改良法体外培养脐带血间充质干细胞及其生物学特性分析

背景：目前报道的脐带血间充质干细胞分离成功率较低,且缺乏较为统一的鉴定方法。目的：对传统的体外分离培养脐带血间充质干细胞方法加以改良,以提高细胞培养成功率,并进行生物学特性观察。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-04／2007-01在上海交通大学医学院附属第九人民医院完成。材料：取自足月健康顺产新生儿的脐带血标本28份,由上海市红房子医院产科提供,经产妇和家属同意。方法：无菌条件下取新生儿脐带血,以密度梯度离心法分离单个核细胞,以含体积分数为10％胎生血清的α-MEM培养基进行体外培养,原代培养5-7d后半量换液,后每隔三四天全量换液一次。待细胞贴壁后,按处理方法不周分为2组：改良1组当皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的皿中培养;改良2组待皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基换为含体积分数为15％小牛血清的α-MEM培养液,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为10％胎牛血清的α-MEM培养基。取第5代脐带血间充质干细胞,逍行体外成骨及成脂诱导。主要观察指标：显微镜下观察脐带血间充质干细胞的形态,流式细胞仪测定细胞免疫表型,碱性磷酸酶染色及油红染色检测细胞诱导分化能力。结果：28份脐带血中20份培养出贴壁细胞（改良1组6份/10份,改良2组14份／18份）,其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞（改良1组4份,改良2组9份）,成功率为46.4％,可传至22代且形态无变化,强烈表达CD105、CD29等间充质干细胞表面标志,而CD34、CD45和CD106等早阴性表达。在特定诱导条件下,脐带血间充质干细胞可分化为成骨细胞和脂肪细胞。结论：脐带血中存在间充质干细胞,具有多向分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定,体外培养方法经改良后可提高脐带血间充质干细胞的培养成功率。     

脐血间充质干细胞体外培养方法的改良及其成骨分化能力

目的:采用两种改良方法体外分离培养脐血间充质干细胞,并观察其成骨分化能力。方法:实验于2006-05/09在上海交通大学医学院附属第九人民医院骨与关节中心细胞实验室完成。①所用28份脐血标本由复旦大学医学院附属妇产科医院提供,取自足月健康顺产新生儿,产妇和家属均书面同意,实验经医学伦理委员会批准。②采集28份脐血标本,50～90mL/份,枸橼酸抗凝。采集后12h内密度梯度离心法分离出单个核细胞,接种于100mm×20mm培养皿中,细胞浓度为1×1010L-1,置于含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养液中原代培养,5～7d后半量换液,后每隔3～4d全量换液一次。③细胞贴壁后,分两组予以改良培养。改良1组10份,当培养皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的培养皿中培养;改良2组18份,待培养皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基更换为含体积分数为0.15小牛血清的α-MEM,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基。成纤维样细胞融合至80%～90%时胰酶消化,按1∶2或1∶3传代培养。④显微镜下观察脐血间充质干细胞的形态。取第5代脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪测定细胞免疫表型,以碱性磷酸酶法检测成骨分化能力。结果:①28份脐血间充质干细胞中,共20份原代培养中出现贴壁细胞(改良1组6份,改良2组14份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率46.4%。②原代培养5～7d后贴壁细胞呈梭形成纤维样细胞和圆形巨核细胞。改良1组与2组于原代培养5周可见成纤维样细胞集落,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,传至22代形态无明显变化。③可强烈表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志,而不表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志。④成骨诱导1周,脐血间充质干细胞可分化为成骨细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性。结论:脐血中存在的单个核细胞经过改良培养后,可提高脐血间充质干细胞的培养成功率。脐血间充质干细胞具有与其他来源的单个核细胞类似的表型及成骨分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定。     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点.目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供.方法:采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验.流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化.通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定.主要观察指标:①细胞形态.②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期.③表面标志物的鉴定.④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况.结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P＜0.05).两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P＜0.05).②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P＜0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P＜0.05).③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P＜0.05).结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用.     

脐血间充质干细胞培养体系的建立

目的:寻找脐带血来源的间充质干细胞体外分离、纯化及培养的条件,以建立稳定的体外培养体系,满足实验和临床的需要。方法:实验于2005-06/2006-04在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。脐带血36份,50～60mL/份,取自青岛大学医学院附属医院产科健康产妇正常足月顺产或剖宫产分娩婴儿的脐带血,经产妇本人及家属同意。无菌条件下取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。16份脐血每份分为3组,分别以间充质干细胞接种密度1×107L-1、1×109L-1、1×1011L-1接种于未包被6孔培养板内,加入5%胎牛血清的DMEM-LG培养。20份脐血每份分为3组,以1×1011L-1单个核细胞密度分别加入5%、10%和20%胎牛血清的DMEM-LG接种于胎牛血清包被的6孔培养板内培养。采用常规的间充质干细胞培养Friedenstein法进行脐血间充质干细胞的培养和扩增培养。观察不同脐血单个核细胞的接种密度、培养液胎牛血清浓度和胎牛血清包被培养皿对间充质干细胞培养的影响。结果:①胎牛血清未包被组以1×107L-1和1×109L-1接种组培养7d后贴壁数量很少,贴壁的细胞未长满瓶底即死亡,无法传代。1×1011L-1组贴壁细胞较多,间充质样细胞与破骨样细胞并存。1×1011L-1组分5%、10%、20%3种血清浓度,贴壁细胞均较多,以间充质干细胞为主,胎牛血清浓度5%组间充质干细胞的纯度较10%及20%组高,破骨样细胞相对较少;胎牛血清包被组与未包被组相比,贴壁细胞少,培养的间充质干细胞纯度较高,破骨样细胞相对较少。②流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,脐血P3代间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD45、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论:将脐血单个核细胞以1×1011L-1高密度接种在5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下,可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞,其培养成功率和间充质干细胞纯度较高。     

人脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

背景:目前所报道的脐带血间充质干细胞体外培养条件不尽相同,尚缺乏统一标准,且培养效率较低.目的:拟对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-04在中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室完成.材料:35份脐带血标本来源于北京协和医院妇产科顺产或剖宫产胎儿.方法:应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分别从脐带血中获得单个核细胞.细胞接种后,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12、L-DMEM和MesencultTM不同培养基,在不同体积分数胎牛血清(5%,10%,20%)、不同细胞接种密度(5×106,1×107,5×107,1×108)下进行细胞培养.细胞传至第3代诱导成骨,行Von Kossa染色.主要观察指标:不同分离方法、培养基、胎牛血清浓度、种植密度分离培养细胞的效果,脐带血间充质干细胞表面标记的表达及成骨情况.结果:与淋巴细胞分离液法比较,羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法获得的单个核细胞数量明显增多(P＜0.05,P＜0.01),羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法细胞原代培养时间显著短于另2种方法(P＜0.01).应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×107时,培养效率高于其余各种条件组合(P＜0.01).贴壁细胞表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45,CD90及CD133,经成骨诱导培养21 d后Von Kossa染色可见黑色矿化结节.结论:应用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法可以获得较多数量的脐带血单个核细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或Mesencult TM培养基、细胞接种密度为5×107时可以提高脐带血间充质干细胞的培养效率.     

大鼠骨髓间充质干细胞生长特性和表面标志与培养基中胎牛血清浓度的关系

目的:讨两种浓度胎牛血清培养的不同传代次数的骨髓间充质干细胞探在生长特性及表面标志方面的差异性。方法:实验于2004年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行。取健康Wistar大鼠5只,采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞,然后分别以体积分数为0.1和0.15的胎牛血清的L-DMEM培养基进行贴壁培养,观察原代和传代细胞的形态特征、生长曲线及表面标志CD45,CD11b,CD29和CD44的表达(骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44,造血前体细胞表达CD45和CD11b)。结果:①两种浓度胎牛血清培养细胞均能获得贴壁梭形骨髓间充质干细胞,但体积分数为0.15的胎牛血清原代培养的细胞分裂增殖较快,集落融合较早,传代时间较短(平均10d)。②体积分数为0.1的胎牛血清传代培养第1,2代细胞均质性相对较差,CD45阳性率分别为23.4%,15.4%,CD11b阳性率分别为16.6%,10.3%,高于体积分数为0.15的胎牛血清培养组(P<0.05),至第3代后两组已无差异,CD45和CD11b阳性率均小于5%,而CD29和CD44阳性率均大于95%。③两组的骨髓间充质干细胞生长曲线相似,但体积分数为0.15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞对数生长期峰值出现较早,为第6天,而体积分数为0.1的胎牛血清培养组为第7天。结论:体积分数为0.1和0.15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞在生长特性和表面标志方面存在差异。使用体积分数为0.1的胎牛血清已可满足骨髓间充质干细胞的分离纯化和培养扩增,但要在短期内获得较纯的骨髓间充质干细胞,使用体积分数为0.15胎牛血清优于体积分数为0.1胎牛血清。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

大鼠骨髓间充质干细胞生长特性和表面标志与培养基中胎牛血清浓度的关系

目的：探讨两种浓度胎牛血清培养的不同传代次数的骨髓间充质干细胞在生长特性及表面标志方面的差异性。方法：实验于2004年在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心进行。取健康Wistar大鼠5只，采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞，然后分别以体积分数为0．1和0．15的胎牛血清的L-DMEM培养基进行贴壁培养，观察原代和传代细胞的形态特征、生长曲线及表面标志CD45，CD11b，CD29和CD44的表达（骨髓间充质干细胞表达CD29和CD44，造血前体细胞表达CD45和CD11b）。结果：④两种浓度胎牛血清培养细胞均能获得贴壁梭形骨髓间充质干细胞，但体积分数为0．15的胎牛血清原代培养的细胞分裂增殖较快，集落融合较早，传代时间较短（平均10d）。（爹体积分数为0．1的胎牛血清传代培养第1，2代细胞均质性相对较差，CD45阳性率分别为23．4％，15,4％，CD11b阳性率分别为16．6％，10.3％，高于体积分数为0．15的胎牛血清培养组（P〈0．05），至第3代后两组已无差异，CD45和CD11b阳性率均小于5％，而CD29和CD44阳性率均大于95％。③两组的骨髓间充质干细胞生长曲线相似，但体积分数为0．15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞对数生长期峰值出现较早，为第6天，而体积分数为0．1的胎牛血清培养组为第7天。结论：体积分数为0．1和0．15的胎牛血清培养的骨髓间充质干细胞在生长特性和表面标志方面存在差异。使用体积分数为0．1的胎牛血清已可满足骨髓间充质干细胞的分离纯化和培养扩增，但要在短期内获得较纯的骨髓间充质干细胞，使用体积分数为0．15胎牛血清优于体积分数为0．1胎牛血清。     

不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响

背景:骨髓间充质干细胞在培养过程中,常在基础培养基中添加一定的血清,最常见的是小牛血清和胎牛血清,但这存在着一定的生物安全性件隐患.目的:观察不同血清微环境对大鼠骨髓间充质干细胞体外培养的影响.方法:自成年大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,采用全骨髓贴壁法培养.分别以下列血清微环境培养:自身血清组:分离细胞后原代用含大鼠自身血清的培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养:同种异体衄清组:分离细胞后原代用含同种异体血清的培养基培养,以后用胎牛血清培养基培养;胎牛血清组:分离后用含胎牛血清培养基培养,以后一直用含胎牛血清培养基培养:DMEM组:分离细胞后原代用不含血清的DMEM培养基培养,传代后换用含胎牛血清的培养基培养.在倒置相差显微镜下观察细胞的形态;细胞的贴比率:生长曲线;流式细胞仪观测细胞表面CD11b、CD45和CD90表达.结果与结论:大鼠自身血清微环境及同种异体血清微环境细胞形态均一性、在融合度均高于其他组;首次传代天数低于其他组.24,48,72 h贴比率自身血清组、同种异体血清组和胎牛血清组均高于DMEM组(P＜0.01).在细胞生长曲线中大鼠自身血清组倍增速率最快,其次为同种异体血清组,再者为胎牛血清组,而DMEM组细胞未见明显倍增现象.流式细胞仪检测含血清培养基培养条件下各组第3代细胞CD11b和CD45阳性细胞率均达到98%以上,CD90阳性率小于2%,可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞.但是在无血清微环境条件下,CD11b的阳性率为95.83%、CD90阳性率达2.07%,而CD45阳性率仅为64.79%.可见无血清环境下培养的骨髓间充质干细胞纯度明显低于含血清微环境.提示大鼠自身血清微环境下更有利于骨髓间充质干细胞的贴壁、生长及纯化.     

影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景:脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法.目的:探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素.方法:分别从不同胎龄(≥40周,37周和≤32周),脐血中单个核细胞数量(≥2.5× 109 L-1,< 2.5×109 L-1),不同细胞接种浓度(1×107,1×109,1×1011 L-1),不同体积分数胎牛血清(5%,10%,15%,20%)以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较.结果与结论:脐血间充质干细胞的分离培养成功率为58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低(P < 0.01);脐血中单个核细胞浓度≥2.5×109 L-1组培养成功率高于< 2.5×109 L-1组(P < 0.01);相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关(r = -0.95,P < 0.01);1×1011 L-1组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于1×107,1×109 L-1;体积分数5%FBS组间充质干细胞贴壁速度较其他3组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他3组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组.提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响:通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系.     

离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响

背景：在常规的脐血间充质干细胞密度梯度离心分离过程中,离心管壁有大量单个核贴壁细胞,这些早期的贴壁细胞是否与脐血间充质干细胞的体外培养成功率低存在一定的联系呢？目的：比较4种方法分离人脐血单个核细胞的体外培养成功率,观察离心管贴壁细胞对人脐血单个核细胞体外培养成功率的影响。方法：取足月健康顺产新生儿脐血36份,随机分为4组,每组9份,于采集后6h内分别采用甲基纤维素沉降法（A组）、密度梯度离心分离法（B组）、甲基纤维素联合密度梯度离心分离法（C组）、甲基纤维素联合改良密度梯度离心分离法（D组）分离出单个核细胞,锥虫蓝染色检测细胞活力,用细胞计数板进行细胞计数,调整细胞浓度为1×109L-1～2×109L-1,接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养和传代,相差显微镜下观察脐血单个核细胞的形态。收集第3代脐血单个核细胞,采用细胞计数板进行计数,计算扩增倍数,采用流式细胞仪鉴定细胞免疫表型。结果与结论：36份脐血中,成功分离33份脐血单个核细胞,B组有3份分离失败。33份中共22份原代培养中出现大量贴壁细胞,其中A组8份,B组2份,C组5份,D组7份。9份（27%）培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞,其中A组3份,B组0份,C组1份,D组5份。4组脐血单个核细胞在原代培养5～7d后均可见数量不等的贴壁细胞,呈梭形成纤维样细胞或（和）圆形巨核样细胞。A组与D组于原代培养三四周可见成纤维样细胞集落形成,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,可稳定培养至60～90d形态无明显变化。流式细胞仪免疫检测,第3代脐血单个核细胞不表达或弱表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志,但显著表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志。结果显示离心管贴壁细胞可显著提高脐血单个核细胞的体外培养成功率,而甲基纤维素联合改良的密度梯度离心分离法,可充分回收离心管贴壁细胞,利于脐血单个核细胞的体外扩增和稳定传代。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养条件的优化及其鉴定

背景:相对于骨髓间充质干细胞来说,脐血间充质干细胞是一种较为理想的新的组织工程种子细胞来源,但其培养成功率较低.目的:通过对培养基的选择、离心速度及时间、接种密度、生长因子的选择、首次换液时间等条件进行优化,拟建立一种稳定可靠的人脐血间充质干细胞的体外分离培养方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在白求恩国际和平医院输血科完成.材料:健康足月剖宫产新生儿脐带血20份,由白求恩国际和平医院干细胞中心提供,产妇及其家属均知情同意.方法:无菌条件下采集脐血,采用密度梯度离心法(1500 r/min离心15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞,加入含体积分数为10%人脐带血血清、5 μg,L GM-CSF、15 μg/L白细胞介素3的DMEM/F12培养基,调整细胞密度为1×1010L-1接种于人脐带血血清包被过的塑料培养瓶中,置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度环境下培养,3 d后首次换液,去除未贴壁细胞,以后每隔24 h换液1次.当培养瓶中的细胞生长到80%融合时,胰酶-EDTA混合液消化传代.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞免疫表型.结果:24 h后可见有少量细胞贴壁,48 h后贴壁细胞增多,并出现少量单极梭形细胞,7d后可见细胞形成集落,培养两三周形成平行排列、辐射状或漩涡状细胞界限不清楚的成纤维样细胞,且80%～90%呈现融合.第2代细胞接种后12 h开始贴壁,10 d即可达80%～90%融合.流式细胞仪分析显示,此类细胞稳定地表达相关抗原标记CD29及CD44,但不表达造血细胞系表面标记CD34.结论:实验在体外改良培养条件下成功分离出人脐血间充质干细胞,培养周期较短,细胞纯度较高,贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原.     

体外诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞

背景:脐血间充质干细胞在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的细胞,易于体外培养扩增,但脐血中间充质干细胞的建立时间长、频率低是其主要缺点.目的:体外分离培养脐血间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008 06/2009 01在青岛大学医学院试验室完成.材料:脐血取自足月正常分娩的产妇,由青岛市立医院妇产科提供.方法:采用percoll密度梯度法体外分离培养人脐血间充质干细胞,当细胞汇合90%单层细胞后胰蛋白酶消化传代.取第3代脐血间充质干细胞,以1×106密度接种,当细胞达50%～60%融合时,加入含0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的DMEM成骨细胞诱导液;对照组加入普通低糖DMEM培养液培养.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,细胞生长曲线分析,透射电镜观察细胞超微结构,von Kossa染色和碱性磷酸酶染色检测向成骨细胞诱导分化情况.结果;原代培养的脐血间充质干细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,传代后细胞形态均一,呈梭形旋涡状排列.第3代脐血间充质干细胞高表达CD29,CD44,CD13,不表达CD34.生长潜伏期为两三天,第三四天进入对数增殖期,1个月后进入平台期.胞核呈类圆形或不规则形,核膜清晰,有一两个核仁,染色质较粗,胞质中细胞器丰富,细胞表面有微绒毛.第3代脐血间充质干细胞成骨诱导7 d后逐渐汇合呈铺路石状,14 d后von Kossa染色出现钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阳性;对照组未见钙化结节,碱性磷酸酶染色呈阴性.结论:采用percoll密度梯度法可成功从人脐血中分离出间充质干细胞,并在体外诱导分化为成骨细胞.     

脐血间充质干细胞的体外培养及其表面标志变化

背景:目前有关脐血间充质干细胞的体外培养和大规模扩增方法不一,存在一定困难.目的:观察脐血间充质样干细胞体外分离和培养的方法,并检测其表面分子的变化.方法:取新鲜采集脐带血,用1.077 g/cm3的淋巴细胞分层液,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞.将脐血单个核细胞接种于37℃、含体积分数为5%CO2培养箱内培养.于不同时间观察细胞形态的变化并通过流式细胞仪检测细胞表面分子的表达情况.结果与结论:从脐血中分离出的单个核细胞,培养中先出现大量的造血细胞集落,CFU-GM与BFU-E集落形成最多,集落分别增加了(37.1+2.3)和(10.4+1.7)倍,瑞氏染色显示这些细胞大多数为粒系的集落(80.1±85.2)%,其次为红系的细胞集落(14.2±1.8)%,7d后出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂.扩增后第14天经流式细胞仪分析CD38+细胞为1.64%,CD34+/CD38+细胞为1_71%,CD34+/CD38-细胞为0.55%,PI+细胞为0.05%,Annexin-V+细胞为0.18%.随着培养时间的延长,细胞数目不断增加,培养21 d时,单个核细胞扩增了近7.8倍.,第28天增加了1.71倍.经流式细胞仪分析CD38+细胞为74.32%,CD34+/CD38+细胞为1.61%,CD34+/CD38-细胞为0.24%.提示脐血间充质干细胞可以体外培养.     

中药单体黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:抗氧化剂法及细胞因子法是体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元的2种方法,怎样选择既可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,应用中药下预脐血间充质干细胞的体外纯化、扩增并向神经元细胞分化.目的:观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.设计,时间,地点:随机对照,细胞学体外观察,于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验窒完成.材料:年龄为23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份;黄芩苷,纯度＞95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供:抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.方法:采集胎儿脐带血,肝素抗凝,分离出脐血单个核细胞,调整细胞浓度为1×109L-1,以含体积分数为20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子、干细胞因子的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷:空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇;共培养组添加黄芩苷、β-巯基乙醇.连续培养4周.主要观察指标:①脐血冷冻保存后7,14,21,28dCD34及CD29阳性细胞的表达.②细胞形态学观察.③流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志.④免疫细胞化学染色观察间充质干细胞扩增培养4周后神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的表达.结果:①与冻存前相比,冻存后7,14,21,28 d脐血单个核细胞锥虫蓝拒染率均明显降低(P＜0.05).②细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2-3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起.β-巯基乙醇组、共培养组有少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.⑧培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组最多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组最少,组间两两比较差异具有显著性意义(P＜0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34阳性细胞.④扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P＜0.01).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μ mol/L黄芩苷可促进脐血间充质下细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.     

影响脐血间充质干细胞分离培养的关键环节

背景：脐血中存在间充质干细胞,目前国内外尚未见到对脐血间充质干细胞体外分离、培养及扩增较统一且有效的方法。目的：探讨影响人脐血间充质干细胞成功分离培养的相关因素。方法：分别从不同胎龄（≥40 周,37 周和≤32 周）,脐血中单个核细胞数量（≥2.5×109L-1,〈2.5×109 L-1）, 不同细胞接种浓度（1×107,1×109,1×1011 L-1）,不同体积分数胎牛血清（5%,10%,15%,20%）以及培养瓶是否被胎牛血清包被等方面对人脐血间充质干细胞分离培养成功率进行比较。结果与结论：脐血间充质干细胞的分离培养成功率为 58.3%,且随胎龄的增高而培养成功率降低（P〈0.01）;脐血中单个核细胞浓度≥2.5×109 L-1组培养成功率高于〈2.5×109 L-1组（P〈0.01）;相同容量脐血中单个核细胞数量与胎龄呈负相关（r=-0.95,P〈0.01）;1×1011 L-1 组原代及传代培养的间充质干细胞生长及扩增情况高于 1×107,1×109 L-1;体积分数 5%FBS 组间充质干细胞贴壁速度较其他 3 组略慢,但细胞纯度较高,且细胞传代速度与其他 3 组无明显差别;胎牛血清包被组脐血间充质干细胞原代和传代后的纯度及扩增能力均高于未包被组。提示脐血间充质干细胞分离培养成功率受多种因素的影响：通过选择较低胎龄的胎儿,采集足够量的脐血,以较高的细胞密度接种,培养基中添加较低浓度的胎牛血清,并将培养瓶预先用胎牛血清进行包被,能在体外建立稳定的脐血间充质干细胞培养体系。     

人脐血源性间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化(英文)

背景：与骨髓间充质干细胞相比，脐带血巾的细胞被视为“非常年轻”的细胞，其增殖和分化能力不会随着捐助者的年龄增加而减低，可能是一个极好的骨髓间充质干细胞的替代来源。目的：观察体外诱导脐血间充质干细胞分化成心肌细胞的特点。设计、时间及地点：观察性实验，于2005—03／2007—02在北京世纪坛医院完成。材料：收集获知情同意健康产妇脐血细胞。方法：分离单个核细胞，从中进一步分离间充质干细胞，传代培养至第3代，应用免疫荧光流式细胞仪标记间充质干细胞特异性抗原CD34，CD44和CD90。5-氮胞苷诱导分化4周后，免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反应分别检测心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β-肌球蛋白重链的表达。主要观察指标：心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β肌球蛋白重链的表达。结果：脐血源性间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后，呈现成纤维细胞样形态和克降增殖特点。免疫分型与骨髓来源间质干细胞一致，且免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反可检测到肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β-肌球蛋白重链的表达。结论：脐血源性间充质干细胞能够被诱导分化成心肌样细胞，并显示为心肌细胞的表观特征。     

多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:肝细胞自身增殖能力有限,近几年关于各类干细胞向肝细胞分化的成功报道很多,包括胚胎干细胞、骨髓细胞、胰腺干细胞、神经干细胞及各种来源的间充质干细胞等.目的:探讨应用多种生长分化因子体外联合诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化的可行性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2006-04在暨南大学医学院血液病研究所完成.材料:胎儿脐带血来源于顺产及剖腹产的健康孕妇,由暨南大学第一附属医院产科提供,产妇均签署知情同意书.方法:体外分离培养人脐血间充质干细胞,胰酶-EDTA消化传代.取传至第3代细胞,按5×10~4/cm~2接种,48 h后去除原培养基,PBS洗涤后,第1阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、ITS的F12培养基诱导2周,第2阶段用含地塞米松、肝细胞生长因子、致瘤素M、ITS的F12培养基继续诱导2周.主要观察指标:流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标志的表达,RT-PCR检测肝细胞相关基因的表达,免疫荧光染色检测肝细胞相关蛋白的表达,透射电镜观察细胞超微结构.结果:培养的细胞不表达造血细胞系标志CD34,CD45,CDl4;亦不表达CD54,CD49f,HLA-DR;部分表达内皮细胞标志CD106;强表达CD29,CD44及CDl3.诱导4周后,甲胎蛋白、白蛋白、ck-18及tat基因均呈阳性表达;免疫荧光染色显示细胞浆中甲胎蛋白、白蛋白、ck-18均呈阳性;细胞胞浆中出现脂滴及糖原的沉积,细胞表面有微绒毛,出现双核细胞,初步具备了肝细胞的超微结构特征.结论:联合应用地塞米松、肝细胞生长因子、表皮生长因子、致瘤素M及ITS等多种生长分化因子,可在体外成功诱导人脐血间充质干细胞向肝样细胞分化.