诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的 观察乳鼠心肌细胞条件培养液、SalB 、5-氮胞苷(5-aza)及SalB联合5-aza体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.方法 分离培养及鉴定大鼠MSCs,培养乳鼠心肌细胞,收集条件培养液对其进行分组诱导:①SalB(终浓度为250 μg/L),②5-aza组(终浓度为10 μg/L),③SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L),④乳鼠心肌细胞条件培养液,⑤未加诱导剂的阴性对照组.选取MSCs进行诱导,诱导周期为4 w.倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)表达,实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4 mRNA的相对表达量.结果 细胞形态学显示,诱导后的MSCs体积增大,增殖减慢,并出现肌管样结构;免疫细胞化学结果显示,诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT,与5-aza组相比,SalB组和条件培养液两组蛋白表达较低,SalB联合5-aza组蛋白表达升高;实时荧光定量RT-PCR结果显示除阴性对照组外,其他四组表达心肌分化早期基因,SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他三组.结论 SalB联合5-aza诱导MSCs表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT;上调心肌早期基因NKX2.5、GATA-4mRNA的表达,证实其能够向心肌细胞分化能力;条件培养液不能上调心肌细胞的早期基因和蛋白,不能诱导其分化.     

流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响。方法贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10μmol/L作用24 h为最佳诱导浓度。通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白ImRNA的表达。结果骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性。经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力最明显。但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大。结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷。     

整合素连接激酶过表达促进猪骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨提高骨髓间充质干细胞(BMMSC)向心肌样细胞分化的方法,观察整合素连接激酶(ILK)过表达促进BMMSC向心肌样细胞分化的效果。方法用包含人野生型ILK c DNA和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒载体(Ad-GFP-ILK)转染体外培养的猪BMMSC,诱导其在BMMSC中高表达,并用高浓度(50μmol/L)的5-氮杂胞苷(5-AZA)刺激诱导BMMSC向心肌样细胞分化。实验分为空白对照组(N组)、Ad-GFP转染组(Ad组)、5-AZA诱导组(5-AZA组)、Ad-GFP-ILK转染组(ILK组)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;培养至2周、4周时采用免疫细胞化学染色检测心肌肌钙蛋白I(c Tn I)和α辅肌动蛋白(α-actinin)表达;4周时提取蛋白,Werstern blot检测c Tn I、缝隙连接蛋白43(CX-43)、Caspase-3和ILK的表达。结果 MTT检测结果显示Ad组、5-AZA组比N组、ILK组细胞活力明显减弱(P0.05);但Ad组、5-AZA组之间,N组、ILK组之间比较均无统计学差异(P0.05)。细胞培养至2周时,免疫细胞化学染色显示,5-AZA组、ILK组开始表达心肌特异性标记物c Tn I和α-actinin,而N组、Ad组均没有明显阳性表达。Western blot结果显示ILK蛋白在ILK组表达较其他组明显升高(P0.05)。与N组、Ad组比较,5-AZA组、ILK组c Tn I表达明显升高(P0.05);而5-AZA组、ILK组之间,N组、Ad组之间则没有差异(P0.05)。CX-43在4组间的表达趋势与c Tn I相同。Caspase-3表达在Ad组、5-AZA组较其他组明显升高(P0.05)。结论 ILK过表达能促进BMMSC向心肌样细胞分化,其分化效率和较高浓度的5-AZA体外刺激无差异。ILK过表达对细胞增殖活力无影响,且有一定的抗凋亡作用。     

丹酚酸B干预内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞向心肌分化早期基因表达的影响

目的 探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞(EPCs)对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌分化早期基因表达的影响.方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs;免疫细胞化学法(CD34/CD133/CD44)分别鉴定两种细胞.结扎大鼠左冠状动脉,制作大鼠AMI模型,42只大鼠随机分为假手术组,模型组,BMSCs组,EPCs+BMSCs组,其中治疗组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BMSCs混合,在大鼠AMI区周边分五点注射.RT-PCR检测心肌分化早期基因Nkx2.5、GATA-4表达.结果 细胞移植4 w后,EPCs+BMSCs组心肌Nkx2.5、GATA-4表达量分别为2.256±0.524和1.567±0.287,与对照组比较差异显著.结论 丹酚酸B预处理的EPCs联合BMSCs的移植上调了BMSCs向心肌分化过程中Nkx2.5、GATA-4基因的表达,对心肌细胞的数量增加有重要影响,从而有可能改善心功能.     

骨髓间充质干细胞向心肌分化的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为心肌样细胞的能力,用于心肌补片治疗心肌梗死的研究。方法:分离C57/BSL小鼠BMSCs,全培养差速贴壁法,经过贴壁培养至第3代,流式细胞仪鉴定细胞表面标志(CD34、CD45、CD73、CD90),经10μmol/L的5-氮杂胞苷诱导细胞,24 h后更换完全培养基培养,2 w后进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察心肌钙蛋白T(cTnT)和连接素蛋白43(CX43)的表达。结果:流式鉴定结果显示CD34、CD45阴性,CD73强阳性,CD90弱阳性。免疫荧光染色显示,诱导后细胞高表达心肌细胞特异性蛋白cTnT,连接素蛋白CX43表达水平明显增加。结论:5-aza可以诱导BMSCs大量表达心肌特异性蛋白cTnT和细胞连接素蛋白(CX43),干细胞分化为心肌样细胞,为干细胞移植治疗小鼠心梗提供种子细胞。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的: 研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSC）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法: 采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200 ml/L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSC 24 h后继续培养。培养4周,用免疫细胞化学染色法检测肌系标记抗原:α-肌动蛋白（α-actin）及心肌细胞特异性标记抗原:肌钙蛋白T（cTnT）;在透射电镜下观察细胞的超微结构。结果: MSC经5-Aza诱导分化后,可表达α-actin和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSC中均未见表达。透射电镜可观察到肌丝等心肌细胞的特异性结构。结论: 5-Aza可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

不同浓度的5-氮胞苷对人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的探讨不同浓度的5-氮胞苷（5-aza）对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向心肌细胞分化的影响。方法抽取人胸骨骨髓35 ml,采用密度梯度离心法和贴壁法进行hMSCs的分离培养。于第3代生长状态良好的hMSCs中,分别加入3、5、10、20和40μmol/L 5-aza处理24 h,更换新鲜的培养基继续培养;对照组的细胞始终用完全培养基培养。光镜下动态观察细胞形态的变化,4周后用免疫组化染色法检测心肌肌钙蛋白I（cTnI）、连接蛋白43（Cx43）的表达。结果经5-aza诱导处理后,hMSCs的形态变长、增大,排列更加紧密、整齐。免疫组化染色法检测表明,对照组与3μmol/L 5-aza组cTnI、Cx43的表达呈阴性,5、10、20和40μmol/L 5-aza组cTnI和Cx43的表达均呈阳性。在一定范围内（<10μmol/L的5-aza）,随着5-aza浓度的增加,hMSCs向心肌细胞的转化率逐渐增高;但高浓度（>10μmol/L）5-aza的毒性可造成细胞大量死亡。结论hMSCs经适当浓度的5-aza处理后,可向心肌细胞分化,10μmol/L的5-aza为最适诱导浓度。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的体外条件研究

目的研究体外条件下大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)向心肌样细胞分化的影响因素。方法采用免疫细胞化学方法检测rMSCs表面CD71、SH2、CD31、 CD34、CD45以及5-氮胞苷诱导后心肌细胞特异性蛋白α-sarcomeric actin、troponin T的表达;细胞计数法计算rMSCs倍增时间;观察不同传代数、不同时间及不同剂量5-氮胞苷、依地酸二钠(ethylenediami- netetraacetic acid tetrasodium salt,EDTA-2Na)及无血清培养液对rMSCs分化潜能的影响。结果rMSCs 表达CD71、SH2,而CD31、CD34和CD45呈阴性表达。第3代rMSCs经10μM 5-氮胞苷诱导后细胞呈现克隆、肌管等结,构,表达α-sarcomeric actin、troponin T等心肌细胞特异蛋白,细胞倍增时间为(100 ±8)h。第1、12代rMSCs诱导后细胞形态未发现明显改变、未出现上述结构,细胞倍增时间分别为 32±4 h、38±3 h。1、15、100μM 5-氮胞苷刺激12-72 h,2周后未发现克隆或肌管结构。5-氮胞苷刺激,以1 mM EDTA处理以及无血清培养液培养rMSCs形成的克隆、肌管结构不典型,α-sarcomeric ac- tin、troponin T表达较弱。结论rMSCs具有体外分化潜能,并且受细胞传代数、细胞倍增时间、诱导浓度和时间、细胞外钙离子浓度及培养条件等因素的影响。     

5-氮胞苷浓度对体外骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞的影响

目的探讨不同浓度5-氮胞苷(5-aza)体外诱导小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的可能性及其对细胞扩增速度的影响.方法10ml骨髓,1.077g/ml Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(MNCs),第2代传代细胞分别加入3,5,10μmol/L浓度5-aza化学诱导24h,与对照组连续培养4周,细胞爬片免疫荧光法鉴定结蛋白desmin及心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)的表达,电镜观察诱导细胞的超微结构变化.结果5-aza化学诱导后MSCs形态变长、增大,排列更加紧密、整齐,5和10 μmol/L组可见较多的多核细胞,部分管状结构,诱导率分别为36%和31%,无显著性差异;3μmol/L组上述变化的细胞极少,3种浓度及对照组4周后细胞扩增数量分别为(3.81±0.40)×106、(3.76±0.62)×106、(3.67±0.80)×106及(2.90±0.21)×106,10μmol/L组增殖速度明显减慢(P＜0.05).各组诱导后的细胞均未见自发搏动.免疫组化提示desmin及cTnI表达阳性,5和10μmol/L组电镜下出现肌丝样结构、心房颗粒及细胞间的缝隙连接.结论小型猪MSCs经5、10 μmol/L 5-aza化学诱导可分化为心肌样细胞,其中5 μmol/L5-aza不仅可以诱导心肌样细胞而且对细胞增殖速度影响小.     

大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究

目的：比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞（MSC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同。方法：采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血骨髓的单个核细胞（MNC），收获MSC传代培养，流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化，免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异。定向诱导后，2种细胞均表达Nestin、NSE，但GFAP阴性。结论：大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者诱导分化为神经元碰细胞的能力无显著差异。胎血应是MSC的又一来源。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的基因表达

目的:观察5-氮胞苷(5-aza)在体外诱导人骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)、α-骨骼肌动蛋白(α-skeletal actin)、肌球蛋白轻链-2v(MLC-2v)、锌指结构转录因子(GATA-4)和心脏特异同源转录因子(Nkx2.5)基因表达。方法:取非血液疾病的5例胸科手术患者术中已切除掉的肋骨,抽取骨髓。利用淋巴细胞分离液行密度梯度离心法和差异贴壁法进行分离、提纯骨髓间充质干细胞,并进行培养扩增。用流式细胞仪对第2代的骨髓间充质干细胞细胞表面抗原进行测定。应用10μmol/L5-aza对第2代的骨髓间充质干细胞诱导24h,于诱导后1,2,3及4周,用反转录-聚合酶链反应检测ANP、BNP、α-skeletal actin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2.5基因表达。结果:3份第2代骨髓间充质干细胞样本重复测定,表达CD29,CD44,不表达CD34,CD45。以5-aza诱导培养24 h后,骨髓间充质干细胞形态和排列方式发生明显变化,诱导1周后,细胞体积增大,多呈长梭行,平行排列;诱导2周后,细胞变为短柱状,突起位于2端,相邻细胞的突起紧密接触;诱导3周后,短柱状细胞的突起相互连接,部分细胞可见类肌管样结构;诱导4周后,细胞体积变小,可见由几个细胞连接形成的多核肌管样结构。诱导组细胞ANP、BNP、α-skeletal actin、MLC-2v、GATA-4和Nkx2.5的聚合酶链反应产物凝胶电泳呈阳性,对照组为阴性,诱导组基因表达量均随着时间延长逐渐增加。结论:5-aza可诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化,其处于祖心肌细胞和分化的心肌细胞之间,并可能具有心肌细胞的功能。     

骨髓间充质干细胞诱导为心肌样细胞的诱导剂概况

干细胞移植治疗疾病一直是研究的热点,通过诱导剂将骨髓间充质干细胞诱导为心肌样干细胞治疗心肌梗死更是心血管领域研究的热门话题。用于诱导骨髓间充质干细胞的诱导剂品种很多,现对目前常用的诱导剂做一个总体的评述。     

Klotho基因转染骨髓间充质干细胞移植对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的观察Klotho基因(抗衰老基因)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响。方法分离、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞。慢病毒介导Klotho转染至BMSC中,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BMSC中Klotho mRNA的表达。制备大鼠慢性心力衰竭模型,随机分为正常对照组、模型对照组、增强型绿色荧光蛋白-BMSC组(EGFP-BMSC组)、EGFP-Klotho-BMSC组。细胞移植28天后多普勒超声检测心功能,荧光显微镜观察细胞存活及分布,HE染色观察心肌组织病理变化。Masson染色检测心肌胶原沉积含量和心肌纤维化程度。结果 Klotho转染BMSC后,BMSC中Klotho mRNA表达明显增多(P0.05)。移植28天后超声心动图结果显示,与EGFP-BMSC组及模型对照组比较,EGFP-Klotho-BMSC组左心室射血分数(LVEF)提高(P0.05)。EGFP-BMSC组及EGFP-Klotho-BMSC组心肌纤维化程度较模型对照组减轻(P0.05),EGFP-KlothoBMSC组较EGFP-BMSC组心肌纤维化改善更为明显(P0.05)。结论 Klotho基因联合BMSC治疗可进一步抑制心肌纤维化,减少心肌间质胶原沉积,改善心功能。     

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的：研究5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导体外骨髓间充质干细胞（marrow measenchymal stem cells，MSCs）向心肌细胞发展的作用及其机制。方法：从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs，培养传代后用不同浓度的5-aza诱导，倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期改变；MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响；免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达；RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果：5-aza对MSCs有抑制增殖的作用（P〈0．05）；在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化；免疫细胞化学检测结果表明，MSCs的经5-aza诱导14d，肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高（P〈0．01）；PT—PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显，而对照组未见表达。结论：MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞，这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导为心肌细胞的观察

体外分离培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs),传代纯化后取第3代接种于培养板上,分别加入5、10、20 μmol/L 5氮胞苷(5-aza),孵育12、24、48 h后,更换新鲜培养基继续培养.光镜下动态观察细胞变化,4周后免疫组化染色法检测肌钙蛋白(cTnI)、连接蛋白43(Cx43)表达.结果经5-aza诱导后,hMscs形态变长、增大,排列整齐;除对照组外,其他各组hMscs的cTnI、Cx43表达均阳性;10μmol/L 5-aza孵育24 h hMscs转化率明显增加(P<0.05).提示hMscs体外经5-aza诱导后,可向心肌细胞分化;10μmol/L 5-aza诱导24 h是最佳诱导条件.     

不同浓度5-氮胞苷对小鼠骨髓间充质干细胞的诱导作用

目的探讨5-氮胞苷（5-aza）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的最佳诱导浓度。方法分离2周龄小鼠胫骨、股骨,冲洗出骨髓,采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养的方法获得MSCs。取传第2代MSCs培养48h后分别加入3、5、10、20、50μmol／L5-aza进行诱导,设为3、5、10、20、50μmol／L组。继续培养3周后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测心肌特异性蛋白α-actin表达。结果5-aza3、5μmol／L组α-actin阳性率分别为0．88％±0．52％、2．61％±0．96％,两组细胞形态均无明显改变;10μmol／L组可见细胞突起回缩,α-actin呈强阳性表达,阳性率为30．57％±1．82％;20、50μmol／L组细胞已脱落。结论MSCs经5-aza体外诱导分化,可获得形态类似、表达心肌特异性蛋白的心肌样细胞,且以10μmol/L浓度诱导作用最佳。     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

不同浓度转化生长因子β1体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的:研究不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的能力。方法:取SD大鼠四肢骨骨髓,密度梯度离心法分离大鼠BMSCs,以TGF-β1 5μg/L(低剂量组)、10μg/L(高剂量组)对第3代BMSCs进行体外诱导,未诱导的骨髓间充质干细胞做对照。相差显微镜观察细胞形态,MTS试剂盒检测细胞活性。分化14天后,流式细胞仪分析三组细胞DNA周期;免疫荧光法鉴定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin,c Tn I)、心肌平滑肌肌动蛋白(aactin)和心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的表达率。结果:三组细胞均呈对数生长趋势,诱导组细胞数量增长较对照组缓慢(P0.05),诱导组之间比较,细胞增长无明显差异。分析细胞DNA周期显示:诱导14天后,对照组增殖指数明显高于诱导组(P0.05),不同浓度诱导组之间比较,细胞增殖指数无明显差异。免疫荧光法检测结果显示:诱导14天后,诱导组细胞均部分表达c Tn I、α-actin及MHC,TGF-β1高剂量组细胞转化率高于低剂量组;对照组均不表达c Tn I、α-actin及MHC。结论:10μg/L TGF-β1与5μg/L TGF-β1比较,更有效促进BMSCs体外向心肌样细胞分化,且对细胞增殖活性无明显影响。     

慢病毒载体过表达Klotho基因对骨髓间充质干细胞在慢性心衰大鼠心肌中存活率的影响

目的 探讨以重组慢病毒为载体转染Klotho基因（抗衰老基因）对SD大鼠心肌中骨髓间充质干细胞（bone marrow Mesenchymal stem cells,BMSCs）存活率及其可能的机制。方法 全骨髓贴壁培养法体外培养SD大鼠BMSCs;以重组慢病毒为载体将KLotho基因转染至大鼠BMSCs,用RT-PCR鉴定BMSCs中Klotho基因mRNA的表达;腹腔连续注射异丙肾上腺素建立SD大鼠心衰模型;并随机分为3组,即EGFP-Klotho-BMSCs组（慢性心衰SD大鼠尾静脉注射Klotho基因修饰的BMSCs）,EGFP-BMSCs组（慢性心衰SD大鼠尾静脉注射空载慢病毒转染的BMSCs）,生理盐水组（慢性心衰SD大鼠尾静脉注射与等容积的生理盐水）。细胞移植治疗4周后,在荧光显微镜下观察各组大鼠心肌组织绿色荧光蛋白的表达情况,RT-PCR检测各组大鼠心肌组织中Klotho基因的表达。结果 ①全骨髓贴壁法成功培养及传代BMSCs;②以重组慢病毒为载体成功将Klotho基因转染到BMSCs,荧光显微镜下第4天的细胞转染效率达70%~80%以上;③RT-PCR结果表明与EGFP-BMSCs组比较,EGFP-Klotho-BMSCs组的BMSCs中Klotho基因表达明显增多（P<0.05）;④干细胞移植4周后,EGFP-Klotho-BMSCs组和EGFP-BMSCs组大鼠心肌组织中仍可见EGFP绿色荧光表达,且EGFP-Klotho-BMSCs组心肌组织中绿色荧光表达数量较EGFP-BMSCs组显著增多。结论 转染Klotho基因可有效提高BMSCs在SD大鼠心肌中的存活率,其可能的机制为Klotho基因具有抗细胞凋亡及改变心肌内环境的作用。