siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用

目的研究化学合成的小分子干扰RNA (siRNA)对鼠肝星状细胞 (HSC)结缔组织生长因子 (CTGF)基因表达的抑制作用。方法针对大鼠CTGFmRNA 4 83、885和 94 6位点化学合成 3对 2 1核苷酸 (nt)siRNA ,分别以 5 0、10 0、2 0 0nmol/L浓度转染HSCT6 ,以空白及转染非特异siRNA作为对照 ,应用RT PCR检测CTGFmRNA表达 ,筛选出抑制效率最高的siRNA及其浓度 ;再转染HSCT6 ,抽提孵育 2 4、4 8、72h细胞总RNA及蛋白质 ,应用RT PCR和Westernblot检测CTGFmRNA及蛋白质表达。结果与对照相比 ,转染siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平明显降低 ,siRNA抑制效率在 5 0 ～2 0 0nmol/L范围呈浓度依赖性增高 ,以 4 83siRNA 2 0 0nmol/L最显著 ,转染非特异siRNA的HSCT6细胞CTGFmRNA表达水平无明显变化 ;转染 4 83siRNA的HSCT6细胞 2 4　 4 8、72hCTGFmRNA分别下调 (91± 2 ) %、(6 5± 3) % (P均 <0 .0 1)和 (10± 7) % (P =0 .0 6 34) ,蛋白分别下调 (86± 5 ) %、(94± 4 ) %和 (4 2± 9) % (P均 <0 .0 1)。结论化学合成 4 83siRNA能高效抑制HSC的CTGF基因表达 ,有效阻抑时间达 72h,提示化学合成siRNA具有预防和治疗肝纤维化的潜力     

针对结缔组织生长因子的siRNA对高糖诱导人肾小管上皮细胞肥大的影响

目的 观测人肾小管上皮细胞转染针对结缔组织生长因子(CTGF)的siRNA后对高糖诱导细胞肥大的影响.方法 细胞分6组培养:正常对照组(培养基含D-葡萄糖1 g/L),等渗对照组(培养基含D-葡萄糖1 g,L、甘露醇3.5 g/L),高糖组(培养基含D-葡萄糖4.5 g/L),高糖+空白对照组(细胞转染空质粒后培养于高糖培养基中),高糖+阴性对照组(细胞转染含无关序列的质粒后培养于高糖培养基中),高糖+干扰组(细胞转染针对CTGF的siRNA表达质粒后培养于高糖培养基中).收集各组培养至24、48、96 h的细胞,以实时PCR检测CTGF mRNA水平;Western blotting检测CTGF蛋白水平;MTT法测定细胞增殖活力;流式细胞仪测定细胞周期分布;考马氏亮蓝法测定细胞总蛋白含量.结果 高糖刺激可上调HK-2细胞的CTGFmRNA及蛋白水平,使停留于G_1期的细胞比例升高,增殖活力受抑制,细胞肥大指标胞内总蛋白含量增加:而通过特异性siRNA抑制CTGF mRNA表达后,细胞的CTGF蛋白表达随时间延长进行性降低.细胞增殖活力增强,更多的细胞由G_1期进入S期,细胞内总蛋白含量降低.结论 证实了CTGF是高糖诱导HK-2细胞肥大的重要介质.针对CTGF的siRNA能明显改善高糖诱导的肾小管上皮细胞肥大,为进一步寻找DN防治的靶点提供了新的实验依据.

Abstract：

Objective To observe the effect of transfection with small interfering RNA (siRNA) targeting connective tissue growth factor (CTGF) on human tubular epithelial hypertrophy induced by high glucose. Methods HK-2 cells were cultured in DMEM/F12 medium containing 1 g/L glucose (normal control group), 4.5 g/L glucose (high glucose group), or 1 g/L glucose + 3.5 g/L mannitol (iso-osmolar control group). The cells were transfected with pGenesil-1, pGenesil/neg, or pGenesil/siRNA-CTGF and then cultured in DMEM/F12 medium containing 4.5 g/L glucose as the high glucose + blank control group, high glucose +negative control group and high glucose+ interference group, respectively. After cell culture for 24, 48 and 96 h, the cells were collected to detect the mRNA and protein levels of CTGF by real-time PCR and Western blotting, respectively. The proliferative activities of the cells were evaluated with MTT assay, and the total cellular protein contents were determined with Bradford method. Flow cytometry was employed to analyzed the cell cycle changes. Results High-glucose significantly up-regulated the CTGF mRNA and protein levels in HK-2 cells. The cell proliferation was inhibited after high-glucose exposure with increased cell percentage in G, phase and total cellular protein content suggesting cellular hypertrophy. Transfection with siRNA targeting CTGF significantly inhibited high glucose-induced up-regulation of CTGF mRNA and protein and promoted the cell proliferation, resulting also increased cells in S phase and lowered total cellular protein contents. Conclusion CTGF is an important mediator of high glucose-induced tubular epithelial hypertrophy, and transfection with siRNA targeting CTGF can alleviate the hypertrophy, suggesting the potential value of CTGF-targeted treatment in the management of diabetic nephropathy.     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的 研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响.方法 以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组.收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量.结果 与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%.结论 483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌.提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力.     

高糖通过结缔组织生长因子诱导足细胞减少podocalyxin的表达

摘要：目的探讨高糖对小鼠足细胞podocalyxin表达的影响及结缔组织生长因子（CTGF）参与其损伤的可能机制。方法
构建针对CTGF基因的特异性siRNA质粒并转染至小鼠足细胞。将体外培养的足细胞分为6组( 1)正常对照组,正常足细
胞其培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,正常足细胞其培养基含D-葡萄糖1 g /L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,正常足
细胞其培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组：足细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照
组：足细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组：足细胞转染针对CTGF的siRNA表达质
粒后于高糖培养基中培养。Western blot 方法检测小鼠足细胞Podocalyxin、CTGF 蛋白表达及细胞外信号调节激酶
（ERK1/2）磷酸化水平。结果高糖培养足细胞24、48 h时均可下调其Podocalyxin蛋白表达量（P<0.05）,并可诱导CTGF
蛋白表达增加（P<0.05）。同时高糖可以活化足细胞ERK1/2信号途径,在高糖刺激30 min时开始活化,持续活化至24 h。
特异性siRNA干扰CTGF合成后,ERK1/2活化减少,并且足细胞Podocalyxin表达升高。结论CTGF是高糖诱导小鼠足
细胞损伤的重要介质,可通过ERK1/2途径诱导podocalyxin表达下降,针对CTGF的siRNA能明显改善podocalyxin表达
量,为DN的治疗提供新的思路。     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的研究化学合成的小干扰RNA（483 siRNA）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483 siRNA转染培养72h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT—PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调（92&#177;5）％,α—SMA染色阳性细胞减少（58&#177;6）％,细胞增殖活性下调（18&#177;5）％,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调（53&#177;6）％和（41&#177;7）％;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低（48&#177;5）％和（33&#177;8）％。结论483 siRNA能显著下调原代HSCs CTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

靶向结缔组织生长因子的siRNA对于肝星状细胞介导肝纤维化的研究进展

肝纤维化是多种慢性因素导致肝内细胞发生持续、反复的坏死或炎症刺激,机体发生的修复反应,以肝内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积和肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）活化为特征。它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝病的共同病理过程,持续进展可导致肝内正常组织结构改建形成肝硬化并出现多种危及生命的并发症,预后极差。由于体内存在纤维降解过程,故肝纤维化逆转可以避免病情进展至肝硬化。研究表明靶向结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）可能抑制HSC活化、增殖及ECM的合成,使肝纤维化进程受阻。siRNA介导的CTGF基因沉默为肝纤维化治疗开辟了新的途径。     

siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用

目的 探讨应用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1) 基因对移植瘤生长的影响.方法 将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,肿瘤长至一定大小时, 随机分为对照(A)组、转染试剂对照(B)组、siRNA治疗(C)组.于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000TM转染试剂和Lipofectamine 2000TM转染试剂包裹的VEGFR-1 siRNA.22 d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小;用RT-PCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR-1 基因的表达.结果 与A、B组比较,C组移植瘤增长趋势受到明显抑制(F=158.18、55.72,q=11.39、14.05,P<0.01);RT-PCR结果表明,与A、B组比较,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达(F=385.06,q=33.43,34.52,P<0.01);蛋白印迹法结果亦显示,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达(F=114.11,q=9.31,20.75,P<0.01).A组和B组各指标差异无显著性(P>0.05).结论 化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR-1的表达, 抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗的新方法.     

针对CTGF的siRNA对高糖诱导小鼠足细胞nephrin、podocin减少的影响

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)在高糖诱导小鼠足细胞nephrin、podocin表达减少中的作用,及针对CTGF基因的siRNA对其影响.方法 将体外培养的小鼠足细胞分为6组:(1)正常对照组,1640培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,1640培养基合D-葡萄糖lg/L,甘露醇3.5 g,L;(3)高糖组,1640培养基含D.葡萄糖4.5 g,L;(4)高糖+空白对照组:细胞转染空白质粒后于舍D-葡萄糖4.5 g/L中的1640培养基中培养;(5)高糖+阴性对照组:细胞转染含无关序列的重组质粒后于含D-葡萄糖4.5 g/L中的1640培养基中培养;(6)高糖+干扰组:细胞转染针对CTGF的siRNA表达质粒后于含D-葡萄糖4.5g/L中的1640培养基中培养.应用Reahime PCR检测nephrin、podocin、CTGFmRNA水平,Western blot检测CTGF,nephrin、podocin蛋白表达水平.结果 高糖可诱导CTGF mRNA及蛋白表达增加,下调足细胞的nephrin、podocin mRNA及蛋白水平,而通过特异性siRNA抑制CTGFmRNA表达后,CTGF表达减少,同时伴有细胞nephrin、podocin表达升高.结论 CTGF是高糖诱导小鼠足细胞损伤的重要介质,高糖可通过CTGF诱导nephrin,podocin表达减少.针对CTGF的siRNA能明显改善这种损伤,为DN发病机制的研究提供新的实验依据.     

利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用

目的:利用siRNA抑制β TC-3细胞中胰岛素受体基因的表达.方法: 化学合成胰岛素受体(IR)基因的4对特异siRNAs(实验组:siRNA-1组,siRNA-2组,siRNA-3组,siR-NA-4组)和1对非特异siRNA(NC组).通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染β TC-3细胞,24 h后荧光显微镜下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率;应用逆转录PCR检测IRmRNA表达.结果: ①50,100,150,200 nmol/L siRNA转染βTC-3细胞24 h后,转染效率分别为(73.1±4.1)%,(92.9±3.4)%,(90.8±4.0)%,(93.9±2.8)%,选择190 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度.②转染100 nmol/L siRNAs 24 h后,与对照组相比siRNA-1,2,3,4组B TC-3细胞IR mRNA表达都有不同程度下调,其中以siRNA-2组抑制效果最为明显,表达减少了70.5%.结论: 靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达,为进一步研究β细胞上IR的功能提供了实验基础.     

结缔组织生长因子在纤维增生性疾病形成中的作用

结缔组织生长因子作为转化生长因子β1的下游介质,可刺激成纤维细胞增殖、转化、迁移、黏附和细胞外基质的合成,参与多种器官纤维化。本文综述结缔组织生长因子在纤维增生性疾病中的作用。     

结缔组织生长因子在腹膜纤维化中的作用与调控

腹膜纤维化已逐渐成为维持性腹膜透析患者退出的主要原因,其发生是有多种因素参与的复杂过程。而结缔组织生长因子作为促纤维化刺激的共同下游介质在这一病理生理过程中发挥了重要作用,被认为可能是较理想的抗腹膜纤维化的靶目标。本文就非生理性腹透液致腹膜纤维化的机制、结缔组织生长因子的生物学特性以及结缔组织生长因子在腹膜纤维化发生过程中的具体作用和调控予以综述。     

结缔组织生长因子在糖尿病肾病诊断中的意义

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)在糖尿病肾病(DN)患者不同阶段尿中的表达水平及CTGF与糖尿病肾脏损害程度的关系,分析CTGF在DN诊断中的意义。方法选择糖尿病患者101例及正常对照组30例,根据尿蛋白排泄量(UAE)将患者分为:正常蛋白尿组(Ⅰ组)42例,微量蛋白尿组(Ⅱ组)33例,临床蛋白尿组(Ⅲ组)26例。应用酶联免疫吸附法测定各组尿中的CTGF水平。结果糖尿病各组尿中CTGF水平与正常对照组比较均明显升高,Ⅰ组尿CTGF就已经开始升高,Ⅱ组及Ⅲ组尿CTGF显著高于Ⅰ组,Ⅲ组尿CTGF显著高于Ⅱ组。糖尿病组的尿CTGF水平与尿蛋白排泄量呈显著正相关。结论CTGF可能参与了糖尿病肾病的发生发展并起着重要作用,检测尿中CTGF对于DN早期的诊断及治疗都有重要意义。     

结缔组织生长因子对心肌修复的研究

在心血管疾病的治疗中,心肌组织的再生修复及其过程中面临的心肌纤维化是心血管疾病的发生与发展的关键。结缔组织生长因子作为一种成纤维细胞生长因子,在心肌组织纤维化的发生和发展过程中起着重要作用,因此,针对结缔组织生长因子在心血管疾病中作用的研究也陆续展开,结缔组织生长因子有望成为心血管疾病中抗纤维化心肌保护治疗的新靶点。     

结缔组织生长因子在瘢痕疙瘩中的研究进展

瘢痕疙瘩是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质异常沉积为特征的一种良性增生性疾病。目前,瘢痕疙瘩的发病机制尚不明确,但临床治疗方法较多。其中,手术切除后复发率高严重影响患者的正常生活。多种细胞因子在瘢痕疙瘩的发病过程中起重要作用。而结缔组织生长因子(CTGF)属于即刻早期基因CCN家族成员之一,可表达于多种组织和器官,发挥广泛的生物学效应,同时也是瘢痕疙瘩增殖的必要因素及维持瘢痕疙瘩纤维化的关键生长因子。因此,深入研究CTGF在瘢痕疙瘩发病过程中的作用,将为瘢痕疙瘩的防治提供新思路。     

结缔组织生长因子与糖尿病肾病

糖尿病肾病目前尚缺乏早期诊断的有效方法,且治疗效果不佳。结缔组织生长因子作为一种致纤维化因子,在糖尿病肾病时的肾脏系膜细胞、足细胞、肾间质细胞中表达增加,并反作用于上述细胞。其机制可能是结缔组织生长因子与细胞表面硫酸类肝素蛋白多糖、酪氨酸激酶受体等结合,诱导细胞炎性反应及基质胶原蛋白合成与纤维粘连蛋白合成,肾脏发生纤维化。结缔组织生长因子是肾脏纤维化与蛋白尿形成的一种因素,特异性阻断结缔组织生长因子可能会成为治疗糖尿病肾病的新方向。     

CTGF与肿瘤的研究进展

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是即刻早期基因CCN家族的成员之一。CTGF与细胞外基质相互作用,可调节细胞间的粘附迁移、促进有丝分裂的发生、细胞活化和参与血管的生成。CTGF的表达水平与多种组织恶性肿瘤的发生进展、浸润转移、血管生成及其预后密切关联。     

结缔组织生长因子及其在心血管疾病中的作用

结缔组织生长因子(CTGF)是一种新近发现的细胞因子,是即刻早期基因CCN(CTGF,Cyr61,Nov)家族的成员之一,具有重要的生物学功能。其表达受很多因素调节,参与多种生理及病理过程。研究表明,其在动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压等心血管疾病的发生、发展中有重要作用,涉及了多条信号通路,有望成为一些疾病的治疗靶点。     

醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的:探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,及转化生长因子β1(TGF-β1)是否参与其信号通路。方法:大鼠肾小球系膜细胞加入不同浓度的ALD共同培养0、12、24、36、48h,RT-PCR方法评价CTGF mRNA的表达;用ELISA方法检测TGF-β1蛋白的表达;并用TGF-β1/Smads信号通路的特异性丝、苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine(STA)加以对比。结果:ALD刺激后肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平增加,且呈剂量依赖性,TGF-β1蛋白表达也明显增加;用STA预处理1h后再用ALD刺激24h,则CTGFmR-NA的表达无明显变化。结论:ALD通过TGF-β1/Smads途径上调肾小球系膜细胞表达CTGF。