rhBMP-2诱导成肌细胞表达成骨表型的研究

目的：检测不同浓度rhBMP-2对诱导成肌细胞成骨表型表达的影响，探索诱导成肌细胞表达成骨表型的rhBMP-2的最适浓度。方法：采用双重酶消化法获取SD大鼠乳鼠的成肌细胞，纯化后，在含15％胎牛血清的DMEM培养液中培养。取第3代培养细胞，按培养液中不同rhBMP-2浓度分组，分为0、0．1、0．5、1．0、1．5和5．0μg／ml共6组（0μg/ml组为对照组1，培养1、2和4周。收集不同时期细胞培养上清液和细胞爬片进行检测，检测指标为：细胞形态和数量、碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OCN）含量、Ⅰ型胶原合成量和钙化结节染色。采用SPSS10．0统计软件包进行统计分析。各组间比较采用方差分析（ANOVA）。结果：应用rhBMP-2后，梭形成肌细胞减少，圆形或多突形成肌细胞明显增加，细胞呈集结性生长，培养4周可形成不透光结节。低、中浓度（0．1-1．5μg／ml）rhBMP-2组细胞数量和对照组之间无显著性差异（P〉0．05），但高浓度（5．0μg／ml）rhBMP-2组细胞数量显著下降（P〈0．05）。0．1～1．5μg／ml 4组rhBMP-2均能促进成肌细胞合成分泌ALP、OCN和Ⅰ型胶原（所有组与对照组比较，P〈0．05），其中0．5和1．0μg/ml 2组促进作用更显著。细胞培养4周后，茜素红S染色法示结节呈红色钙阳性反应。结论：低、中浓度（0．1～1．51μg／ml）rhBMP-2对成肌细胞增殖无显著影响，但高浓度（5．0μg/ml）rhBMP-2可显著抑制成肌细胞增殖。rhBMP-2可有效诱导成肌细胞表达成骨细胞各项表型并能体外成骨，其中0．5～1．01μg／ml是一个较为适宜的诱导浓度。     

rhbFGF、rhTGF-β、rhBMP-2对骨髓基质细胞体外培养增殖的影响

目的 :探讨重组人骨形成蛋白 (rhBMP 2 )、重组人转化生长因子 beta(rhTGF β1)、重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhbFGF)单独或联合应用对骨髓基质细胞体外培养生物特性的影响。方法 :体外培养大鼠骨髓基质细胞 ,分别用特定浓度的rhBMP 2 (2 0 0 μg/L ,简称b )、rhTGF β1(5 μg/L ,简称t)和rhbFGF(1μg/L ,简称f)单独或联合作用 ,观察它们对骨髓基质细胞增殖的影响 ,进行细胞计数测定细胞生长曲线 ,计算细胞倍增时间 ,用四唑盐比色法 (MTT)法测定细胞增殖情况。结果 :细胞计数测定显示所有各组在第 3天细胞数增加 ,对照组、t组、f组、f +t组和f +t +b组第 4天进入平顶期 ,而b组和f +b组细胞仍保持较高的增殖活性 ,细胞倍增时间f +b组最短为 3 2h ,MTT法测定结果与细胞计数法相似 ,b组和f +b组与对照组相比细胞增殖有显著差异 (P <0 .0 5 )。结论 :生长因子rhbFGF(1μg/L)和rhBMP 2 (2 0 0 μg/L)结合使用可以促进骨髓基质细胞的增殖 ,可以作为体外培养骨髓基质细胞扩增的最佳培养条件     

乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响

目的：观察乳铁蛋白（lactoferrin,LF）对体外培养的人牙周膜细胞（HPDLCs）增殖、迁移和成骨分化的影响。方法：原代培养并鉴定人牙周膜细胞,稳定传代后用 MTT 比色法、Transwell 法及划痕试验检测浓度分别为0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白对牙周膜细胞增殖和迁移的影响;矿化条件下,0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白作用牙周膜细胞后,茜素红染色法和实时荧光定量 PCR 检测矿化能力及成骨相关基因的表达。结果：10、20μg／ml 乳铁蛋白均能促进 HPDLCs 增殖、迁移（P ＜0．05）。10、20μg／ml 乳铁蛋白组矿化结节数量增多（P ＜0．05）,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）表达量均有升高（P ＜0．05）。结论：乳铁蛋白能够促进人牙周膜细胞增殖、迁移与成骨分化。     

釉基质蛋白对猪骨髓基质细胞黏附、伸展及增殖的影响

目的：研究釉基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）对体外培养的猪骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）黏附、伸展和增殖活性的影响。方法：抽取猪髂骨骨髓．全血培养法获得骨髓基质细胞。培养液中EMPs的浓度分别为25、50、100、200μg／ml,以不加EMPs为对照。用比色法检测不同浓度EMPs对BMSCs黏附的影响。通过计数预定视野中伸展的细胞数,计算BMSCs在培养1h、3．5h、6、5h后的伸展率。MTT法测定各组细胞的增殖活性。对实验数据行单因素方差分析和SNK法组间比较。结果：猪BMSCs在含有EMPs的培养液中生长良好。对照组以及不同浓度EMPs实验组对细胞黏附的影响无统计学差异。在1h、3．5h、6．5h．各组细胞的伸展率无显著不同。EMPs对BMSCs的促增殖作用呈浓度和时间依赖性．200μg／ml浓度的EMPs从实验的第3天开始．显著促进猪BMSCs的增殖。结论：EMPs对体外培养的猪BMSCs的黏附和伸展无显著影响．200μg／ml浓度的EMPs可显著促进猪BMSCs增殖,为联合应用EMPs和BMSCs修复牙周组织缺损提供了理论依据。     

釉基质蛋白对人骨髓基质细胞增殖和矿化的影响

目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。     

神经生长因子对人牙髓细胞增殖与分化作用的研究

目的 研究神经生长因子对体外培养的人牙髓细胞增殖和分化作用的影响。方法 组织块法行人牙髓细胞的原代培养后，采用四唑盐比色法和酶动力学方法，测定不同浓度（1、10、100U／mL）的神经生长因子对体外培养的第5-8代人牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的作用。结果 与对照组相比，10U／mL的神经生长因子可显著促进人牙髓细胞的增殖（P〈0．05）；100U／mL的神经生长因子可显著促进碱性磷酸酶的活性（P〈0．01）。结论 不同浓度的神经生长因子可显著促进人牙髓细胞的增殖与分化。     

不同浓度bFGF对犬骨髓基质细胞增殖、分化影响的实验研究

目的：研究不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factot,bFGF）对体外培养的beagle犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal ceils，BMSCs）增殖和分化的影响。方法：体外培养第2代BMSCs的培养液中分别加入不同浓度（25、50、100、200ng／mL）的bFGF，连续6d倒置显微镜下动态观察BMSCs的形态和生长情况．行MTT比色、碱性磷酸酶（alkalin ephosphatase，ALP）活性定量检测、ALP和Von Kossa染色。结果：浓度为50ng／mL的bFGF可明显促进犬的BMSCs增殖（P〈0．05），但无显著促进犬BMSCs分化的作用（P〉0．051。结论：bFGF能有效促进犬BMSCs的增殖，且与bFGF剂量有关。     

茶多酚对炎性牙周膜细胞生物活性的影响

目的观察茶多酚对内毒素脂多糖(LPS)作用的人牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响,为茶多酚在牙周疾病的防治中提供一定依据。方法体外培养人牙周膜细胞,采用MTT比色法观察茶多酚对LPS作用的人牙周膜细胞增殖活性的影响,通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定法观察茶多酚对人牙周膜细胞的分化作用。结果100μg/ml LPS可抑制人牙周膜细胞的增殖活性和碱性磷酸酶活性。加入LPS同时分别给予50～1100μg/ml不同浓度茶多酚,能对抗LPS的抑制作用,增强人牙周膜细胞的增殖活性和碱性磷酸酶活性,其中在800μg/ml作用24h时促进作用达到最强。结论茶多酚可对抗内毒素对人牙周膜细胞的毒性作用,促进细胞的增殖和骨向分化。     

釉基质蛋白对人骨髓基质细胞生长和黏附的影响

目的探讨釉基质蛋白(enamelmatrixprotein,EMPs)对人骨髓基质细胞黏附、伸展和增殖的影响。方法用全骨髓培养法获得人骨髓基质细胞,各实验组中EMPs的浓度分别为50、100、200、300μg/ml,以不加EMPs作为空白对照组。细胞计数法测定细胞的黏附能力;通过计数高倍视野中伸展的细胞数,计算骨髓基质细胞在1、3、5和7h的伸展率;MTT法检测各组细胞的增殖活性。采用SAS6.12软件对所得数据进行单因素方差分析。结果体外培养的人骨髓基质细胞生长良好;各实验组间及与对照组比较,对细胞的黏附性的影响无统计学差异;各组细胞的伸展率亦无显著性差异;EMPs对人骨髓基质细胞有较明显的促增殖作用,其中200μg/ml浓度组EMPs对骨髓基质细胞的促增殖作用显著(P<0.05)。结论EMPs对体外培养的人骨髓基质细胞的黏附性和伸展率无影响,但可明显促进其增殖。     

rhBMP-2/hTGF-β1/胶原复合材料的初步研究

目的合成rhBMP-2／hTGF—β1／胶原复合材料，检测其生物相容性和活性。方法 用胶原复合rhBMP-2／hTGF—β1形成复合材料，通过兔眼结膜刺激试验和溶血试验对其生物相容性进行检测，观察复合材料对Beagle犬骨髓基质细胞（MSC）生长及增殖的影响，通过细胞计数（MTT法），碱性磷酸酶（ALP）活性检测，对复合材料的活性进行检测。结果 rhBMP-2／hTGF—β1／胶原复合材料呈白色棉絮状或团块状。对兔眼结膜无刺激作用，对兔血也无溶血作用。复合材料明显影响体外培养的Beagle犬骨髓基质细胞（MSC）的增殖和碱性磷酸酶水平。结论 按以上方法合成的rhBMP-2／hTGF—β1／胶原复合材料具有良好的生物相容性和生物学活性。     

生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石支架的骨传导性体外研究

目的:通过体外实验对新型生物吸收性多孔碳酸化羟基磷灰石(CAP)支架材料的骨传导性进行评价。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,向成骨诱导后,定植于不同孔隙率及不同碳酸根含量的CAP支架材料上共同培养,通过扫描电镜、细胞黏附及增殖检测(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)定量检测、骨钙素(OCN)定量检测,评价成骨细胞在支架材料上的附着、增殖和分化情况。结果:成骨细胞定植于不同孔隙率及碳酸根含量的支架材料上,4 h均已开始黏附、且增殖情况良好。分化实验中,ALP和OCN在各组支架材料分化良好。不同孔隙率支架材料组间比较,40%孔隙率的实验组对ALP分化的促进作用有明显优势。结论:CAP支架材料有良好的生物相容性和骨传导性,是一种良好的组织工程支架材料。     

葛根素诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

［摘要］ 目的 通过体外实验探讨不同浓度的葛根素诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs）骨组织分化的作用以及与Notch信号通路之间的关系。方法 根据葛根素的浓度,实验分为6组。取3周的SD大鼠分离培养BMSCs,传至第3代后接种细胞,改用不同分组的培养基。继续培养2~4周,测定碱性磷酸酶（ALP）与骨钙素（OC）的含量,评价葛根素的体外诱导成骨能力。用Elisa试剂盒测定Delta样配体4 （DLL4）的含量,评估葛根素的促成骨作用与Notch信号通路的关系。〖HTH〗结果〖HTSS〗 不同浓度组的细胞出现与典型成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,ALP、OC和DLL4含量增加,但以1×10-5 mol/L组显著高于对照组,比其他浓度组要高,但是差异无统计学意义。〖HTH〗结论〖HTSS〗 葛根素能有效促进BMSCs向成骨方向分化,以10-5 mol/L浓度效果最佳,其作用机制可能与Notch信号通路有关。     

富血小板血浆PRP的体外骨诱导作用研究

目的 :探讨在体外培养中富血小板血浆 (Platelet -RichPlasma ,PRP)对骨髓基质细胞诱导成骨的影响。方法 :从自体静脉血中提取PRP ,配制成条件培养液 ,并作用于培养状态的骨髓基质细胞 ,染色检测细胞碱性磷酸酶表达情况 ,钙化结节形成率 ,放免法测定培养液中骨钙素的含量。结果 :骨髓基质细胞经诱导培养后 ,碱性磷酸酶、骨钙素表达明显增加。结论 :体外培养时 ,PRP可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞增殖、成骨和成脂分化的影响

目的:研究淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和成骨、成脂分化的影响。方法:将淫羊藿苷配制成终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L的溶液,以0 mol/L组为空白对照组,分别用于体外培养犬BMSCs。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。然后实验分为淫羊藿苷组和对照组,分别在含或不含成骨、成脂诱导液条件下,行成骨、成脂诱导分化实验,通过茜素红和油红O染色检测各组钙沉积和脂质形成面积。结果:发现淫羊藿苷1×10-6 mol/L组促进犬BMSCs增殖,而1×10-4mol/L组抑制增殖。碱性磷酸酶活性与淫羊藿苷浓度呈剂量依赖性关系。不含成骨、成脂诱导液条件下,各组均几乎未见明显钙沉积和脂质形成;含成骨、成脂诱导液条件下,淫羊藿苷组(1×10-6 mol/L)钙沉积面积高于对照组,脂质形成面积低于对照组。结论:淫羊藿苷能促进犬BMSCs增殖和成骨分化,并抑制其成脂分化。     

新型多孔磷酸钙支架对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的评价新型多孔磷酸钙（CPC）作为骨组织工程支架对Beagle犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）黏附、增殖及成骨分化等生物学行为的影响。方法将Beagle犬BMSCs接种于新型多孔CPC三维支架表面,以磷酸三钙（TCP）和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）为对照组,通过观察细胞形态、绘制细胞生长曲线、测定碱性磷酸酶（ALP）活性、进行茜素红染色并半定量测定骨钙素等方法,检测BMSCs在支架材料上的黏附、增殖及成骨分化情况。结果细胞形态和生长曲线结果显示BMSCs在新型多孔CPC三维支架材料表面分布均匀,生长及增殖活跃。ALP活性半定量结果表明,CPC、TCP组ALP表达强度明显高于PLGA组（P＜0.05）,CPC组与TCP组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。骨钙素染色与半定量检测结果均显示：各观察点PLGA组钙盐沉积量明显少于CPC和TCP组（P＜0.05）,而TCP和CPC组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论本实验所用多孔CPC材料具有与TCP类似但优于PLGA的良好生物相容性,利于BMSCs的黏附、增殖及成骨分化,可作为支架材料与BMSCs共同培养,构建具有成骨能力的组织工程化骨。     

HMGB1对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGBl）对于大鼠骨髓基质干细胞BMSCs增殖、成骨／破骨的影响。方法：原代培养的大鼠BMSCs,分别以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,M‘rr法检测细胞数目;以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,7d后行AIJP染色和RT—PCR检测成骨／破骨基因的表达（骨钙素OCN,骨保护素OPG,核因子KB受体活化因子配体RANKL）。结果：HMGBl存100、500ng／mL浓度时,第3d和第5dBMSCs的OD值有明显升高,在第7d对BMSCs的ALP染色没有明显的改变,OCN和OPG基因的表达也没有明显变化,HMGBl明显提高了BMSCs的RANKI．及RANKI．／OPG基因表达。结论：HMGBl对大鼠BMSCs的增殖和破骨基因表达有明显的促进作用,为HMGBl应用于临床提供实验依据。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

氯化镧对体外培养的犬骨髓基质细胞增殖的影响

目的:观察3种浓度的氯化镧(LaCl3,La3+)对体外培养的犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的影响。方法:用5.564×102、5.564、5.564×10-2μg/mL3种浓度的La3+干预第3代BMSCs,设空白对照组和50ng/mLBMP-2干预的阳性对照组。通过MTT法、碱性磷酸酶半定量检测分析La3+对BMSCs的影响。结果:5.564μg/mL La3+干预组BMSCs在第6、7天表现出较高的生长趋势;碱性磷酸酶半定量检测发现5.564μg/mL La3+干预组OD值均数明显高于另两个实验组均数(P<0.05)。结论:5.564μg/mL浓度的La3+可促进BMSCs增殖。