大鼠视觉发育可塑性关键期终止前后视皮层神经元AMPA受体GluR2亚基表达的变化

目的 为了探索视觉发育可塑性关键期终止机制,在可塑性关键期终止前后,对正常大鼠视皮层内AMPA受体GluR2亚基表达的发育变化进行了研究.方法 用免疫荧光标记技术,标记生后3-8周的正常大鼠视皮层内AMPA受体GluR2亚基表达.结果 (1)GluR2免疫反应阳性神经元大部分出现在视皮层Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层内,并且GluR2主要在锥体神经元的胞体和树突表面表达,Ⅳ层内少量非锥体神经元表面有微弱的GluR2标记;(2)视皮层Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层内,GluR2阳性神经元数量随发育逐渐增加,生后5周时达顶峰,随后保持稳定的水平;(3)视皮质Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层内,GluR2免疫反应的平均光密度值随发育逐渐增加,生后6周时达顶峰,随后保持稳定的水平.结论 可塑性关键期高峰到终止阶段,大鼠视皮层II-III层和V-VI层内GluR2表达逐渐增加,关键期终止时达顶峰;包含GluR2亚基的AMPA受体可能通过稳定突触结构参与视觉可塑性关键期的终止.     

单眼形觉剥夺大鼠视皮层α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸受体GluR2的表达及其变化对微小兴奋性突触后电流的影响

目的 观察单眼形觉剥夺大鼠视皮层中α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic add,AMPA)受体的表达变化及其对突触后电流mEPSCs的影响,为研究其在视觉发育可塑性中的作用及机制做准备.方法 实验研究.取14 d龄健康Wistar大鼠40只,随机分为2组(Ⅰ、Ⅱ),每组20只,再随机分成A、B两组,每组10只.对实验组(Ⅰ组)行单眼形觉剥夺,正常饲养1周后对Ⅰ A组及ⅡA组常规心脏灌注、固定、切取视皮层,对组织切片行免疫组织化学法显色,显微镜观察AMPA受体GluR2的表达情况并进行图像分析,同时对Ⅰ B组及ⅡB组应用脑片膜片钳全细胞记录技术,获得大鼠视皮层神经元的细胞内微电极记录,记录突触后电流mEPSCs的变化.结果 AMPA受体GluR2在正常发育组视皮层中的表达较单眼形觉剥夺组视皮层中的表达水平高,差异有统计学意义(P<0.01).脑片膜片钳记录结果显示:AMPA受体介导的初级视皮层2/3层的锥体神经元的微小突触后兴奋性电流(mEPSCs)幅值增高.结论 大鼠出生后视皮层AMPA受体GluR2的水平受视觉刺激而发生变化,且其变化影响微小突触后兴奋性电流,提示其对出生后大鼠的视觉发育有着重要的生理作用.     

双眼形觉剥夺对大鼠视皮层神经元γ-氨基丁酸电流的影响

目的探讨双眼形觉剥夺对大鼠视觉发育可塑性关键期内视皮层神经元γ氨基丁酸电流的影响。方法采用脑片膜片钳全细胞记录技术,记录出生后14、21和28d正常、双眼形觉剥夺和去除剥夺大鼠视皮层神经元兴奋性突触后电流。然后在人工脑脊液中同时加入D,L2氨基5磷酸基戊酸50μmol/L和氰基7硝基喹啉2,3二酮20μmol/L,分离出γ氨基丁酸受体介导的成分电流,分析其电学特性。结果随着周龄增加,正常组大鼠视皮层神经元的抑制性突触后电流的下降时间和峰值显著变长和增大(P<005);而双眼形觉剥夺组内无明显变化(P>005);去除剥夺后1周,大鼠视皮层神经元抑制性突触后电流的下降时间和峰值增大(与双眼形觉剥夺组生后4周比较,P<005)。各组内,上升时间无明显变化(P>005)。结论随着视觉发育,正常大鼠视皮层神经元的γ氨基丁酸受体介导的抑制性突触传递增强,双眼形觉剥夺抑制这一变化,恢复视觉输入后可以逆转。(中华眼科杂志,2005,413740)     

视觉发育可塑性关键期终止前后大鼠视皮层NR2A/NR2B比率的表达

目的在视觉发育可塑性关键期终止前后,观察大鼠视皮层内NR2A/NR2B比率的发育性变化。方法健康SPF级LongEvans大鼠15只,雌雄不限,采用Western blot法观察出生后3、4、5、6、7周正常大鼠视皮层中NR2A和NR2B的蛋白表达量,分析NR2A/NR2B随着大鼠视皮层发育表达的变化。结果 Western blot检测显示,生后3～7周正常大鼠视皮层中NR2A蛋白的表达量逐渐增加,差异有统计学意义（F=156.263,P=0.008）,生后4、5、6、7周组大鼠视皮层中NR2A的积分光密度（IOD）值明显高于生后3周组大鼠,差异均有统计学意义（P〈0.05）。可塑性关键期终止前后,正常大鼠视皮层中NR2B蛋白的表达量逐渐降低（F=73.340,P=0.007）,生后6～7周趋于稳定。可塑性关键期终止前后,大鼠视皮层中NR2A/NR2B比率随着大鼠视皮层的发育逐渐增加,差异有统计学意义（F=113.031,P=0.003）。结论在可塑性关键期终止前后,NR2A/NR2B比率的变化参与了视皮层可塑性终止的过程。     

发育对大鼠视皮层第2和3层锥体神经元AMPA受体介导的自发兴奋性突触后电流影响的研究

目的 研究发育过程中大鼠视皮层第2、3层锥体神经元的自发兴奋性突触后电流(sEPSC)变化,探讨生后早期自发性突触活动情况,以及视觉经验在视皮层发育过程中对神经元突触的修饰作用.方法 实验研究.应用红外微分干涉相差显微镜(IR-DIC)结合电耦合式摄像机(CCDCamera)可视法膜片钳全细胞记录生后2～7 d、8～14 d、15～21 d、22～28 d各组sEPSC变化,同时于电极内液中加入0.3%荧光黄对所记录细胞进行染色观察形态学改变.计量资料以均数±标准误表示,经方差齐性检验后,多组样本比较采用单因素方差分析,并进行样本均数间的多重比较.结果 4个组视皮层神经元sEPSC幅值分别为(14.13±0.73)、(15.01±0.62)、(19.87±0.75)、(22.09±1.14)pA,随发育逐渐升高(F=20.69,P＜0.01),但2～7 d组与8～14 d组差异无统计学意义(P＞0.05),而睁眼前8～14 d组较睁眼后15～21 d组幅值比较差异有统计学意义(P＜0.01).4个组视皮层神经元sEPSC频率分别为(1.35±0.05)、(1.33±0.12)、(2.26±0.15)、(2.85±0.12)Hz,随发育逐渐提高(F=87.46,P＜0.01),同样睁眼前8～14 d组较睁眼后15～21 d组频率比较差异有统计学意义(P＜0.01).视皮层第2、3层神经元胞体及突起以及生物电学特性随发育逐渐成熟.结论 视觉经验对于视皮层第2、3层神经元及突触发育成熟起了关键性作用.发育早期视皮层第2、3层有一定的α-氨基-3-羟基-5甲基-4-异号声(噁)唑丙酸(AMPA)受体功能表达,突触并非完全处于静息状态.     

双眼形觉剥夺对成年大鼠视皮层兴奋性递质受体表达和分布的影响

目的 探索大鼠视皮层中兴奋性神经递质受体表达和分布的发育特征以及双眼形觉剥夺(binocular form deprivation,BFD)对成年大鼠视皮层内兴奋性递质受体亚型表达和分布的影响.方法 采用免疫组织化学染色和免疫印迹技术,分别对生后1～9周正常大鼠和自生后7周开始BFD 14 d后模型大鼠的视皮层中兴奋性递质受体亚型进行标记和检测.结果 N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2A(NMDA-NR2A)在大鼠未睁眼时少量表达,可塑性关键期高峰时最明显;之后表达减少,至成年期维持一定水平,BFD 14 d可以造成成年大鼠视皮层NM-DA-NR2A阳性表达减弱.NMDA-NR2B在未睁眼时表达较明显,可塑性关键期高峰时表达最多;之后表达下降稳定在成年期低水平,BFD 14 d可造成其在成年大鼠视皮层中表达增强.α-氨基-3-羟基-5-甲基4-异唑丙酸受体GluR-1亚基平均分布在视皮层各层,在出生后少量表达,之后随年龄增长逐渐增强,其表达在可塑性关键期终止时达到高峰并在成年期维持较高水平,BFD14 d对其在成年大鼠视皮层表达没有影响.结论 由BFD诱导的NMDA-NR2A或NMDA-NR2B表达变化可能参与了成年大鼠视皮层可塑性再激活机制.     

弱视视觉可塑性相关基因研究

可能与弱视发病密切相关的部分基因有抗凋亡基因（Bcl-2、Bax）、即刻早期基因（c-jun、c-fos）、视觉可塑性神经递质相关基因（N-甲基-D-天冬氨酸受体1亚单位基因）、视觉可塑性神经营养因子相关基因（Neuritin mRNA、GDNF mRNA、BDNF mRNA、GAP-43 mRNA）、PTPσ mRNA、β-catenin mRNA等。Bcl-2、Bax可能通过调节视觉系统相关神经细胞的存活来参与弱视的发病;c-jun、c-fos进入细胞核后能够改变靶基因的转录活性从而调节视皮质神经元的功能状态;N-甲基-D-天冬氨酸受体1亚单位基因位于突触后膜,可以通过调节不同亚单位的表达水平来调节视皮层突触的可塑性;视觉可塑性神经营养因子相关基因中的Neuritin mRNA编码一种活性分子,这种活性分子可以促进树突的生长,从而调节视觉系统发育过程中神经元的活动;GDNF mRNA存在于视皮层和外侧膝状体,对各种损伤后的神经元具有保护和修复作用,能通过影响视觉系统正常发育过程中的转录来参与对视觉发育的调控,BDNF mRNA具有调节神经系统突触发育可塑性的效应,参与视觉发育关键期突触的可塑性变化;PTPσ mRNA、β-catenin mRNA参与了成年大鼠视皮层可塑性关键期的终止及可塑性再激活的过程。（国际眼科纵览, 2018,  42:   163-168）     

成年及幼年Long-evans大鼠视皮层HSP8基因的表达差异

目的:观察热休克蛋白8(heat shock protein 8,HSP8)基因在幼年和成年Long-evans大鼠视皮层中的表达水平,探讨其在视觉可塑性关键期中的作用。方法:采用半定量RT-PCR方法,分析处于视觉可塑性关键期内的幼年Long-evans大鼠和处于视觉可塑性关键期后的成年Long-evans大鼠视皮层中HSP8基因的表达水平。结果:幼年大鼠和成年大鼠视皮层间HSP8mRNA表达量有显著性差异,成年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.68±0.03,幼年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.14±0.06,HSP8mRNA在成年大鼠视皮层中表达水平显著高于幼年大鼠(P<0.05)。结论:HSP8基因在视觉可塑性关键期后的成年大鼠视皮层中呈高水平表达,是视觉可塑性关键期终止相关的候选基因。     

小鼠视觉发育前关键期视皮层神经元反应特性与突触可塑性

背景 人类及哺乳动物的视觉发育主要是在生后关键期内完成的,但此期并非是哺乳动物接受视觉经验刺激的最早期.小鼠等哺乳动物视觉发育的关键期前还存在前关键期.目前,前关键期视皮层神经元的反应特性及突触可塑性研究仍处于探索阶段. 目的 探讨小鼠前关键期视皮层神经元的反应特性及突触可塑性特点. 方法 选择生后13～17 d的C57BL/6J小鼠48只,分别采用在体膜片钳全细胞记录及离体脑片膜片钳全细胞记录法记录小鼠视皮层第Ⅳ层神经元的电生理反应.在体记录在小鼠麻醉下进行,在电流钳模式下给予步阶电流刺激,测量其在体膜反应特性.给予最优刺激参数的移动光棒刺激,测量其视觉诱发反应特性.完成在体实验后行离体实验,分别测量神经元离体膜反应特性及白质-第Ⅳ层通路刺激条件下的诱发反应特性.采用随机数字表法将实验动物随机分成4个组,各组雌雄比例分配均匀.每组测定12个细胞,按照刺激频率的不同分别行低频刺激(LFS)和高频刺激[θ波脉冲刺激(TBS)]模式训练,按照刺激时序的不同进行突触前-后(pre-post)模式和突触后-前(post-pre)模式训练,在-70 mV电压钳制下分别记录训练前后兴奋性突触后电流(EPSCs).采用pClmap 10软件对原始数据进行预处理,采用Matlab 2008a软件进行统计分析.结果 在体成功记录的细胞数为39个,离体记录48个.在体和离体条件下视皮层第Ⅳ层神经元稳态平均发放动作电位(AP)个数分别为1.01±0.03和1.01±0.05,AP阈值分别为(-40.2±3.2)mV和(-39.6±2.0)mV,阈电流水平分别为(126.7± 17.4) pA和(129.6±17.5)pA,差异均无统计学意义(AP数:t=0.512,P=0.610;AP阈值:t=-1.074,P=0.286;阈电流:=-0.776,P=0.440).在体最优视觉刺激条件下平均膜电位峰值幅度为(7.3±4.3)mV,鲜见AP;离体最强通路刺激条件下平均膜电位峰值反应幅度为(6.4±2.8)mV,未见AP,在体与离体记录的平均膜电位峰值幅度差异无统计学意义(t=1.234,P=0.221).离体条件下,LFS训练前后EPSCs幅度分别为(138.1±51.9)pA和(76.1±34.8) pA,差异有统计学意义(t=4.437,P=0.001),而TBS训练前后EPSCs幅度差异无统计学意义(t=-0.756,P=0.466),pre-post训练前后EPSCs幅度分别为(122.4±62.2)pA和(78.5±46.7)pA,post-pre训练前后分别为(131.9±48.0)pA和(74.3±30.7)pA,差异均有统计学意义(pre-post:t=3.558,P=0.004;post-pre:t=4.283,P=0.001).结论 前关键期小鼠视皮层第Ⅳ层已完成神经回路的基本构建,但神经元的膜反应性以及突触连接仍未成熟.在低频或高频突触前后时序差异性输入条件下,突触功能受到抑制,而在高频输入条件下突触功能得到继续保持.前关键期小鼠视觉神经系统的发育具有不同于关键期的特征.     

双眼形觉剥夺对成年大鼠视皮层兴奋性突触后电流的影响

目的探讨双眼形觉剥夺（FD）对成年大鼠视皮层神经元兴奋性突触传递特性的影响。方法采用视皮层脑片膜片钳全细胞记录和电流分离技术,分别记录9周龄正常大鼠和7周龄大鼠双眼FD后14d的视皮层神经元膜学特性、突触后电流（PSCs）与NMDA兴奋性突触后电流（EPSCs）。结果双眼FD不改变成年大鼠视皮层神经元的膜学特性和PSCs电学指标。双眼FD对成年大鼠视皮层神经元EPSCs、NMDA—EPSCs的峰值以及NMDA—EPSCs在总EPSCs中所占比例,NMDA—EPSCs的复极化时间无明显影响。结论双眼FD不影响成年大鼠视皮层神经元兴奋性神经传递功能。     

Study on Long-term Potentiation in Developing Rat Visual Cortex during the Critical Period of Plasticity

Purpose: To study the property of LTP in layers Ⅱ-Ⅳof the rats visual cortex at different postnatal days induced by pairing low-frequency stimulation at layer Ⅵwith post synaptic depolarization in order to explore the synaptic and cellular mechanism of experience-dependent plasticity in the visual cortex. Methods: Postsynaptic currents (PSCs) of layers Ⅱ-Ⅳin visual cortex slices of Wistar rats aged P0-29 d were recorded by patch-clamp whole cell recording method. Long-term potentiation (LTP) was induced by low-frequency stimulation (LFS) at 1Hz for 60-90 s. Each pulse of the LFS paired with depolarization of post-synaptic neurons to -20 mV.100μM APV, a kind of competitive N-methyl-d-aspartate (NMDA) receptor antagonist, was both applied to some slices to test the property of LTP. Results:1. The LTP incidence was very low before P10d (5/34) , and increased rapidly to the top at P15-24 d (17/28), then decreased sharply to 1/5 at P25-29 d, coinciding well with the critical period of plasticity of rat     

反转缝合与丰富环境联合干预对成年弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用

目的探讨反转缝合与丰富环境联合干预对单眼形觉剥夺成年弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用。方法将14日龄大鼠随机分为8组：1-3组为正常对照组,4-8组为单眼剥夺组。剥夺组在生后14天行右侧眼睑缝合制备单眼剥夺模型,放于实验室标准环境下饲养,1-3组、4-6组分别于生后45天、60天、90天处死;7-8组于60日龄时打开录0夺眼,缝合左侧眼睑行遮盖治疗,第7组放于标准环境中饲养30d,即反转缝合组,第8组放于丰富环境中饲养30天,即反转缝合联合丰富环境干预组,此两组至90日龄处死取材;免疫组化染色检测并分析各组大鼠视皮层PSD-95蛋白表达水平的变化。结果同年龄段弱视组视皮层PSD-95呈阳性神经元密度降低（P〈0．001）;同年龄段反转缝合干预组视皮层较弱视组PSD-95呈阳性神经元密度增加（P〈0．05）,但仍低于正常组（P〈0．05）;同年龄段反转缝合、结合丰富环境干预组视皮层与弱视组、反转缝合组相比,PSD-95呈阳性神经元密度增加（P〈0．05）,与正常组相比,其差异无统计学意义（P〉O．05）。结论单眼剥夺影响了关键期后成年大鼠视皮层PSD-95的表达,提示PSD-95可能参与调节成年视皮层可塑性;反转缝合单纯干预、反转缝合联合丰富环境干预能部分重新激活剥夺性成年弱视大鼠视皮层可塑性,反转缝合与丰富环境联合干预的再激活作用更为明显。     

A study on the role of N-methyl-D-aspartate receptors in the rat visual cortex.

The amino acid L-glutamate is a major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates. NMDA (N-methyl-d-aspartate) is one of the L-glutamate receptor subtypes. During a critical period of early postnatal development, the visual cortex is susceptible to experience-dependent modification of neuronal responses. Recently, the activation of NMDA receptors has been supposed as a prerequisite for the induction of such modification. We therefore investigated developmental changes of NMDA receptors in the rat visual cortex and questioned whether they could be related to the visual development. We assessed the density of [3H]-NMDA receptor in the visual cortex of normally reared rate (Group I) and visually deprived rats (Group II) using quantitative autoradiography. The density of [3H]-NMDA receptor was significantly lower in Group II than in group I during the early postnatal period, and increased rapidly by postnatal 1 week and, decreased after postnatal 5 weeks. These results suggested that NMDA receptors may play a role in neuronal development in the visual cortex during the early postnatal period.     

Selective failure of long-term survival of isolated photoreceptors from both homozygous and heterozygous rd (retinal degeneration) mice

Retinas from homozygous rdle/rdle and heterozygous rdle/++ C57BL/6J mice were dissected and dissociated on postnatal day 2, when they are still essentially indistinguishable. The resulting cell suspensions were seeded on highly adhesive substrata, to which the cells attach as individual units, and grown in vitro for 2 weeks in serum-free, chemically defined media. The behavior of neurons and photoreceptors in vitro was investigated with several techniques; essentially no differences were found between rdle/rdle and rdle/++ cells. Three distinctive cell types could be recognized in cultures of both genotypes towards the end of the first week in vitro: process-free cells, multipolar neurons and rod photoreceptors. There were similarities between rdle/rdle and rdle/++ cultures in the number and morphology of photoreceptor cells, to include the presence of a cilium and a short neurite terminating in a spherule-like body. Moreover, in cultures of both genotypes, only photoreceptors showed opsin immunoreactivity and the antigen recognized by the rod-specific monoclonal antibody RET-P1. Biochemical and autoradiographic studies demonstrated that rdle/rdle and rdle/++ cells also showed similar uptakes of the putative amino acid neurotransmitters glutamate and aspartate (associated with most of the photoreceptors and only some neurons), and gamma-aminobutyric acid (associated with neurons but absent in photoreceptors). Thus, according to several parameters, the properties shown by photoreceptor cells were similar in rdle/rdle and rdle/++ cultures during the first week in vitro. Massive photoreceptor cell death was observed in both genotypes during the second week in vitro, coinciding with the time when photoreceptor degeneration occurs in vivo in rd/rd, but not in rd/+ retinas. Photoreceptor death in culture appeared to be specific, since approx. 80% of the non-photoreceptor neurons survived normally during the period when photoreceptor degeneration took place. Several reports from the literature suggest that the period around postnatal days 8-10 represents a critical stage for rd/rd photoreceptors, since they survive until this time but degenerate thereafter. Genetically normal photoreceptors apparently undergo a comparable crisis during maintenance in primary culture, suggesting the involvement of cell-cell contacts and/or retina-derived environmental signals in the survival or rod visual cells.     

代谢性谷氨酸受体1在单眼形觉剥夺弱视大鼠视皮质17区的表达及超微结构观察

目的探讨视觉形成关键期内单眼形觉剥夺弱视大鼠初级视皮质17区中代谢性谷氨酸受体1（mGluR1）的表达规律及神经元超微结构变化,为临床上揭示弱视的病理机制及防治提供依据。方法随机对照同期动物实验。方法是建立大鼠单眼形觉剥夺弱视模型,经图形视觉诱发电位检测证实造模成功后,与正常对照组大鼠一起灌注、固定、取材、做石蜡切片,进行免疫组织化学染色和电镜观察,摄像显微镜分层照相,计算机图像分析系统进行图像分析,SPSS11．5统计学软件进行方差分析。结果弱视眼对侧大脑视皮质17区Ⅳ层与正常对照组大脑视皮质17区Ⅳ层和弱视眼同侧大脑视皮质17区Ⅳ层相比,mGluR1阳性着色神经元面积减少,差异有统计学意义（P〈0．01）。其他各层之间3组分别对比差异均无统计学意义。电镜结果显示：弱视眼对侧大脑视皮质17区Ⅳ层可见部分神经元胞质轻度水肿,线粒体嵴和膜融合或消失,排列紊乱,粗面内质网脱颗粒显像明显,核膜皱缩。正常对照组大脑视皮质17区Ⅳ层和弱视眼同侧大脑视皮质17区Ⅳ层神经元胞核正常,核膜完整,线粒体嵴规则,高尔基体发达,粗面内质网发达。结论单眼形觉剥夺弱视大脑视皮质17区Ⅳ层mGluR,的表达与正常相比减少。弱视眼对侧大脑视皮质17区Ⅳ层部分神经元发生形态改变,可能与视觉神经冲动传入减少致神经元萎缩所致。形觉剥夺致神经冲动传入减少,视皮质17区Ⅳ层mGluR,表达减少,突触可塑性变化,致神经元发生萎缩可能是弱视发病机制之一。（中华眼科杂志,2008,44：67—71）