呼吸道合胞病毒单克隆抗体逃逸株体内适合度研究

目的 此前研究已在体外筛选获得呼吸道合胞病毒(RSV)Palivizumab(PZ)逃逸株MP4,体外评估发现MP4适合度高于A2母株,本研究在免疫缺陷棉鼠模型中进一步评价MP4体内适合度.方法 采用大剂量环磷酰胺腹腔注射法制备免疫抑制鼠模型,将PZ逃逸株MP4和母株A2等量混合,经鼻腔接种免疫缺陷动物模型,于接种后4天和4周分批处死动物,取动物肺脏组织研磨后采用差异噬斑形成法或核苷酸序列图谱分析法检测混合病毒群体中母株A2和逃逸株MP4的相对含量,以代表MP4相对于A2的适合度.将肺内病毒F基因片段RT-PCR扩增产物克隆并转化大肠杆菌,随机挑取部分菌落再行PCR扩增F基因片段及序列测定,观察F基因第828位碱基并计算A2株和MP4相对含量.结果 差异噬斑法结果显示接种后4天和4周棉鼠肺内病毒混合群体中均以MP4占优,序列图谱分析发现接种后4周8只棉鼠中7只肺内MP4占优.接种后4周克隆的8只棉鼠F基因片段78%(120/154)为MP4基因信号.结论 与体外适合度结果类似,MP4在棉鼠肺内的适合度高于A2母株,提示与MP4基因型相同的逃逸株一旦产生,可能在免疫缺陷个体间传播.     

呼吸道合胞病毒逃逸株对单克隆抗体预防的抗性比较

目的 Palivizumab（PZ）是目前临床使用的惟一一个预防人类感染性疾病的单克隆抗体，本研究评估不同逃逸株在棉鼠体内对PZ预防的抗件。方法在细胞培养系统中筛选获得PZ逃逸株，测定其全长F基因序列，用微量中和法评估逃逸株对PZ的抗性，在棉鼠模型体内观察逃逸株对PZ预防的抗性差异。结果筛选获得的PZ逃逸株于F蛋白内第268位氨基酸（F212）和272位氨基酸（MP4、MS312、MS412和MS512）发生替换。用Western blot检测发现所有逃逸株PZ识别位点抗原性改变。F212复制能力受损，而其他逃逸株复制能力与A2母株接近。与A2原型株比较，MP4和MS412在体内外对PZ的中和活性具完全抗性。F212体外对PZ中和活性显示不完全抗性，但大剂量PZ在棉鼠体内仍能有效预防F212感染。结论不同PZ逃逸株体内对PZ的预防效应可能具有不同程度的抗性，某些逃逸株即使在PZ筛选压力下产生，亦不一定导致临床后果。     

呼吸道合胞病毒逃逸株对单克隆抗体预防的抵抗

目的探讨体外筛选的呼吸道合胞病毒抗体逃逸株生长特性、F蛋白免疫反应性及在棉鼠体内对抗体免疫预防的抵抗，旨在证实用单克隆抗体免疫预防的负面效应，为今后临床可能出现的抗体逃逸株提供线索。方法呼吸道合胞病毒(RSV)A2株在逐渐升高的Pahvizumab(PZ)浓度环境中连续传代5次并经单噬斑纯化后获得PZ逃逸株MP4。用RT-PCR法扩增A2及MP4全长F基因并自动测序；用微量中和试验鉴定MP4在体外对PZ中和反应的抗性；用Western blot鉴定其F蛋白免疫反应性的变化；最后在棉鼠模型内观察PZ预防A2和MP4感染的效果。结果与A2母株比较，MP4于F基因828位核苷酸发生突变(A→T)，导致272位推导氨基酸由赖氨酸变为甲硫氨酸。MP4在体外及在棉鼠肺内的生长能力无明显改变。MP4F蛋白虽仍可表达于受感染细胞膜上，但不再被PZ识别。动物实验证实，即使大剂量PZ亦不能预防MP4感染。结论体外筛选的PZ逃逸株在棉鼠模型体内对同一抗体的免疫预防具有极强的抗性，类似情况是否会在人体内发生及是否会导致严重后果尚有待进一步研究。     

呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的：建立能稳定分泌抗呼吸道合胞病毒（RSV-long株,国际标准株）单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法：杂交瘤技术制备单抗,鉴定各项特性。结果：培育出稳定分泌抗RSV蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞5株。杂交瘤细胞株染色体数目在89～104条之间,其分泌的抗体分别属于鼠IgG1、IgG2a、IgG2b亚类,各种腹水单抗的荧光效价在1∶4000～1∶16000之间。一种单抗识别RSV基质蛋白（M）,两种单抗识别RSV融合蛋白（F）,另两种单抗识别RSV核衣壳蛋白（N）。单抗中和效价最高达1∶64。相加指数证实5种单抗识别不相关的抗原表位。用硫氰酸铵洗脱法比较了五种单抗相对亲和力的大小,依次为：1#〉2#〉4#〉3#〉5#。所有杂交瘤细胞株,经连续3个月培养及冻存半年后复苏,细胞生长良好,检测上清,其分泌抗体效价稳定。结论：已获得抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体,为RSV感染的早期诊断及进一步研究奠定了基础。     

5株呼吸道合胞病毒地方株F蛋白基因序列分析

目的呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ｆ蛋白是ＲＳＶ感染免疫中最重要的病毒蛋白，为了解我国ＲＳＶ地方株Ｆ蛋白的基因状况和变异特征，随机选取北京、广州、长春和河北四个地区具有不同流行特征的ＲＳＶ地方株（Ａ亚型）５株，进行ＲＳＶＦ蛋白全基因的核苷酸序列分析。方法以提取的病毒ｍＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增、目的基因的克隆及序列测定，对地方株及原型株的序列进行比较分析。结果地方株Ｆ蛋白基因与原型株Ａ２株有很高的同源性，核苷酸全序列的同源性为９５．１％～９６．１％，氨基酸同源性为９６．７％～９７．４％。核苷酸有义突变率为２２．６％～２５．９％。３非编码区的核苷酸序列比蛋白编码区变异显著。河北地方株（Ｅ７３株）在３非编码区有６个核苷酸的插入。Ｆ２亚单位的氨基酸变异高于Ｆ１亚单位。在北京地方株（ＺＨＳ１３株）Ｆ１亚单位内，由具有中和能力单克隆抗体所识别的抗原表位区中存在一个氨基酸的变异。结论我国ＲＳＶ地方株与原型株之间的Ｆ蛋白基因尽管存在一定的变异，但仍有很高的同源性。地方株间Ｆ蛋白的核苷酸、氨基酸变异的位置及形式很相似，提示我国ＲＳＶ的不同流行特征可能并非由于Ｆ蛋白的基因变异所致。     

呼吸道合胞病毒分离株N蛋白编码基因特征分析

目的 阐明人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)A和B亚型病毒分离株的核蛋白(nucleoprotein,N)编码基因特征.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(revelrse transciptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)对北京2004年分离的HRSV代表株(2株A亚型和2株B亚型)进行N基因全长序列扩增、测序,并和GenBank下载的所有HRSV病毒的N基因全长序列进行对比和分析.结果 2株HRSV A亚型分离株与A亚型Long株(标准株)的N蛋白的核苷酸和氨基酸差异分别为36～40个(3.1%～3.4%)和4个(1.0%);2株HRSV B亚型分离株与B亚型CH18537株(标准株)的N蛋白之间的核苷酸和氨基酸差异分别为17(1.4%)和1(0.3%)个.4株HRSV代表株和从GenBank下载的HRSV的N蛋白之间的核苷酸和氨基酸差异分别为3～172个(0.25%～14.63%)和0-18个(0～4.6%).结论 N基因在HRSV基因组中是较为保守的基因,A或B亚型的型内差异相对较小;但A和B亚型之间N基因序列有较大变异,变异平均分配于整个N基因中;本研究为HRSV基因快速诊断试剂的研制提供了基因信息学数据.     

呼吸道合胞病毒 L 蛋白单克隆抗体的制备

目的：制备人呼吸道合胞病毒L蛋白单克隆抗体,并对其进行性质鉴定。方法：选取RSV-A2 L蛋白上具有亲水性可能的loop区段,将这些目的片段展示在HBc149上进行原核表达并纯化。重组蛋白免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,根据免疫后血清的ELISA和WB分析结果选择L3935和L4099组小鼠进行脾脏免疫。融合后,用间接ELISA法筛选和多次克隆化,获得稳定分泌抗L蛋白单克隆抗体细胞株,并结合ELISA、免疫荧光和免疫印迹对所获得的单抗进行鉴定。结果：获得11株L蛋白特异性单克隆抗体,亚类鉴定结果IgG1、IgG2a和IgG3单抗各3株,IgG2b单抗2株。结论：成功制备了L蛋白特异性单克隆抗体,也为RSV感染的免疫和发病机制研究奠定基础。     

我国部分地区呼吸道合胞病毒地方株磷蛋白基因序列分析

目的 了解我国呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）地方株的Ｐ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｐｒｏｔｅｉｎ,Ｐ）蛋白基因状况和变异特征。方法 选取不同地区具有不同流行特征的６株ＲＳＶ地方株,以提取的病毒ｍＲＮＡ为模板进行逆转录－聚合酶链扩增（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增、目的基因的克隆及序列测定分析。结果 地方株和同亚型原型株之间Ｐ蛋白核苷酸序列及推导出的氨基酸序列同源性均超过９５％;不同亚型间存在较大差异,核苷酸全序列同源性低于８５％,尤其在３′端非编码区及中间变异区。由氨基酸序列推导出的疏水性分析图显示,Ａ、Ｂ亚型中间变异区存在疏水性的不同,这为解释Ａ、Ｂ亚型间Ｐ蛋白电泳迁移率的不同提供了一种可能。结论 我国ＲＳＶ地方株与原型株之间的Ｐ蛋白无论在核苷酸水平还是在氨基酸水平均存在一定的变异。这些结果对于了解我国ＲＳＶ地方株的基因状况提供了有益的     

呼吸道合胞病毒的分型研究

目的 了解北京地区１９９０￣１９９１年和１９９７￣１９９８年两个非连续的流行年中呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）Ａ、Ｂ亚型和基因型的流行情况。方法 用间接免疫荧光法（ＩＩＦ）检测ＲＳＶ阳性鼻咽分泌物（ＮＰＳ）标本或ＲＳＶ分离株,划分Ａ、Ｂ亚型。根据Ｎ基因片段的限制性酶切图型将ＲＳＶ分离株分成至少６个基因型ＮＰＩ－６ＮＰＩ,３和６属于Ｂ亚型,ＮＰ２４和５属于Ａ亚型。根据ＳＨ基因片段的核苷酸序列将Ａ亚型分离株     

呼吸道合胞病毒病原学和疫苗研究现状

呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）可分为Ａ、Ｂ两亚型，其结构蛋白中，Ｆ蛋白与Ｇ蛋白与诱发保护性免疫应答有关，灭活ＲＳＶ疫苗接种无保护作用，减毒活性疫苗和亚单位疫苗可作为候选疫苗。     

呼吸道合胞病毒感染的研究进展

呼吸道合胞病毒是在世界范围内引起婴幼儿呼吸道感染的最常见病原微生物,它不仅可以引起呼吸系统的一些常见症状和体征,而且在肺外器官如中枢神经系统、心血管系统、内分泌系统等各器官也可引起一些尚未被人们普遍认识的肺外表现,而这些临床特点的重要性也愈来愈受到人们的重视.     

蛭丹化瘀口服液体外抑制RSV作用机制的研究

目的 研究蛭丹化瘀口服液体外抗呼吸道合胞病毒作用环节.方法 观察该药在不同浓度和不同的作用环节下RSV对Hep-2细胞的致病作用.结果 蛭丹化瘀口服液对细胞无毒浓度为5.5 mg/ml,并在此浓度中未能阻断RSV对细胞的吸附,细胞产生了完全病变.蛭丹化瘀口服液在2.75～5.50 mg/ml浓度中,药物直接灭活病毒组和先感染细胞再加入药物的治疗组均未产生细胞病变.结论 蛭丹化瘀口服液体外实验无预防RSV感染作用,有直接灭活RSV作用,并对进入细胞内的RSV有抑制作用.     

PPARγ激动剂抗呼吸道合胞病毒感染作用的体外研究

目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）激动剂的体外抗呼吸道合胞病毒（RSv）感染作用.方法 以细胞存活率和病毒抑制率为指标,应用细胞病变效应（CPE）法,观察不同浓度PPARγ激动剂对人肺腺癌（A549）细胞的CPE及RSV感染后CPE的抑制作用.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测PPARγ激动剂对A549细胞的毒性作用和RSV感染后细胞存活率和病毒抑制率的影响.结果 5～25μ mol/L15-脱氧前列腺素J2（ 15 d-PGJ2）和10～50μmol/L罗格列酮干预的A549细胞未显示明显CPE,MTT比色法也显示以上浓度范围15 d-PCJ2和罗格列酮的A值明显高于RSV感染组（P＜0.01）,但两种药物相比差异无统计学意义.15d-PGJ2和罗格列酮最适浓度分别为5μmol/L和10 μmol/L.结论 PPARγ激动剂既可减轻RSV感染后A549细胞的CPE,又可提高细胞存活率,具有体外抗RSV感染作用.     

Structural characterization of respiratory syncytial virus fusion inhibitor escape mutants: homology model of the F protein and a syncytium formation assay

Respiratory syncytial virus (RSV) is a ubiquitous human pathogen and the leading cause of lower respiratory tract infections in infants. Infection of cells and subsequent formation of syncytia occur through membrane fusion mediated by the RSV fusion protein (RSV-F). A novel in vitro assay of recombinant RSV-F function has been devised and used to characterize a number of escape mutants for three known inhibitors of RSV-F that have been isolated. Homology modeling of the RSV-F structure has been carried out on the basis of a chimera derived from the crystal structures of the RSV-F core and a fragment from the orthologous fusion protein from Newcastle disease virus (NDV). The structure correlates well with the appearance of RSV-F in electron micrographs, and the residues identified as contributing to specific binding sites for several monoclonal antibodies are arranged in appropriate solvent-accessible clusters. The positions of the characterized resistance mutants in the model structure identify two promising regions for the design of fusion inhibitors.     

The immunobiology of respiratory syncytial virus infection

There is increasing evidence that young children with severe respiratory syncytial virus (RSV)-induced bronchiolitis are at high risk of developing allergy and asthma during their later life. The determinants for this association are not well understood. Current studies suggest that both genetic backgrounds and unique characteristics of the virus play critical roles in determining the type of immune responses to RSV infection, leading to altered regulation of airway tone associated with wheezing. In susceptible subjects, RSV may either enhance the Th2 immune response or decrease the Th1 immune response. This altered Th1/Th2 cytokine response associated with RSV infection is not commonly observed among other RNA viruses, suggesting that RSV may have unique characteristics. Multiple clinical studies support the link between severe RSV bronchiolitis and the subsequent development of allergy and asthma. This link will be further tested by the ongoing large studies on the effect of early RSV intervention on the development of allergy. The administration of palivizumab, an anti-RSV monoclonal antibody, seems to be helpful for RSV prevention and treatment at early stage. There are no effective RSV vaccines available, and this is, at least in part, because of the poorly understood immunology and pathogenesis of RSV disease. The use of experimental animal models has led to a better, but not sufficient, understanding of the immunologic basis of RSV-induced disease, particularly asthma. Further studies on the immunopathology of RSV infection with animal models, including the nonhuman primate models, may help develop effective RSV vaccines.     

TH1细胞在呼吸道合胞病毒毛细支气管炎发病机制中的作用

目的：探讨呼吸道合胞病毒（RSV）毛细支气管炎（毛支）发病中是否存在THl细胞免疫反应。方法：用ELISA法检测58例RSV毛支患儿急性期血浆IL-2含量。根据临床评分标准、供氧和住院时间长短的标准，进行严重程度分组并比较。结果：RSV毛支急性期血浆IL-2含量变化很大（0～4175ng／ml），中位数96ng／ml（4．0～530．1）。各组间比较，IL-2水平差异无显著性（均P〉0.05）；且IL-2水平与各严重因素无明显相关性（P〉0．05）。结论：TH1细胞可能不参与RSV毛支的发病机制，IL-2的改变可能系其他原因所致。     

Respiratory syncytial virus vaccine development

The importance of RSV as a respiratory pathogen in young children made it a priority for vaccine development shortly after it was discovered. Unfortunately, after over 50 years of vaccine development no vaccine has yet been licensed and it is not certain which if any vaccines being developed will be successful. The first candidate vaccine, a formalin inactivated RSV vaccine (FI-RSV), was tested in children in the 1960s and predisposed young recipients to more serious disease with later natural infection. The ongoing challenges in developing RSV vaccines are balanced by advances in our understanding of the virus, the host immune response to vaccines and infection, and pathogenesis of disease. It seems likely that with efficient and appropriately focused effort a safe and effective vaccine is within reach. There are at least 4 different target populations for an RSV vaccine, i.e. the RSV naïve young infant, the RSV naïve infant >4–6 months of age, pregnant women, and elderly adults. Each target population has different issues related to vaccine development. Numerous vaccines from live attenuated RSV to virus like particle vaccines have been developed and evaluated in animals. Very few vaccines have been studied in humans and studies in humans are needed to determine which vaccines are worth moving toward licensure. Some changes in the approach may improve the efficiency of evaluating candidate vaccines. The complexity of the challenges for developing RSV vaccines suggests that collaboration among academic, government, and funding institutions and industry is needed to most efficiently achieve an RSV vaccine.     

BALB/c鼠和裸鼠呼吸道合胞病毒感染比较研究

目的 比较普通BALB/c鼠和裸鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染免疫及炎症反应特点.方法 BALB/c鼠和裸鼠感染RSV后不同时间空斑形成试验检测肺组织病毒滴度,计数支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞总数和分类,HE染色分析肺组织病理学改变,免疫组化检测肺组织F4/80+细胞和CD49b+细胞.ELISA检测BALF中TNF-α、IFN-r、IL-12和IL-10浓度.结果 BALB/c鼠和裸鼠感染RSV后肺组织病毒滴度在第3天达峰值,感染裸鼠带毒时间更长,在感染后各天病毒滴度明显高于BALB/c鼠(P＜0.05),肺组织病理改变也更重.感染BALB/c鼠和裸鼠BALF白细胞总数明显升高,分类以淋巴细胞为主.感染裸鼠与感染BALB/c鼠比较,肺组织检测到更多的F4/80+巨噬细胞和CD49b+NK细胞(P＜0.05),BALF中TNF-α、IL-12和IL-10水平更高(P＜0.05).结论 RSV感染裸鼠与BALB/c鼠比较,病毒复制水平更高,时间更持久,炎症反应更重.单核巨噬细胞和NK细胞是RSV感染重要的免疫细胞和炎症细胞,炎症反应强度并不一定与T细胞免疫应答平行.