中的阳性表达率为(18.58 ±0.59)％,明显低于LVF组(58.26 ±2.48)％ (P ＜0.05),而p-P65在IDD组中的阳性表达率为(40.27±2.03)％,明显高于LVF组(19.75±1.98)％ (P ＜0.05).IL-1β能增加退变髓核细胞的凋亡,同时引起p-P65表达增加,HO-1-siRNA抑制HO-1表达后可以进一步提高髓核细胞凋亡率(P＜0.05),而过表达HO-1处理细胞后能够降低IL-1β引起的凋亡增加,同时降低p-P65表达(P＜0.05).使用P65抑制剂PDTC抑制髓核细胞P65信号通路后,髓核细胞凋亡率明显降低,此时沉默HO-1不能增加髓核细胞凋亡.结论 HO-1能够通过NF-κB通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡.     

髓核研究的现状难以诠释椎间盘退变之道

最近,《关节炎和风湿病》（Anhrilis Rheum）杂志上刊载的1篇题为“人退变椎间盘髓核细胞中,整合素传导通路的变化”的研究文章引起了我们的关注。我们对该文进行仔细研读后,结合我们在人髓核细胞和椎间盘退变领域的研究,就人髓核细胞的培养,椎间盘退变的分级以及正常椎间盘的界定等方面提出了我们的见解,并就相关问题进行了对比和总结。我们撰写的Letter发表在《Anhrilis Rheum》杂志上。     

柚皮苷通过Fas膜受体通路调控髓核细胞凋亡的机制研究

[目的]观察中药骨碎补单体柚皮苷（Naringin）对人退变椎间盘髓核细胞凋亡的影响,为治疗椎间盘退变提供理论依据。[方法]对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞利用番红O染色和甲苯胺蓝染色进行鉴定,并对P3代细胞分别用柚皮苷0 g/mL （对照组）、柚皮苷20 g/mL、柚皮苷40 g/mL、柚皮苷80 g/mL的培养基培养人髓核细胞48 h,噻唑蓝（MTT）法选择其抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡的最佳浓度,并用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率。实时定量聚合酶链锁反应（qRT-PCR）检测Fas、FasL、Caspase-8基因表达。蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测Fas蛋白表达。[结果]MTT法和流式细胞检测均测定20 g/mL柚皮苷为抑制髓核细胞凋亡的最佳浓度（P<0.05）。qRT-PCR检测20 g/mL柚皮苷能够抑制Fas、FasL、Caspase-8 mRNA表达（P<0.05）。Western-blot检测显示20 g/mL柚皮苷能够抑制Fas、FasL、Caspase-8蛋白表达。[结论]柚皮苷可能通过调控Fas/Fasl死亡受体凋亡通路抑制人退变椎间盘髓核细胞凋亡。     

椎间盘髓核细胞表型的研究进展

髓核细胞特异性表型是识别髓核细胞和研究其生物学行为的基础,同时也是基因干预、细胞移植等生物学修复椎间盘退变的前提。髓核细胞兼有软骨细胞和脊索细胞的表型特点,而特定基因的转录和表达调控又广泛受到椎间盘局部微环境以及椎间盘退行性变的影响。部分髓核细胞亚群还具有祖细胞的生物学特性并表达特定的表型。对髓核细胞表型的研究有助于推动椎间盘退变生物学治疗的进展。     

Hartley豚鼠增龄过程中腰椎间盘退变髓核组织形态变化及其生化研究

目的 研究Hartley豚鼠腰椎间盘自然老化及退变过程中脊索性髓核向纤维软骨髓核转化的规律及其血液生化指标与腰椎间盘退变的关系.方法 Hartley雌性豚鼠40只,分别为1、1、5、2、2、5、3月龄,每组各8只.通过HE观察豚鼠椎间盘髓核退变情况,测定其血清中蛋白多糖水平.结果 2月组椎问盘形态即有退变.血清蛋白多糖含最随年龄的增长而下降,各组间差异显著.结论 随着年龄的增长,椎间盘退变的同时,出现血清蛋白多糖含量的降低.随着椎间盘的不断老化,终板的软骨细胞向髓核迁移,脊索性髓核向心性皱缩并最终完全被纤维软骨性髓核取代.在Hartley雌性豚鼠椎间盘退变的过程中,这一转化完成得更快、更早.     

人类不同年龄段腰椎间盘组织细胞凋亡及其调控蛋白Bcl-2和Bax的表达

目的 探讨细胞凋亡及其调控蛋白在人类不同年龄段椎间盘组织退变中的作用及其可能存在的基因调控机制。方法 对0～58岁不同年龄段正常人腰椎间盘髓核细胞的形态结构进行苏木精-伊红染色光镜观察、TUNEL细胞凋亡检测、Bcl -2和Bax蛋白免疫组织化学染色。结果从胚胎后期开始,椎间盘髓核细胞数量随年龄增长而逐渐减少,到老年阶段髓核细胞的数量已经很少（H=95.123,P〈0.05）。从胚胎后期到成年,TUNEL阳性细胞率随年龄增长而逐渐降低,并降到整个生命过程中的最低点;继之,TUNEL阳性细胞率又逐年升高（F=205.391,P〈0.05）。自胚胎后期开始,Bcl-2蛋白就开始有较高水平的表达,但呈现逐年下降的趋势（F=81.385,P〈0.05）。Bax蛋白在胚胎后期即呈现较高水平表达,随年龄增长其表达水平逐渐降低（F=102.134,P〈0.05）;到成年后,Bax蛋白表达水平又有所升高,但不明显。结论 在整个生命过程中,随年龄增长大量腰椎间盘髓核细胞发生凋亡,细胞数量明显减少。Bcl-2蛋白可能参与了椎间盘细胞凋亡的调节,但表达水平较低,不能阻止细胞凋亡的发生。Bax蛋白的表达可能参与了整个生命过程中椎间盘髓核细胞的凋亡。     

大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型的建立

【摘要】 目的 建立大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型。方法 为了充分模拟退变椎间盘内营养缺乏的微环境，本实验分别采用含1%，3%，5%，8%，10%胎牛血清的DMEM培养基培养椎间盘髓核细胞，筛选最佳促凋亡浓度，分别检测髓核细胞凋亡率、凋亡相关蛋白Bax、bcl-2、caspase-3酶的表达、细胞增殖曲线及免疫荧光分析。 结果 流式细胞仪测得髓核细胞凋亡率随着FBS浓度降低而升高，3% FBS为最有效诱导凋亡浓度；Western blot 示Bax、caspase-3酶表达在3% FBS组明显高于10% FBS组，同时bcl-2表达下降；CCK-8检测结果显示含3% FBS的培养基内，随着凋亡率的增长，髓核细胞增殖的速率越来越慢；免疫荧光分析3% FBS组FAS表达量明显比10% FBS组增高。结论 3% FBS能诱导髓核细胞发生凋亡，最终会导致细胞功能丧失，caspase家族参与并执行了这一过程。     

基质金属蛋白酶在腰椎间盘退变中的研究进展

腰椎间盘退变是一系列腰椎退行性疾病(腰椎间盘突出症、退变性腰椎滑脱及腰椎失稳等)的前提和病理基础,主要病理表现主要为髓核细胞的减少和细胞外基质的降解。基质金属蛋白酶(MMPs)的活性增高在椎间盘的退变过程中起着关键作用,该文就MMPs的生物学特性,在退变椎间盘中的表达及细胞因子对MMPs的调节予以综述。     

成人退变椎间盘细胞微载体培养的形态学观察

①目的建立成人退变椎间盘细胞的体外三维培养模型,并观察其形态学变化。②方法对8例取自椎间盘疾病病人退变椎间盘的手术标本,采用系列酶消化法对其进行了体外细胞培养,并将细胞转移至微载体旋转培养系统中进行培养,利用倒置相差显微镜进行形态学研究,并对细胞涂片进行染色观察。③结果退变椎间盘细胞在三维微载体旋转培养系统中可以获得良好的生长并大量的增生,培养的细胞具有退变的特性。④结论成人退变椎间盘细胞体外立体培养成功,退变细胞能够快速大量增殖,为成功体外构建组织工程学椎间盘奠定了基础。     

腰椎退行性疾病手术患者椎间盘退变及责任间隙分布情况研究

背景　椎间盘退变是一系列腰椎退行性疾病的始动因素,既往研究多集中于腰椎间盘退变的流行病学及影像学研究方面,而关于严重腰腿痛的腰椎退行性疾病患者需手术干预的研究少见,其椎间盘退变分布规律并不明确,而责任间隙（手术节段）退变分布情况鲜有报道。目的　分析腰椎退行性疾病手术患者椎间盘退变及责任间隙分布规律。方法　选择2012年1月-2016年2月于中国人民解放军第960医院行腰椎正侧位、过伸过屈位X线和腰椎矢状位MRI检查并确诊为腰椎退行性疾病患者503例,分析腰椎间盘退变及责任间隙分布特点〔包括腰椎失稳、Modic改变、高信号区域（HIZ）、许莫结节（SN）〕;椎间盘退变分级采用Pfirrmann分级标准,Ⅰ、Ⅱ级为正常椎间盘,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级为退变椎间盘（其中Ⅳ级、Ⅴ级为严重退变）;多间隙椎间盘退变采用自定义W分级标准,即两个及以上节段椎间盘退变程度。结果　503例患者共2 515个腰椎间盘,退变率为74.08%（1 863/2 515）,严重退变率36.46%（917/2 515）。上腰椎椎间盘（L1~2、L2~3）退变率为56.96%（573/1 006）,严重退变率为34.55%（198/573）;下腰椎椎间盘（L3~4、L4~5、L5~S1）退变率为85.49%（1 290/1 509）,严重退变率为55.74%（719/1 290）。下腰椎椎间盘退变率、严重退变率均高于上腰椎（P<0.05）。≥40岁女性腰椎间盘退变率高于男性（P<0.05）。<40岁男性腰椎失稳发生率与女性比较,差异无统计学意义（P>0.05）;而Modic改变、HIZ、SN发生率两性别间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。≥40岁女性腰椎失稳发生率高于男性（P<0.05）;而Modic改变、HIZ、SN发生率两性别间比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。≥40岁男性Modic改变、HIZ与女性腰椎失稳、HIZ、SN与<40岁者发生率比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。腰椎失稳、Modic改变、SN和HIZ腰椎退变节段分布情况比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。手术节段单间隙381例,两间隙102例,三间隙14例,四间隙4例,五间隙2例;责任间隙椎间盘退变率为99.01%（498/503）,严重退变率为62.82%（316/503）。结论　腰椎退行性疾病手术患者的椎间盘退变率较高,且女性较高,下腰椎椎间盘高于上腰椎椎间盘,女性腰椎失稳、Modic改变发生率均高于男性,SN发生率低于男性,40岁是男性Modic改变及HIZ发生的转折点,也是女性腰椎失稳、HIZ、SN发生的转折点。责任间隙椎间盘大部分发生退变,且严重退变率较高。     

枸杞多糖对大鼠腰椎间盘退变影响的形态学观察

目的探讨枸杞多糖(LBP)对大鼠退变腰椎间盘的形态学的影响。方法将健康雄性SD大鼠42只,随机分为假手术组、椎间盘退变组、LBP干预组,每组14只。采用手术方法制作大鼠腰椎间盘退变模型,LBP干预组在造模后4周,每天上午8:00灌胃给药,80mg.mL-1,容量为1mL.kg-1,连续4周。假手术组及椎间盘退变组分别给予等容量生理盐水灌胃,连续4周。在造模后8周三组所有大鼠再次麻醉,取出椎间盘组织,分别在光镜及电镜下观察椎间盘形态学的变化。结果 HE染色光镜观察假手术组髓核细胞丰富,形态不规则,集中成簇;椎间盘退变组髓核细胞稀少,细胞基质见大量的空泡;LBP干预组髓核细胞有变性、坏死,但较椎间盘退变组退变程度减轻。电镜下假手术组的髓核细胞多见,核膜完整,细胞器丰富;椎间盘退变组髓核细胞减少,细胞器缺失,见大量的空泡;LBP干预组髓核细胞减少,有变性、坏死,退变较椎间盘退变组减轻。结论 LBP可能对大鼠腰椎间盘髓核组织退变有延缓作用。     

Transplantation of gene-modified nucleus pulposus cells reverses rabbit intervertebral disc degeneration

Background  Intervertebral disc degeneration is the main cause of low back pain. The purpose of this study was to explore potential methods for reversing the degeneration of lumbar intervertebral discs by transplantation of gene-modified nucleus pulposus cells into rabbit degenerative lumbar intervertebral discs after transfecting rabbit nucleus pulposus cells with adeno-associated virus 2 (AAV2)-mediated connective tissue growth factor (CTGF) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP1) genes in vitro.

Methods  Computer tomography (CT)-guided percutaneous annulus fibrosus injury was performed to build degenerative lumbar intervertebral disc models in 60 New Zealand white rabbits. rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1-transfected rabbit nucleus pulposus cells were transplanted into degenerative lumbar intervertebral discs (transplantation group), phosphate-buffered saline (PBS) was injected into degenerative lumbar intervertebral discs (degeneration control group) and normal lumbar intervertebral discs served as a blank control group. After 6, 10 and 14 weeks, the disc height index (DHI) and signal intensity in intervertebral discs were observed by X-ray and magnetic resonance imaging (MRI) analysis. The expression of CTGF and TIMP1 in nucleus pulposus tissue was determined by Western blotting analysis, the synthesis efficiency of proteoglycan was determined by a ³⁵S-sulfate incorporation assay, and the mRNA expression of type II collagen and proteoglycan was detected by RT-PCR.

Results  MRI confirmed that degenerative intervertebral discs appeared two weeks after percutaneous puncture. Transgenic nucleus pulposus cell transplantation could retard the rapid deterioration of the DHI. MRI indicated that degenerative intervertebral discs were relieved in the transplantation group compared with the degeneration control group. The expression of collagen II mRNA and proteoglycan mRNA was significantly higher in the transplantation group and the blank control group compared with the degeneration control group (P <0.05).

Conclusions  CT-guided percutaneous puncture can successfully build rabbit degenerative intervertebral disc models. Both CTGF and TIMP1-transfected cell transplantation helps to maintain disc height, and promotes the biosynthesis of type II collagen and proteoglycan in intervertebral discs, reversing the degeneration of intervertebral discs.

     

白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织形态学的影响

目的观察白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织影响的病理改变及超微结构变化。方法将大鼠36只随机分为正常对照组、椎间盘退变组和白藜芦醇药物干预组各12只,应用HE染色光镜观察各组腰椎间盘髓核组织的病理改变,在电镜下对其进行超微结构的观察。结果光镜下可见正常对照组较多的脊索细胞和类软骨细胞增殖活跃,椎间盘退变组髓核的细胞减少,白藜芦醇药物干预组髓核细胞减少较椎间盘退变组程度轻;电镜下正常对照组的椎间盘髓核组织超微结构的病理改变不显著,而椎间盘退变组表现为髓核细胞减少,出现不同程度的退变、坏死,白藜芦醇药物干预组中退变程度明显减轻。结论通过光镜、电镜下观察白藜芦醇对大鼠退变腰椎间盘髓核组织有延缓或抑制作用,可为白藜芦醇预防和治疗椎间盘退变提供相关的实验依据。     

非线性三维有限元法分析腰椎间盘退变

目的 探讨椎间盘退变对腰椎活动节段生物力学的影响.方法 采用新型的基于CT图像的CAD建模方法精确建立L4-L5运动节段的三维非线性有限元模型,并通过改变椎间盘材料特性和椎间盘高度等参数,建立正常椎间盘模型和轻、中、重度椎间盘退变模型,分别对4种有限元模型进行生物力学测试,比较4种模型之间刚度、髓核内压、后部结构力、纤维环基质最大应力的差异,并比较椎体、终板的应力分布变化.结果 各种载荷条件下,退变椎间盘模型刚度均与正常椎间盘模型不同,其中轻度退变模型刚度小于正常模型,而中度退变模型和重度退变模型刚度大于正常模型,且重度退变模型刚度大于中度退变模型;与正常模型比较,轻度退变模型的后部结构力略有增大,而中度退变和重度退变模型的后部结构力逐渐减小;随着椎间盘退变程度的增加,髓核内压逐渐减小,纤维环基质最大von Mises应力渐行性增大,各指标在5种载荷下表现一致;随着椎间盘退变的加重,椎间盘承载向纤维环分散,椎体、终板外缘出现应力集中现象.结论 椎间盘退变可导致腰椎活动节段刚度改变,轻度椎间盘退变引起腰椎刚度下降,而中、重度椎间盘退变时腰椎刚度增加;椎间盘退变时腰椎间盘承载与腰椎后部结构力呈现负相关变化;退变椎间盘的承载模式发生改变,椎间盘、椎体、终板应力分布存在向外周扩散的趋势.     

Specific inhibitory protein Dkk-1 blocking Wnt/β-catenin signaling pathway improve protectives effect on the extracellular matrix

The present study examined the role of Wnt/β-catenin signaling pathway in the degeneration of nucleus pulposus cells and the protective effect of DKK1 on nucleus pulposus cells.The model of nucleus pul...