移植于同系大鼠脾脏的肝细胞超微结构研究

本实验将游离肝细胞移植于同系大鼠脾脏内,在超微结构水平观察1—18个月期间在脾脏增殖的肝细胞,发现移植12个月后在脾脏生成的“异位肝”具有正常肝组织细胞的各项超微结构特征。对贮脂细胞、内皮细胞、吞噬细胞以及胆小管上皮细胞的来源及其与肝细胞器官化而形成“异位肝”的机理进行讨论。     

微囊化人肝细胞移植对小鼠急性肝衰竭的治疗作用

目的：评价微囊化人源性肝细胞腹腔内移植对四氯化碳诱导的小鼠急性肝功能衰竭的治疗作用，为微囊化异种肝细胞在肝细胞移植的临床应用提供实验依据。 方法：实验于2005-02／2006-01在中国科学院大连化学物理研究所，生物技术部生物医学材料工程实验室完成。①采用自制静电液滴发生器制备海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠胶囊，应用四氯化碳腹腔注射建立急性肝功能衰竭动物模型，以谷草转氨酶、谷丙转氨酶高出正常值10倍以上作为判定肝功能衰竭的具体标准。②取造模成功的急性肝衰竭小鼠90只，随机分为空囊组、微囊化细胞组、游离细胞组，30只／组。各组均于注射四氯化碳24h后进行移植实验：空囊组腹腔注射含有空囊的生理盐水，微囊化细胞组腹腔注射微囊化肝细胞悬液，游离肝细胞组腹腔注射游离肝细胞悬液，均1mL／只。③每组随机取出10只用于观察8d存活率，其余小鼠分别于移植后1，2，4，8d经眼球后静脉丛采血，进行肝功能检测谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，每组5只／次。并回收微胶囊观察其形态，对回收的微囊化细胞进行组织切片细胞活性观察。 结果：成功建立急性肝衰竭模型的90只小鼠全部进入结果分析。①移植后不同时间点各组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平的变化：移植后第1，2天，微囊化细胞组的两种转氨酶水平均显著低于游离细胞组和空囊组（P〈0．05）。到移植后第8天各组间转氨酶水平基本相似（P〉0．05）。②各组小鼠移植8d存活率的比较：微囊化细胞组小鼠的存活率显著高于空囊组、游离细胞组（90．0％，50．0％，60．0％，P〈0．05）。③腹腔移植微胶囊的形态及囊内细胞活性观察结果：回收的微胶囊形态完整光滑，未见明显的纤维包裹，囊内细胞呈圆形，细胞膜完整光滑，胞浆饱满，仍有90％以上肝细胞存活。 结论：微囊化人源性肝细胞腹腔内移植可以提高药物诱导急性肝衰竭小鼠的存活率，改善急性肝衰小鼠的肝脏功能。提示生物微胶囊可以有效阻断免疫排斥作用，保护移植的肝细胞，有利于其发挥生物功能。     

大鼠创伤性脑损伤后神经干细胞的增殖及移植后的修复作用

目的：基于神经于细胞的自我更新和多向分化的特点，探讨创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI)后神经于细胞(neural stem cells．NSCs)的增殖及其移植对脑损伤的修复作用。方法：实验于2004年在复旦大学附属华山医院神经外科动物实验室完成．采用Feeney氏法制备大鼠创伤性脑损伤模型，随机分为对照组、损伤组、PBS治疗组、NSCs移植治疗组，免疫组化检测大鼠损伤后海马NSCs的数量；用绿色荧光蛋白(GFP)标记的NSCs立体定向移植。神经损害严重程度评分和旋转爬杆试验对移植后大鼠的神经系统行为和运动功能进行评估，免疫组化染色观察NSCs的分化情况。结果：TBI后7d海马齿状回nestin阳性细胞明显增多，为(8．1&;#177;2．5)个，与正常动物组(2．5&;#177;1．3)个比较差异有非常显著性意义(F=40．91，P&;lt;0．01)。移植后部分GFP阳性细胞表达神经元特异性标记物β-tubilin Ⅲ，移植组大鼠神经系统行为学评分明显改善。结论：TBI后移植NSCs可以有效地促进损伤后大鼠神经行为功能的恢复，NSCs能够分化为神经元从而发挥对损伤后的大脑的修复作用。     

肝细胞移植免疫排斥反应的研究与应用

学术背景:肝细胞移植有望成为治疗急慢性肝衰竭及肝脏相关遗传性疾病的一种新方法。近年来肝细胞移植研究取得了重大进展,但免疫排斥反应仍是制约该技术进一步发展的主要原因之一。目的:综合分析肝细胞移植后免疫排斥反应的研究进展。检索策略:由两位作者应用计算机检索中国知网(www.cnki.net)及Medline(www.pumed.com)1998-01/2007-06有关肝细胞移植免疫排斥反应的文献,中文检索词"肝细胞,移植,排斥";英文检索词"hepatocyte,transplan tation,rejection"。初检得到281篇文献,包括中文109篇,英文172篇。排除研究目的与肝细胞移植免疫排斥反应无关者72篇,内容重复性的文献41篇,保留168篇中英文文献进一步分析。其中动物实验和细胞学实验103篇,综述类文献28篇,临床研究37篇。按纳入标准筛选,共37篇文献满足全部纳入标准。凡同种或异种肝细胞培养、移植及生物人工肝研究中与免疫排斥反应相关的文献均纳入文献综述范围,与此无关者均排除。不采用未发表的文献。文献评价:所有文献均为随机对照试验。资料综合:肝细胞移植免疫排斥反应是影响肝细胞移植效果的重要因素。随着细胞生物学、移植免疫学的发展,肝细胞移植免疫排斥反应的机制将会进一步得到阐明。各种抑制免疫排斥的手段,尤其基因工程技术、纳米材料的应用有可能在肝细胞移植后抗原的识别、活化和发生效应的环节中以及抑制移植细胞的凋亡方面起到一定的作用。结论:肝细胞移植目前面临的主要问题是移植后的免疫排斥反应,其具体机制仍有待于进一步阐明。现阶段采取的抑制肝细胞移植后免疫排斥的方法均有一定的局限性,更有效的方法有待于继续探索。     

异基因外周血造血干细胞移植后血型基因型与抗原的转变

目的 探讨异基因外周血造血干细胞移植(Allo—PBSCT)后患者ABO、Rh血型的转变在血液病移植治疗中的意义。方法 选择2例非血源关系的供、受者作为研究对象，采用基因分型与血清学方法检测移植前后ABO、Rh血型的表达，追踪移植后患者血型基因型与抗原的转变。结果 2例患者分别在移植后第7天与第10天检测到供者的A、Rh(c)基因，第7天与第15天不同程度地表达供者的ABO、Rh血型抗原。结论 观察ABO与Rh血型的转变可作为植入证明的检测方法之一，且直观、迅速。     

兔肝细胞的脾脏移植和定位初步研究

【目的】探讨肝细胞体内移植的途径和定位分析。【方法】从新西兰白兔的肝脏中分离获得原代肝细胞,经纯化培养后经脾动脉插管或注射移植到脾脏,在不同时间注射肝细胞特异性增强剂（扎贝葡胺）,观察移植后脾脏核磁信号的变化和移植肝细胞的存活,并分析细胞移植前后肝功能变化。【结果】肝细胞移植入脾脏一段时间后受损肝功能明显改善。脾脏内可见肝细胞信号,d,信号最强,以后逐渐衰退并持续14d以上。【结论】肝细胞脾内移植是可行的;应用肝细胞增强剂进行MRl分析可成为肝细胞移植无创伤检测手段。     

骨髓间质干细胞移植后心肌梗死区的超微结构变化

目的观察骨髓间质干细胞(MSCs)移植后心肌梗死区的超微结构变化,探讨MSCs移植治疗急性心肌梗死(AMI)的可能机制。方法于冠状动脉左前降支结扎后1～2h,将5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记的MSCs注射至心肌梗死区,6周后采用免疫组化法鉴定宿主心肌内存活的MSCs,于透射电镜下观察心肌梗死区的超微结构。结果MSCs组梗死心肌内可见BrdU阳性细胞。电镜下,MSCs组可见幼稚的细胞:胞核大,染色质颗粒细而均匀,以常染色质为主,可见由肌微丝刚形成的小肌原节和发育程度不同的肌原纤维,部分与正常心肌形成缝隙连接。和MSCs组比较,AMI组可见肌纤维断裂、坏死严重,线粒体肿胀,内有黑色绒球状颗粒。结论MSCs移植能减轻心肌细胞坏死,并有可能通过分化为心肌细胞来修复梗死心肌。     

肝细胞生长因子基因转染脂肪细胞对移植组织工程脂肪存活的影响

背景：在脂肪组织工程的研究中，若将种子细胞与支架材料复合后移植，则此组织工程脂肪将可替代颗粒脂肪。肝细胞生长因子可以促进皿管生成、减少纤维组织增生。目的：观察肝细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞对大鼠组织工程脂肪移植存活的影响。设计、时间及地点：随机区组设计的动物实验，于2006-08，2007-07在解放军兰州军区兰州总医院医学科学实验中心完成。材料：纳入Wistar大鼠用于分离、培养骨髓间充质干细胞及植入细胞一支架复合物。方法：①分离培养雄性大鼠骨髓间充质干细胞，诱导成脂，携带绿色荧光蛋白基因及肝细胞生长因子基因的重组腺病毒毒株分别转染脂肪细胞，流式细胞仪测定转染效率，应用酶联免疫吸附试验法测定培养上清中肝细胞生长因子的表达，将脂肪细胞接种于聚乳酸聚乙醇酸共聚物支架。②将75只Wistar雌性大鼠按随机数字表法分为3组：脂肪细胞组、Ad-肝细胞生长因子转染组及Ad-绿色荧光蛋白转染组分别将脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染肝细胞生长因子基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物、转染绿邑荧光蛋白基因脂肪细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚物移植于大鼠腿部肌肉之间。主要观察指标：移植后3，7，14，28，60d，每组各取5只大鼠麻醉后处死，取出移植物。电镜观察：并行苏木精-伊红、油红O、Masson’s染色，观察病理改变；同时用免疫组织化学法检测组织中肝细胞生氏因子表达，观察并计数血管生成。结果：①骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞胞浆内富含丰富的脂滴，重组腺病毒感染复数=100时，携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒株转染脂肪细胞效率可达64．39％。②移植3，7，14d时，Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中肝细胞生长因子的表达高于其他组（P〈0．05），且3d达到高峰。③移植3，7，14，28，60d时，Ad-肝细胞生长因子转染组移植物中血管生成高于其他组（P〈0．05），且7d时血管增加的幅度最大。④移植28，60d时，Ad-肝细胞生长因子转染组坏死程度均小于其他组，电镜下脂肪细胞也多于其他组。结论：携带肝细胞生长因子基因的脂肪细胞在移植物中能够表达肝细胞生长因子，促进移植组织工程脂肪皿管生成，进而促进移植组织的成活。     

rAAV/HCV核心抗原基因转染树突状细胞的实验研究

目的:研究rAAV/丙型肝炎病毒核心抗原基因[hepatitis C virus(HCV)core gene]转染树突状细胞(dendritic cell,DC)的可行性。方法:构建重组质粒AAV(d16-95)/Core p5(简称rAAV/Core),并以pSH3包装系统制备该病毒。分离外周血单个核细胞(DC前体细胞),以rAAV/Core病毒转染DC前体细胞(基因转染组),采用巨噬细胞集落刺激因子、白介素-4、肿瘤坏死因子-α诱导成熟。3d后,收集部分DC,以流式细胞仪检测rAAV/Core转染效率及HCV核心抗原在DC中的表达情况。7d后,收集细胞,PCR/Southern blot分析rAAV/Core DNA在DC染色体的整合情况。显微镜下观察DC形态,流式细胞仪检测DC表面分子标志CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86的表达情况。结果:rAAV/Core成功转染DC,质粒DNA整合到DC染色体上,HCV核心抗原基因在DC内表达,DC成熟不受病毒转染影响,具有典型DC外观并高表达特异的成熟DC表面标志。结论:rAAV/Core转染和制备DC的成功为丙型病毒性肝炎的DC免疫治疗打下实验室基...     

转染SV40永生化基因对正常成人肝细胞生长特性的影响

背景:生物型人工肝采用猪肝细胞或肝癌细胞作为移植物来源存在动物源性疾病和致瘤性的担心,而正常成人肝细胞也具有一定的局限性.目的:通过检测转染前、后正常成人肝细胞的活率、生长曲线和细胞周期的变化,了解转染SV40永生化基因对正常成人肝细胞生长特性的影响.方法:培养不同时间的正常人肝细胞和永生化正常成人肝细胞,采用胎盘蓝染色和AO-PI染色,于培养后1～8 d采用MTT染色法计数细胞活率;用MTT比色法测定细胞的A值并绘制生长曲线;采用流式细胞术检测细胞的生长周期.结果与结论:3种染色法检测显示两种细胞的活率为95%～99%,存活率无明显差异.转染前、后的两种正常成人肝细胞的生长曲线无明显差异,均在培养3～5 d时呈指数型生长,但转染后正常成人肝细胞较转染前增殖略快.采用流式细胞术测得的两种肝细胞的细胞周期:转染后肝细胞S期细胞占65.64%,G_0～G_1期细胞占34.36%,G_2期细胞占0%;转染前肝细胞S期占21.27%,G_0～G_1期细胞占62.64%,G2期细胞占12.09%,提示转染后肝细胞的S期细胞明显增多,增殖能力增强.转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞较转染前细胞的增殖活力增高,存活率无明显差异,提示转染后细胞增殖能力更强.     

SV40T基因转染黑素细胞遗传稳定性研究

目的 探讨SV40T抗原基因转染构建的永生化黑素细胞的遗传稳定性。方法 体外培养黑素细胞，对第20代的永生化黑素细胞进行四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法分析细胞增殖情况，同时分析染色体核型，流式细胞仪分析细胞周期和DNA倍体；逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）半定量分析第20代细胞hMLHl、hMSH2错配修复基因表达，并提取细胞基因组，微卫星位点PCR产物进行变性聚丙烯酰胺电泳分析微卫星不稳定性。结果 经过连续培养的第20代转染的黑素细胞左旋多巴染色阳性，增殖速度较原代培养黑素细胞明显增快，细胞周期S＋G2期细胞比例较原代黑素细胞增多，同时未见异常DNA倍体，染色体仍为2倍体，转染细胞的hMLHl、hMSH2错配修复基因表达较正常黑素细胞上调；在1p22（D1S187）、5q14（D5S107）、18q12．2—12．3（D18S34）3个位点未出现微卫星不稳定性（microsatellite instabilitv，MI）。结论SV40T抗原基因转染的黑素细胞体外培养不出现遗传稳定性的异常改变。     

SV40-based gene therapy vectors: turning an adversary into a friend

For gene delivery to be of use, a situation suitable for delivery of genetic material, a specific genetic construct to be delivered and the appropriate means to deliver it are required. Simian virus-40 (SV40) gene therapy vectors for gene transfer may be an important advance in the latter category. While other vectors are variably limited for example by immunogenicity, difficulties in production, restricted specificity, low titers, poor transduction efficiency, etc., recombinant viral vectors based on SV40 (rSV40) should not be similarly constrained. They are easily manipulated and produced at very high titer, stable, apparently lacking in immunogenicity, and capable of providing sustained high levels of transgene expression in almost any cell type, whether resting or dividing. The major limitation of SV40-derived vectors is packaging capacity, which restricts insert sizes. The rationale for developing SV40 as a gene therapy vector is reviewed, based on what is known of wild-type SV40. Studies with rSV40 gene transfer have focused mostly on hematopoietic progenitor cells (CD34+) and their derivatives, and on gene delivery to the liver. In both settings, in vitro and in vivo, SV40 has been very effective. It is therefore a highly promising gene delivery vehicle that may complement other vectors that are currently in use or that are being developed.     

脂质体介导基因转染人精子膜蛋白PH20DNA疫苗质粒向小鼠骨骼肌导入

目的:精子膜蛋白PH-20分布在精子表面,在受精过程中起重要作用,可作为免疫避孕候选疫苗.采用脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1( )-hPH20DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中,检测目的基因hPH-20在体内的表达水平.方法:实验于2006-06/2007-02在郑州大学解剖学实验室完成.①清洁级健康BALB/C小鼠12只,随机数字表法分为重组质粒组、空载体组、生理盐水组,4只,组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.已构建好的pcDNA3.1( )-hPH20重组质粒由本室保存.②实验方法:质粒提取后,用精胺盐酸去除内毒素,鲎试剂榆测晕阳性代表去除成功.取少量质粒行琼脂糖电泳鉴定纯度,用紫外分光光度计测量质粒DNA的含量.每只小鼠于股四头肌分点注射利多卡因预处理3 d.重组质粒组将脂质体包裹的peDNA3.1( )-hPH20 DNA缓慢注射于股四头肌内,200μg/只.空载体组单纯将pcDNA3.1( )缓慢注射到股四头肌内,200 μ g/只.生理盐水组于相同部位缓慢注射等鼍生理盐水.重组质粒组分别于注射后第4,7,11,16天以断颈法各处死1只小鼠,空载体组、生理盐水组小鼠均于注射后第11天同法处死.迅速取股内侧肌肉30mg,研磨成粉末状,RT-PCR法检测目的基因hPH-20 mRNA在体内的表达.结果:①提取质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果:提取的质粒成功去除内毒素后,琼脂糖凝胶电泳显示质粒纯度较高,绝大部分处于超螺旋状态,有利于体内转基因的表达.紫外分光光度计测量质粒DNA的含量(A 260/A280)为1.8～2.0.②目的基因hPH-20mRNA体内表达RT-PCR检测:重组质粒组注射后第4天即可检测到1530 bp特异性条带,第7天表达增强,第11天达到高峰,第16天表达下降.空载体组、生理盐水组各时间点均未见特异性条带.结论:脂质体介导基因转染法能够高效将peDNA3.1( )-hPH20 DNA疫苗质粒导入小鼠骨骼肌中,且hPH-20基因于注射后11 d呈峰值表达.     

长期力竭运动动情周期抑制模型大鼠卵巢组织形态和超微结构的变化

背景:研究运动性月经失调女性性腺和卵巢的功能,以及形态学的改变对于探讨运动性月经失调的发生机制具有重要意义。目的:通过建立长期力竭运动致动情周期抑制大鼠模型,观察卵巢的组织形态和细胞超微结构的变化。方法:正常3月龄SD雌性大鼠随机分成对照组和模型组,其中模型组大鼠每日进行一次力竭游泳运动直至其动情周期紊乱,取卵巢组织,苏木精-伊红染色,光镜下观察卵巢组织形态变化,电镜下观察卵巢细胞超微结构的变化。结果与结论:与对照组相比,模型组大鼠卵巢典型生长卵泡和新鲜黄体明显减少,原始卵泡、闭锁卵泡则相对增加,其颗粒细胞、黄体细胞内细胞器明显减少而含有大量的脂滴。提示长期力竭运动可抑制大鼠卵巢卵泡的发育、成熟、排卵与黄体形成,并使卵巢细胞的超微结构发生抑制性改变。     

长期力竭运动动情周期抑制模型大鼠卵巢组织形态和超微结构的变化

背景：研究运动性月经失调女性性腺和卵巢的功能,以及形态学的改变对于探讨运动性月经失调的发生机制具有重要意义。目的：通过建立长期力竭运动致动情周期抑制大鼠模型,观察卵巢的组织形态和细胞超微结构的变化。方法：正常3月龄SD雌性大鼠随机分成对照组和模型组,其中模型组大鼠每日进行一次力竭游泳运动直至其动情周期紊乱,取卵巢组织,苏木精-伊红染色,光镜下观察卵巢组织形态变化,电镜下观察卵巢细胞超微结构的变化。结果与结论：与对照组相比,模型组大鼠卵巢典型生长卵泡和新鲜黄体明显减少,原始卵泡、闭锁卵泡则相对增加,其颗粒细胞、黄体细胞内细胞器明显减少而含有大量的脂滴。提示长期力竭运动可抑制大鼠卵巢卵泡的发育、成熟、排卵与黄体形成,并使卵巢细胞的超微结构发生抑制性改变。     

腺相关病毒介导癌胚抗原转染树突状细胞对免疫功能的调节作用

目的:近年来,树突状细胞参与调节作用的研究较多。实验拟验证重组腺相关病毒(rAAV)介导癌胚抗原基因转染树突状细胞后其的免疫调节作用的变化。方法:实验于2006-06/2006-11在美国阿肯色大学医学院基因治疗中心完成。①实验方法:取健康人外周血(自愿捐献),采用改良Ficoll密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞,取贴壁细胞,分为rAAV/CEA转染组和空白对照组,均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、肿瘤坏死因子-α诱导树突状细胞前体细胞成熟,将成熟树突状细胞与末梢血淋巴细胞按比例混合培养,可得到激活的细胞毒性T淋巴细胞。②实验评估:采用流式细胞仪检测树突状细胞表面标志表达,细胞毒性T淋巴细胞的免疫表型变化,细胞毒性T淋巴细胞γ-干扰素表达。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测树突状细胞的白细胞介素12和白细胞介素10表达。结果:①rAAV/CEA转染树突状细胞的CD14较空白对照组降低,共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86表达均较空白对照组高。②成熟树突状细胞细胞因子表达中,rAAV/CEA转染组的白细胞介素12较空白对照组升高,白细胞介素10降低。③与空白对照组比较,rAAV/CEA转染组能高表达CD8 T细胞和其表型CD69,CD8/CD56的T细胞比例上调,CD25 CD4 的T细胞减少。④rAAV/CEA转染的细胞毒性T淋巴细胞表达相对较高水平的γ-干扰素,与杀伤实验结果相吻合。结论:rAAV/CEA转染树突状细胞能够激活细胞毒性T淋巴细胞的特异性杀伤作用,与树突状细胞和细胞毒性T淋巴细胞等免疫细胞表面标志变化和细胞内细胞因子水平变化相关。