视交叉上核脑片诱导NIH/3T3成纤维细胞中分子时钟的节律性表达

目的 研究视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)脑片对共培养的NIH/3T3成纤维细胞中分子时钟的诱导作用.方法 10d龄SD大鼠,取SCN脑片,与NIH/3T3成纤维细胞共培养.连续24h,间隔6h收获细胞,抽提细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测时钟基因Per1和Rev-erbα mRNA表达规律.结果 10张SCN脑片与NIH/3T3细胞共培养6d可诱导细胞中Rev-erbα和Per1节律性表达(P<0.01);Rev-erbα和Per1的表达高峰分别为CT5和CT11.减少共培养时间至2d或脑片数量至2片,仍可诱导Rev-erbα的节律性表达(P<0.05).而诱导per1的节律性表达至少需要6d共培养时间和6张脑片(P=0.031).结论成功建立SCN脑片与细胞共培养模型,为研究SCN对外周组织细胞的调控打下基础,Rev-Erbα和Per1的波动表达并非同时发生,前者对SCN信号更加敏感.     

电针对荷乳腺癌小鼠视交叉上核Period基因表达的影响

目的观察电针对荷乳腺癌小鼠视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)内Period基因的2个亚型Per1、Per2mRNA的表达及蛋白含量的影响,探讨荷乳腺癌小鼠电针后自发性活动节律变化的分子调控机制。方法将18只C57BL/6J雄性小鼠随机分为空白组、模型组、电针组3组,每组6只。LD驯化10d后关闭光源,使小鼠处于自由运行状态(DD状态)。DD驯化10d后将含有MA-782小鼠乳腺癌细胞株的混悬液接种于模型组及电针组小鼠左侧腋下,建立荷瘤小鼠模型,成瘤后继续监测节律。7d后电针组小鼠进行电针干预,在CT12时相点针刺百会穴和长强穴,连续电针3d;空白组和模型组小鼠均在相同时相点CT12采用相同的方法捆绑固定,不予电针刺激。第3次电针后2h处死动物,切取脑部SCN组织,采用实时荧光定量RT-PCR法测定各组小鼠SCN内Per1、Per2mRNA表达量,采用Western Blot法测定SCN内PER1、PER2蛋白含量。结果荷瘤小鼠SCN内Per1、Per2mRNA表达水平与空白组相比有明显降低趋势,无统计学意义(P0.05),电针后,mRNA表达量较模型组有明显升高趋势,尤以Per2的差异明显(P0.05)。荷瘤小鼠蛋白表达量与空白组及电针组相比均有明显差异,其差异具有统计学意义(P0.05)。结论在CT12时相点电针百会和长强穴可以升高荷乳腺癌小鼠SCN内Per1、Per2mRNA的表达水平及其蛋白含量,提示电针对SCN内Per1、Per2等基因的作用,可能更多的是在转录后的翻译水平上,因为蛋白是最终执行功能的分子,这可能是电针调整荷瘤动物节律的重要机制之一。     

大鼠视交叉上核内主要的三种肽能神经元的分布

为研究视交叉上核内主要肽能神经元的分布情况,选用健康成年雄性ＳＤ大鼠５只,以免疫组化双重及三重标记技术。对大鼠视交叉上核（ＳＣＮ）内血管活性肠多肽（ＶＩＰ）,精氨酸血管加压素（ＡＶＰ）及生长抑素（ＳＯＭ）样三类神经细胞群的分布进行了观察。免疫染色以ＡＢＣ法进行,呈色底物采用ＤＡＢ、ＴＭＢ及４－氯－１－萘酚,结果显示：在ＳＣＮ头中尾三段,三种肽能神经元的数量及分布均存在差异,ＶＩＰ与ＡＶＰ样细胞群之     

视交叉上核中褪黑素受体mRNA的昼夜节律性表达

目的：探讨视交叉上核（SCN）中不同亚型褪黑素受体mRNA的表达节律。方法；采用竞争性RTPCR法定理检测不同时点SCN中褪黑素受体基因的mRNA表达。结果：两种褪黑素受体亚型mRNA的表达都具有昼夜节律性，但节街参数不同。结论：光照影响MT1的mRNA表达；两种褪黑素亚型受体可能具有不同的生物学功能。     

人视交叉上核加压素基因表达的昼夜节律改变

目的　探讨人视交叉上核加压素mRNA表达与昼夜节律的关系。方法　采用原位杂交和生物图像分析技术定量分析 2 5例受试者 ,视交叉上核加压素mRNA表达水平。结果　人视交叉上核加压素mRNA表达呈现明显的昼夜变化 ,白天加压素mRNA表达水平比夜间高 40 %。结论　人视交叉上核加压素mRNA的昼夜节律性表达可能是在基因水平调控人体生物节律的重要机制之一。     

辐射对大鼠视交叉上核c—fos表达的影响

实验观察到视交驻小核（ＳＣＮ）中ｃ－ｆｏｓ的表达具有昼夜节律性，０．５Ｇｙγ射线辐照大鼠后，其ＳＣＮ中Ｆｏｓ蛋白表达增高，其中以光照期更为明显，辐照后仍存在昼夜节律性。     

褪黑素对大鼠下丘脑视交叉上核神经元放电的影响

目的 观察内源性和外源性褪黑素对大鼠下丘脑视交叉上核神经元自发放电的影响。方法 在昼夜周期的不同时相（主观白天的CT4－8和主观黑夜的CT16－20），采用松果腺摘除（PINX）和氨甲蝶呤（MTX）抑制褪黑素（MEL）合成的方法，分别去除内源性MEL的主要来源后，观察大鼠SCN神经元自发放电的变化以及侧脑室注射外源性MEL的作用。结果 （1）不管是主观白天还是主观黑夜，SCN神经元存在规则放电、不规则放电和簇状放电3种形式的自发放电，摘除松果腺和抑制MEL合成，对这3种放电形式未见明显影响；（2）SCN神经元的自发放电频率在主观白天高，在主观黑夜低。摘除松果腺和抑制MEL合成后，放电频率尽高夜低的节律性消失，放电频率有所提高；（3）SCN神经元对外源性MEL起抑制反应，高亲和力（ML－1）受体拮抗剂luzindole能阻断这种抑制效应，而低亲和力（ML－2）受体拮抗剂哌唑嗪（prazosin)则不能，提示MEL的抑制作用是由ML－1受体介导的。结论 松果腺作为大鼠昼夜节律组构中的一个调整器，分泌MEL并由ML－1受体介导，对SCN神经元自发放电有抑制性的调节作用。     

老年大鼠下丘脑薄片视交叉上核神经元自发放电的昼夜节律性

目的　研究老年大鼠下丘脑薄片视交叉上核神经元自发放电的节律性。方法　采用大鼠离体下丘脑薄片记录视交叉上核 (SCN)神经元自发放电的方法 ,观察衰老对SCN神经元自发放电的影响。结果　青年组和老年组大鼠SCN神经元自发放电频率均呈现白昼高、夜间低的节律 ,其高峰出现在CT 6～ 8,青年组频率为 8.30± 1.12Hz,老年组为 6 .5 2± 1.0 5Hz,两组存在显著差异 (P <0 .0 5 ) ;低谷在CT18～ 2 0 ,两组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。在白昼 ,青年组平均放电频率为 6 .5 7± 0 .96Hz,老年组为 5 .39± 0 .74Hz,两组存在显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;而在夜间 ,两组平均放电频率无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论　老年大鼠SCN神经元自发放电的昼夜节律的振荡幅度在衰减。     

稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系的建立

目的:构建稳定表达GFP-V12Rac1(组成型活化Rac1的GFP融合蛋白)的NIH3T3细胞系?方法:构建表达GFP-V12Rac1和GFP的质粒和慢病毒载体,通过慢病毒感染和流式分选获取稳定表达目的基因的NIH3T3细胞系?通过铺展实验检测GFP-V12Rac1的功能,通过Boyden chamber迁移实验检测细胞的运动能力?结果:建立了稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系及对照细胞系;稳定表达的GFP-V12Rac1可促进NIH3T3细胞的铺展,同时,构建的细胞系具备趋化运动能力?结论:用慢病毒载体可构建稳定表达GFP-V12Rac1的NIH3T3细胞系,外源基因表达产物功能正常且细胞系具备趋化能力?该细胞系可作为研究Rac1活性定位机制的可靠细胞模型?     

逆转录病毒转染的小鼠IL－3基因在NIH／3T3细胞中的表达

将小鼠白细胞介素３（ＩＬ－３）ｃＤＮＡ重组到逆转录病毒载体ｐＮ２Ａ质粒上，用电穿孔法将此重组子转染包装细胞系（ＰＡ３１７），经用Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）选择培养基筛选，得到产病毒效价为每ｍｌ５×１０４～２×１０５ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）的Ｇ４１８抗性细胞克隆。然后取其培养上清液转染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞。通过检测被病毒转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞培养上清液对小鼠骨髓细胞的增殖反应（ＭＴＴ法）和促分化作用（ＣＦＵ培养法），表明转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞克隆能分泌ＩＬ－３。此结果为进行ＩＬ－３转基因治疗研究奠定了实验基础。     

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体，探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响。方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3-Nox1，并将其转染NIH3T3细胞，采用RT-PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达，检测细胞活性氧和细胞活力。结果RT-PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA，细胞中的活性氧水平明显升高，同时对As2O3细胞毒作用更加敏感。结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3-Nox1转染细胞后可有效表达Nox1，使活性氧水平升高，并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性。     

转染DJ-1和DJ-1L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的 在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究,为进一步建立DJ-1和DJ-1L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础.方法 采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段,采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变,分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pEGFPDJ-1、DEGFP-DJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测.结果 pEGFP-DJ-1、pEGFPDJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后,分别获得6、2、9个阳性细胞克隆,RTPCR及westem blot 方法进行tau基因表述检测,结果均显示pEGFP-DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP-C3质粒转染组,而pEGFP-DJ-1L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP-C3质粒转染组,实验结果统计学分析均具有明显差异(P＜0.05).结论 在转录水平及蛋白质水平,DJ-1基因使tau基因的表达下降,而DJ-1L166P使tau基因表达上升.在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性.     

miRNA在中波紫外线照射的NIH3T3细胞中的差异表达谱

目的应用miRNAs芯片筛选中波紫外线（UVB）照射的NIH3T3细胞表达miRNAs,并寻找差异表达miRNAs调控的靶基因。方法 miRNAs微阵列技术筛选UVB照射的NIH3T3细胞差异表达miRNAs,同时运用miRNAs特异的引物组对差异表达的miRNAs进行荧光定量RT-PCR验证。结果 NIH3T3细胞受不同剂量UVB照射后,MTT结果显示细胞生存率明显下降。miRNAs芯片结果显示,实验组细胞与对照组细胞差异表达的miRNA共30个（占11%）,其中27个表达上调,3个表达下调。mmu-miR-365和mmu-miR-21显著上调,而mmu-miR-465在不同的时间点都下调。其差异表达均在2倍以上;mmu-miR-let-7a、mmu-miR-24、mmu-miR-376b和mmu-miR-21的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致。结论 miRNA在UVB照射的NIH3T3细胞中有差异表达,提示miRNA可能参与UVB照射后NIH3T3细胞内的多种信号调控途径。     

SARS揭示新发传染病对人类健康的威胁

目的建立具有潮霉素B（hygromycin B）抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因（pTRE2-human-Ins）的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层.方法通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因（hyg）的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和Southern blot鉴定.结果经300μg/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆.抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southern blot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞.结论本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因（pTRE2-human-Ins）转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础.     

挥发性有机化合物致NIH/3T3细胞形态转化的作用

目的探讨挥发性有机化合物(VOCs)中两种主要成份苯、甲醛的联合致细胞转化活性。方法采用细胞灶法观察甲醛与苯联合致小鼠NIH/3T3细胞的形态学转化作用。结果苯、甲醛及苯和甲醛联合染毒组均有细胞转化灶形成,其形成率均呈剂量依赖关系。联合作用分析显示:苯25μg/mL+甲醛25μg/mL,苯25μg/mL+甲醛50μg/mL,苯50μg/mL+甲醛25μg/mL,苯50μg/mL+甲醛50μg/mL,两化合物联合作用转化率实测值分别为3.6%、5.8%、5.7%和7.6%。而预期转化率分别为3.5%、5.6%、5.6%、7.7%。说明在等剂量原则下,苯、甲醛单独染毒的转化细胞灶形成率之和与两化合物同时染毒的转化细胞灶形成率非常接近;析因分析表明两者间无交互作用(F=0.07,P>0.05)。结论苯、甲醛具有细胞转化活性,二者联合作用类型呈相加作用。     

甲胎蛋白对NIH3T3细胞和人肝癌Be17402细胞增殖的促进作用

目的观察甲胎蛋白对细胞增殖的影响。方法用从人脐带血清中提取的甲胎蛋白，作用于体外培养的NIH3T3细胞和人肝癌Be17402细胞，运用MTT染色计数法，细胞周期时相测定和3H脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法等指标检测细胞增殖状况。结果甲胎蛋白(10～80 mg．L(-1))作用24 h后，对NIH3T3细胞、人肝癌Be17402细胞均有不同程度的促增殖作用，甲胎蛋白的单克隆抗体能阻断这种作用。结论甲胎蛋白是促进某些新生细胞或肿瘤细胞增殖的内源性物质。     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.