表皮生长因子对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响

目的探讨表皮生长因子(EGF)对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响. 方法采用双参数流式细胞免疫荧光技术检测. 结果EGF短时间内上调肝癌细胞EGFR及DNA表达,随时间延长表现出下调作用.两种相对立的作用呈时间依赖性. 结论EGFR表达的变化可能是EGF对肝癌细胞表现出两种相对立作用的机理之一.     

表皮生长因子对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响

目的 探讨表皮生长因子(EGF)对人肝癌细胞EGFR／DNA表达的影响。方法 采用双参数流式细胞免疫荧光技术检测。结果 EGF短时间内上调肝癌细胞EGFR及DNA表达，随时间延长表现出下调作用。两种相对立的作用呈时间依赖性；结论 EGFR表达的变化可能是EGF对肝癌细胞表现出两种相对立作用的机理之一。     

肝刺激因子对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响

目的检测肝刺激因子 (HSS)对人肝癌细胞EGFR/DNA表达的影响。方法双参数流式细胞免疫荧光技术检测肝癌细胞EGFR/DNA的表达。结果HSS下调肝癌细胞DNA表达 ,随时间延长下调程度逐渐增加 ,至 2 4h时DNA表达显著下降(P <0 .0 5 ) ;HSS迅速下调EGFR表达 ,作用 12h即呈现显著差异 (P <0 .0 5 )。结论EGFR/DNA表达的变化可能是HSS抑制肝癌细胞生长的原因之一     

肝刺激因子稳定转染人肝癌细胞系的方法建立与表达鉴定

目的 建立稳定表达肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)的BEL-7402肝癌细胞系,并对其生物学特性进行鉴定。方法 采用脂质体法将鉴定后的Flag-HSS-pcDNA3.0质粒转染到肝癌细胞系BEL-7402中,进行G418筛选,获得稳定转染的人肝癌细胞系。通过real-time PCR、 Western blotting和免疫荧光染色等方法鉴定HSS mRNA和蛋白质表达及亚细胞定位。结果 免疫荧光染色实验证实HSS基因能在稳定转染的肝癌细胞系中表达,并定位于线粒体中。同时发现在稳定转染细胞中HSS mRNA和蛋白质的表达也均高于野生型BEL-7402细胞。结论 目前已成功构建稳定转染HSS的BEL-7402肝癌细胞系。为深入研究HSS的生理功能提供实验工具和研究基础。     

CCAAT/增强子结合蛋白α抑制人肝癌细胞内的肝刺激因子表达

目的 探讨CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)对人肝癌细胞内肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)表达的影响及其在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)抑制HSS表达过程中的作用.方法 采用凝胶迁移电泳实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究C/EBPα与HSS启动子的体外相互作用,real-time PCR和Western blotting的方法测定hHSS mRNA和蛋白质表达情况.结果 EMSA实验证实C/EBPα可以与hHSS启动子-343/-330区域内的C/EBPα结合位点结合,对hHSS表达具有负性调节作用,C/EBPα siRNA转染入HepG2细胞后,hHSS mRNA和蛋白质表达均升高.但C/EBPα表达下降并不影响EGF对hHSS表达,而EGF不改变C/EBPα的活性和表达.结论 C/EBPα可通过C/EBP位点抑制hHSS的表达,但不参与EGF对hHSS的转录调节过程.     

肝刺激因子表达下调通过ERK促进肝癌细胞转移的研究

【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。     

人胎肝刺激因子对大鼠实验性肝纤维化影响的研究

本工作从健康孕妇水囊引产４～６个月龄的胎儿取肝，采用ＬａＢｒｅｃｑｕｅ方法提取肝刺激因子，称人肝刺激因子（ｈｕｍａｎＨｅｐａｔｉｃＳｔｉｍｕｌａｔｏｒＳｕｂｓｔａｎｃｅ，ｈＨＳＳ）。将ｈＨＳＳ注入肝部分切除之大白鼠体内，用３Ｈ－胸腺嘧啶核苷掺入肝ＤＮＡ法测定其生物活性。结果表明，我们提取的ｈＨＳＳ刺激肝细胞ＤＮＡ合成较对照组增加６倍。采用皮下注射６０％ＣＣｌ４豆油溶液和饮用低浓度的乙醇制备慢性肝损伤动物模型，以观察ｋＨＳＳ对大鼠实验性慢性肝纤维化的影响。实验结果表明，（１）ｈＨＳＳ可以明显降低ＣＣｌ４－乙醇所致慢性肝损伤时肝组织羟脯氨酸含量的升高，在实验第２８、４２天差异具显著性（Ｐ＜０．０５，０．０１）。（２）病理组织学观察表明，ｈＨＳＳ可以明显降低ＣＣｌ４－乙致慢性肝损伤时肝组织纤维化的程度。在实验的第４２天差异具显著性（Ｐ＜０．０１）。本工作结果提示，肝再生刺激因子可能是一种有希望应用于临床治疗慢性肝病的生物制剂。     

肝细胞刺激因子对骨髓单个核细胞向肝归巢的影响

目的:探讨肝细胞刺激因子对骨髓单个核细胞(BMMNC)在小鼠体内向肝归巢的影响。方法:制备BALB/c小鼠2-乙酰氨基芴-四氯化碳肝损伤模型,供鼠分离BMMNC,体外经PKH26染色,经尾静脉途径输入肝损伤小鼠体内,实验组立即以80μg/(kg.d)剂量腹腔内注射肝细胞刺激因子,对照组注射等量5%葡萄糖溶液。移植2周后取小鼠肝,冷冻切片计荧光细胞数,苏木精-伊红(H-E)染色观察病理组织学变化。结果:实验组小鼠肝冷冻切片上平均荧光细胞数多于对照组(84vs61,P<0.05)。H-E切片上新生肝细胞较多。结论:肝细胞刺激因子对BMMNC向肝归巢有一定的促进作用。     

HSS促进人肝癌细胞凋亡的研究

目的：研究肝刺激物（hepatic stimulator substance,HSS)对人肝癌细胞凋亡的影响。方法：用无血清培养人肝癌细胞诱导典型的细胞凋亡，以此为模型应用流式细胞术及流式细胞免疫荧光技术，检测HSS作用不同时间后，对无血清培养人肝癌细胞诱导凋亡比率的影响，并观察HSS对常规培养人肝癌细胞的P53蛋白表达变化的影响。结果：HSS作用于无血清培养的人肝癌细胞，细胞凋亡比率随时间延长而增加；HSS作用于常规培养的人肝癌细胞，P53蛋白的表达随时间延长而减弱。结论：HSS对无血清培养人肝癌细胞凋亡有促进作用。     

HSS促进人肝癌细胞凋亡的研究

目的研究肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)对人肝癌细胞凋亡的影响.方法用无血清培养人肝癌细胞诱导典型的细胞凋亡,以此为模型应用流式细胞术及流式细胞免疫荧光技术,检测HSS作用不同时间后,对无血清培养人肝癌细胞诱导凋亡比率的影响,并观察HSS对常规培养人肝癌细胞的P53蛋白表达变化的影响.结果HSS作用于无血清培养的人肝癌细胞,细胞凋亡比率随时间延长而增加;HSS作用于常规培养的人肝癌细胞,细胞P53蛋白的表达随时间延长而减弱.结论HSS对无血清培养人肝癌细胞凋亡有促进作用.     

人胎肝再生刺激因子治疗肝硬化的初步观察

采用改良Labrecque法，从人胎肝提取肝再生刺激因子（HSS），并运用于治疗肝硬化病人（15例），并设对照组（15例）予以比较。结果：治疗组病例在自觉症状、体征及生化指标（r-球蛋白、A/G比值）等方面的改善明显优于对照组。并对HSS的制备及应用作了介绍。     

人胎肝细胞生长刺激物质的分离纯化及活性测定

从人胎肝组织纯化肝细胞生长刺激物质（ｈＨＳＳ），经过匀浆、热处理、乙醇沉淀、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０离子交换层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５凝胶过滤，聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳及ＩＳＣＯＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ转移浓缩电泳等步骤，分离出具有ＨＳＳ活性的蛋白质。经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示５３ＫＤ与１８ＫＤ两条带。     

肝细胞刺激因子对环磷酰胺致小鼠肝细胞损伤的保护作用

目的 研究环磷酰胺(CTX)对肝细胞的损伤及肝细胞刺激因子(HSS)对该损伤的保护作用。方法 应用原代小鼠肝细胞混悬培养，检测肝细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和肝细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量变化。结果 CTX可使LDH漏出增多，同时肝细胞GSH含量减少，MDA含量增加，HSS可部分逆转上述变化。结论 CTX可致肝细胞损伤，HSS降低肝细胞MDA含量可能是其保肝机制之一。     

人胎肝细胞生长刺激物质与酪氨酸蛋白激酶的关系

利用从人胎肝提取的肝细胞生长刺激物质（ｈＨｓｓ），以小鼠肝细胞质膜蛋白作为受体及内源性底物，以Ｐｏｌｙ（ＧｌｕＮａ，Ｔｙｒ）４：１作为外源性底物，通过磷酸化实验，对ｈＨＳＳ的作用及其与酪氨酸蛋白激酶活性之间的关系进行了研究。利用抗酪氨酸磷酸酯抗体免疫沉淀法，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显形及液体闪烁计数等方法进行测定。结果证明：ｈＨＳＳ可刺激并增强肝细胞膜受体的酪氨酸蛋白激酶的活性，后者可使膜蛋白某些组分及外源性底物磷酸化增强；ｈＨＳＳ的作用与酪氨酸蛋白激酶的活性密切相关。     

染料木黄酮通过抑制EGFR/ERK通路抗肝癌SMMC7721细胞增殖

目的探讨染料木黄酮对肝癌细胞SMMC7721增殖的抑制作用及其作用机制。方法以染料木黄酮干预肝癌细胞SMMC7721。MTT法及集落形成实验检测细胞增殖;蛋白质免疫印迹检测染料木黄酮对ERK及EGFR活化的影响;免疫共沉淀法检测染料木黄酮对SMMC7721细胞ERK及EGFR间相互作用的影响。结果染料木黄酮能显著抑制肝癌细胞增殖,其抗增殖活性具有浓度依赖性;染料木黄酮还可抑制ERK与EGFR的活化,并抑制ERK及EGFR间的相互作用。结论染料木黄酮可抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与其抑制EGFR/ERK通路活化有关。