巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介

目的确定西藏墨脱县疟疾流行区的疟疾传播媒介。方法根据2005、2006和2007年疟疾发病情况,在墨脱县选择了3个疟疾发病较高的自然村,采用人诱、牛诱、灯诱及清晨人房全捕等方法捕获成蚊,经形态学鉴定后麻醉处死,密封干燥,带回实验室-20℃冻存备用,采用混合样本法随机抽取10只多斑按蚊复合体为一份混合标本,提取蚊虫DNA。根据文献采用巢氏PCR扩增疟原虫小亚单位核糖体脱氧核糖核酸(SSUrDNA),并对阳性结果克隆测序,比对证实。结果共捕获按蚊5345只,其中多斑按蚊复合体5190只,带足按蚊155只,提取的360份多斑按蚊复合体混合样本DNA中发现子孢子阳性扩增样品2份,种型鉴定2份阳性混合样本均为伪威氏按蚊,PCR产物经克隆测序,NCBIBLAST同源性比对证实为疟原虫SSurDNA基因片段。结论多斑按蚊复合体中的伪威氏按蚊为西藏林芝疟疾流行区的传疟媒介。     

西藏墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变

目的探明西藏林芝地区疟疾流行区墨脱县多斑按蚊复合体是否发生击倒抗性突变,并获得我国多斑按蚊复合体5成员种钠离通道蛋白基因（VGSC）IIS4-S6区段基因序列信息。方法采用简并引物扩增我国多斑按蚊复合体5成员种的VGSC基因IIS4-S6区段,扩增产物双向测序拼接;PCR扩增墨脱县背崩乡、德兴乡、墨脱镇和达木乡捕获的共161只多斑按蚊复合体VGSC基因,对PCR产物双向测序,观察L1014位点是否发生突变。结果获得我国多斑按蚊复合体5成员种VGSC基因IIS4-S6区段基因序列,5成员种L1014位点均为TTA,对墨脱县的背崩乡、墨脱镇和达木乡捕获的伪威氏按蚊和威氏按蚊进行VGSC扩增并测序,均未发生击倒抗性突变。结论西藏林芝地区墨脱县多斑按蚊复合体尚未发生击倒抗性突变。     

西藏墨脱县疟疾暴发自然村伪威氏按蚊与威氏按蚊生态习性比较

目的 目的 调查西藏疟疾流行区墨脱县中、 高海拔地区主要按蚊伪威氏按蚊和威氏按蚊的生态习性及其传播疟疾的 潜能。 方法 方法 采用人诱、 动物诱 （牛、 马、 猪） 和诱蚊灯诱捕方法捕获成蚊, 分析按蚊密度、 夜间活动规律、 室内外吸血习性; 对于捕获的经形态学鉴定为多斑按蚊复合体的蚊虫, 按照捕蚊时间、 地点和捕蚊方式进行标记, 带回实验室后采用PCR方 法鉴定蚊种; 采用晨捕和白天搜捕法判断按蚊栖息习性; 在不同类型水体捕捞幼虫, 饲养羽化以判定孳生地。 结果 结果 共捕 获多斑按蚊复合体蚊虫1 053只, 其中伪威氏按蚊331只, 威氏按蚊722只。室内与室外威氏按蚊的数量均高于伪威氏按 蚊 （P < 0.01, P < 0.05）。室内外两种按蚊构成比差异无统计学意义 （P > 0.05）。伪威氏按蚊和威氏按蚊经产蚊比例分别为 65.90%和69.86%, 差异无统计学意义 （P > 0.05）, 伪威氏按蚊室外吸血蚊数大于室内吸血蚊数 （P < 0.05）, 威氏按蚊室内外 吸血蚊数差异无统计学意义 （P > 0.05）。两种按蚊夜间活动均为单峰分布, 威氏按蚊密度日落后21： 00-22： 00达高峰, 随 后逐步下降, 凌晨4： 00后未捕获威氏按蚊; 伪威氏按蚊密度高峰为24： 00至凌晨1： 00, 几乎整夜都有活动。结论 结论 西藏墨 脱县中、 高海拔地区威氏按蚊构成与密度均高于伪威氏按蚊, 两种按蚊生态习性有差异; 威氏按蚊比伪威氏按蚊更具传播 疟疾的潜能。     

西藏林芝地区墨脱县传疟媒介调查研究

目的 调查西藏林芝地区墨脱县传疟媒介,为制定针对性防制措施提供依据。 方法 2007年7～8月在墨脱县选择3个疟疾发病率较高的自然村,采用通宵/半通宵室内、外人/牛饵帐诱捕法、通宵人/牛房诱蚊灯诱捕法和清晨人房搜捕法捕蚊,对捕获的按蚊进行形态学鉴定,并进行种群组成、密度、叮人率、吸血习性、栖息习性和经产蚊比率等观察;在不同的水体捞取按蚊幼虫,进行蚊种鉴定,调查按蚊幼虫孳生环境。 结果 共捕获按蚊5 345只,经形态鉴定,只发现伪威氏按蚊、威氏按蚊和带足按蚊等3种,其中伪威氏按蚊占94.71%（5 062/5 345）,威氏按蚊与带足按蚊分别为2.39%（128/5 345）和2.90%（155/5 345）。伪威氏按蚊室内和室外的半通宵诱捕平均密度分别为17只/人和105只/人;全通宵室内和室外的人饵帐诱平均叮人率分别为15.80只/（人·夜）（79/5）和326.22只/（人·夜）（1 468/4.5）;全通宵室外人、牛饵诱捕及人、牛房诱蚊灯灯诱,伪威氏按蚊趋吸人血与牛血的比率分别为30.51%（714/2 340）和69.49%（1 626/2 340）及32.02%（57/178）和67.98%（121/178）,表明伪威氏按蚊偏吸牛血并兼吸人血;清晨人房搜捕,共捕获伪威氏按蚊7只,均为胃血未消化的饱血蚊;共捞获按蚊幼虫106条,其中伪威氏按蚊和威氏按蚊幼虫62条,带足按蚊幼虫44条,按蚊幼虫孳生的水体类型仅限于稻田。 结论 伪威氏按蚊具备在当地传播疟疾的媒介生物学条件。     

我国多斑按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的建立我国多斑按蚊复合体5成员种的分子鉴别方法。方法测定并分析各成员种的rDNA-ITS2序列,并设计种特异引物,应用PCR法鉴别。结果多斑按蚊复合体5成员种的ITS2序列长度和GC含量分别为伪威氏按蚊328bp、58.54％、多斑按蚊330bp、57.85％、威氏按蚊337bp、59.05％、达罗毗按蚊334bp、58.68％和塞沃按蚊338bp、57.69％,各种内的ITS2序列保守,而种间的差异率范围为9.7％～18.9％。应用5.8S引物和5个种特异引物可以分别扩增出119、186、231、327和406bp等5条清晰不同的种特异条带,以鉴别各蚊种。结论基于ITS2序列差异建立的我国多斑按蚊复合体5成员种的PCR鉴别简便易行、可靠。     

应用多重PCR法分析西藏察隅疟疾流行区按蚊吸血习性

目的用多重PCR法分析西藏疟疾流行区察隅县常见按蚊的吸血习性,为下一步研究传疟媒介提供参考。方法2011年7~8月选择察隅县不同生态环境的3个自然村(日玛村、塔玛村和京都村),每个村在人房和畜舍选择8个点,采用诱蚊灯全通宵(20∶00至次日08∶00)诱捕法捕捉按蚊,次日清晨收集诱捕的蚊虫,经形态学鉴定蚊种,分析按蚊组成。收集饱血按蚊,分别提取单只蚊胃血的DNA,采用基于不同动物mtDNA-cytb序列差异的多重PCR法鉴定各蚊胃血源,计算人血指数,分析按蚊的吸血习性。结果共捕获按蚊1 442只,经形态学鉴定,多斑按蚊种团占99.6%(1 436/1 442),带足按蚊和腹簇按蚊占0.4%(6/1442)。多斑按蚊种团中,伪威氏按蚊占85.5%(1228/1436),威氏按蚊占14.5%(208/1 436)。用多重PCR检测202只多斑按蚊种团(伪威氏按蚊188只和威氏按蚊14只)的饱血蚊胃血,结果显示,伪威氏按蚊兼吸牛/猪血和人血,人血指数为0.35,威氏按蚊吸食猪血和人血,人血指数为0.29。结论西藏察隅县2种常见按蚊(伪威氏按蚊和威氏按蚊)均兼吸人畜血,伪威氏按蚊的人血指数较高。     

西藏墨脱县不同海拔地区按蚊构成调查

目的探讨西藏墨脱县不同海拔自然村按蚊种类和构成。方法 2010年7月14日～8月17日,选择4种不同高度海拔的6个自然村作为调查点,在高海拔的甘德乡甘德村(海拔1966m),中高海拔的达木乡达木村(海拔1408m)与珠村(海拔1510m),中海拔的墨脱镇墨脱村(海拔1178m),低海拔的背崩乡地东村(海拔853 m)和背崩村(海拔831m),采用人诱、牛诱和灯诱等方法捕获成蚊,成蚊经形态学鉴定后处死,干燥保存带回实验室,多斑按蚊复合体采用多重PCR方法进行具体种型鉴定。结果共捕获按蚊5410只,其中高海拔区捕获按蚊2只,1只为大型按蚊贝氏亚种,另1只形态损伤无法鉴别,但形态学上可排除多斑按蚊复合体;中高海拔区捕获伪威氏按蚊541只(36.9%),威氏按蚊906只(61.7%),带足按蚊21只(1.4%);中海拔区捕获伪威氏按蚊260只(76.3%),威氏按蚊2只(0.6%),带足按蚊79只(23.2%);低海拔区捕获伪威氏按蚊3265只(90.7%),威氏按蚊19只(0.5%),带足按蚊315(8.8%)。中高、中和低海拔区通宵灯诱蚊虫密度分别为,伪威氏按蚊25.7、28.3和62.8只/夜,威氏按蚊41.5...     

伪威氏按蚊mtDNA-Cytb基因群体遗传学研究

目的探讨不同地理区域伪威氏按蚊的群体遗传结构与差异,发现伪威氏按蚊的群体遗传与进化规律。方法对云南、西藏和缅甸伪威氏按蚊,采用mtDNA-Cytb基因进行群体遗传分析;测序结果以Chromas（Version 2.13）进行核对,序列比对采用ClustalX进行,MEGA软件包统计序列特征,运用ARLEQUIN（Version 3.0）统计和计算各群体的基因序列碱基分化参数;群体遗传结构由ARLEQUIN的AMOVA模块计算群体间的分化参数Fst（F-statistics）、基因流水平Nm（Nm=1-Fst/4Fst）等指标;TCS 1.21计算群体中的单倍型并构建单倍型间的家系网络图;MEGA软件构建单倍型之间的系统聚类树。结果伪威氏按蚊mtDNA-Cytb基因均各扩增出单一清晰的目的条带;mtDNA-Cytb基因分子标志的TCS单倍型家系网络图显示高水平平行演化;单倍型NJ聚类未显示出聚类关系与地理距离之间的相关性;AMOVA分析发现群体内差异远远大于群体间差异,伪威氏按蚊不同群体2分子标志的Fst和Nm值分别为0.01696,4.168。结论 mtDNA-Cytb基因可以作为研究按蚊群体遗传结构的理想分子标志;伪威氏按蚊群体间交流频繁,目前尚未发生群体分化。     

西藏林芝地区墨脱县疟疾流行情况调查

目的 调查西藏林芝地区墨脱县疟疾流行情况。 方法 2006年7月选择墨脱县的墨脱、德兴和背崩等3个重点乡（镇）各2自然村进行居民2年内疟史调查，采耳垂血制厚薄血片和滤纸血滴进行血检、间接荧光抗体试验（IFAT）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏的检测；用疟疾快速诊断卡对发热病人进行检测。夜间人和畜房诱蚊灯诱捕、白天在按蚊栖息场所诱捕和半通宵室内外人饵诱捕进行媒介按蚊调查，捕获的蚊虫经分类鉴定后，计算蚊虫种类构成比和叮人率；并用ELISA检测部分按蚊唾液腺子孢子感染情况。 结果 调查点居民2年内有疟史率平均为8.98%（118/1 314）；居民血检阳性率为3.13%（38/1 216），发热病人血检阳性率为7.14%（3/42），均为间日疟原虫感染；IFAT抗体阳性率为40.24%（472/1 173）；G6PD缺乏检出率为1.74%（21/1 208）。共捕获4种按蚊513只，分别为多斑按蚊（474只）、带足按蚊（35只）、可赫按蚊（3只）和中华按蚊（1只），其中多斑按蚊为优势蚊种，占92.40%（474/513）。多斑按蚊的人房和畜房平均密度分别为4.75和69.5只/夜，室外半通宵叮人率为22.75只/人，多斑按蚊唾液腺子孢子阳性率为0。 结论 墨脱县存在间日疟流行。     

大劣按蚊和斯氏按蚊对约氏疟原虫不同易感性的遗传多态性研究

目的 比较分析对约氏疟原虫易感的斯氏按蚊和不易感的大劣按蚊的基因组DNA的多态性，探讨媒介按蚊与疟原虫遗传基因间的相互关系。方法 设计5条随机引物，应用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术对斯氏按蚊、大劣按蚊成蚊（未感染蚊和感染蚊）及其幼虫的基因组DNA进行随机扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后分析。结果 5条随机引物对2种按蚊扩增的条带数不同，其中P5对斯氏按蚊扩增的效果较好，共16～17条带型，长度为200～1800bp；P4对大劣按蚊扩增效果较好，出现17条带型，长度为180～1500bp；P1对大劣按蚊无扩增产物。用P3对2种按蚊扩增，感染前后的扩增产物电泳条带数相同，但亮度不同；成蚊与幼虫带型数量不同，斯氏按蚊成虫与幼虫有3条相同带型（400、650、850bp），大劣按蚊成虫与幼虫有4条相同带型（350、500、750、800bp）；大劣和斯氏按蚊成蚊带型分别为10和13条，其中相同带型6条（300、350、400、550、600、800bp）。结论 斯氏按蚊和大劣按蚊之间存在基因差异。同种未感染蚊和感染蚊基因带型仅存在亮度差异，而幼虫与成虫的基因差异较大。     

Molecular identification and phylogeny of the Maculatus group of Anopheles mosquitoes (Diptera: Culicidae) based on nuclear and mitochondrial DNA sequences

The Maculatus group of Anopheles mosquitoes (Diptera: Culicidae) comprises eight known species, including important malaria vectors in Southeast Asia. The sequences of the second internal transcribed spacer (ITS2) and third domain (D3) of ribosomal DNA, and cytochrome oxidase subunit II (COII) of mitochondrial DNA were obtained for five species of the group from China, as An. maculatus, An. willmori, An. pseudowillmori, An. sawadwongporni and An. dravidicus. The variation within taxon is much smaller than that between taxa. A diagnostic PCR assay for distinguishing the five members was developed based on the interspecific ITS2 variation. The phylogenetic relationships for the group were estimated on the ITS2 and D3 data. The Maculatus group appears monophyletic with An. pseudowillmori at a basal position, the Sawadwongporni subgroup and the Maculatus subgroup form sister clades. Our data concludes that An. dispar and An. greeni belong to the Maculatus subgroup, and An. willmori is not closer to either of the subgroups.     

应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究

目的 对我国猪源旋毛虫地理株进行鉴定和分类。 方法 根据旋毛虫rDNA扩展片段V区（expansion segment V region,ESV）和内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）ITS1和ITS2基因序列合成5对特异性引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T. nativa,T2）、布氏旋毛虫（T. britovi,T3）、伪旋毛虫（T. pseudospiralis,T4）及纳氏旋毛虫（T. nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用多重PCR对我国6个猪源旋毛虫地理株（河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津）进行鉴定,并观察影响多重PCR扩增的因素。 结果 我国6个猪源旋毛虫地理株多重PCR扩增结果显示,均具1条与T1相同的条带（173 bp）。应用多重PCR对单条旋毛虫幼虫、不同保存条件的旋毛虫幼虫及含幼虫的新鲜小鼠肌肉提取液进行扩增,均得到173 bp的特异性条带。 结论 经多重PCR鉴定我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。     

食蟹猴体内瓦氏瓦特松吸虫ITS序列测定及其种系发育分析

目的对分离自食蟹猴（Macaca fascicularis）的瓦氏瓦特松吸虫（Watsonius watsoni）进行初步形态学观察．测定其核糖体基因内转录间隔区（internal transcribed spacer region,ITS）序列,并分析其基于ITS2序列的系统发生关系。方法将从食蟹猴中分离的瓦氏瓦特松吸虫用盐酸卡红染色后观察其形态学特征。PCR扩增吸虫的ITSl与ITS2序列并测序：运用在线序列比对工具Clustal W2．将测序结果与ITS2数据库上部分同盘类吸虫及人兽共患吸虫致病种的序列进行多重比对分析．应用MEGA4．0软件,采用邻位相连法构建系统发生树进行分析。结果盐酸卡红染色后显示,瓦氏瓦特松吸虫各形态特征符合经典的分类学描述。PCR测序后获得ITS1、ITS2序列,提交GenBank后获得登录号分别为KC763806、GU999987,其中ITS2长度为295bp,（G＋C）含量为52．20％。基于ITS2建立的系统发生树显示,其与同归属于同盘总科腹盘科的野牛平腹盘吸虫（Homalogaster paloniae）、人拟腹盘吸虫（Gastrodiscoides hominis）构成自展值为95％的拓扑分支。结论测定了瓦氏瓦特松吸虫ITS序列．获得了基于ITS2的系统发生树。     

台湾蠛蠓rDNA-ITS序列测定与分析

目的 探讨rDNA-ITS基因序列在吸血蠓分子鉴定中的应用前景。方法 通过PCR扩增获取台湾蠛蠓rDNA-ITS基因,测定分析ITS1和ITS2基因序列,构建系统发育树。结果 台湾蠛蠓ITS1和ITS2片段长度分别为310 bp与360 bp,与汤斯维尔铗蠓的同源性最大,分别为71%和92%。系统发育分析显示,基于ITS1、ITS2基因序列的分子鉴定结果与传统形态学鉴定结果一致。结论 rDNA-ITS基因序列可作为蠓科昆虫分子鉴定的分子标记。     

Anopheles (Cellia) maculatus group: Its spatial distribution and molecular characterization of member species in north-east India

Anopheles (Cellia) maculatus is considered a group of at least nine formally named species. Faced with the difficulty of correct morphological identification due to overlapping characters, several member species of the An. maculatus group are known to play important role in malaria transmission in the Oriental region. Current assemblage, distribution and vectorial importance of the member species within the Maculatus group is far from clear in the north-eastern region of India. Our study encompassing 410 individuals, collected from 67 geo-referenced spots across the eight north-east Indian states, identified the presence of 6 member species of the Maculatus group using the molecular tools. Anopheles dravidicus and Anopheles rampae were documented for the first time in this part of India with latter forming the new country record. While Anopheles pseudowillmori (59.5%) and An. maculatus (32%) were widely available species in most of the north-eastern states, restricted distribution of Anopheles willmori to Nagaland and that of Anopheles sawadwongporni and An. rampae to Mizoram state was noted. None of the species was found positive for human malaria parasite. While no intraspecific differences existed in the sequences of second internal transcribed spacer (ITS2) region of ribosomal DNA (r-DNA) of the member species of the Maculatus group within north-east India, few differences were detected in the sequences of An. dravidicus, An. maculatus and An. pseudowillmori from north-east India with species from the neighbouring countries.