抗草胺膦bar基因原核表达和纯化及其免疫反应性分析

目的 实现抗草胺膦bar基因在原核表达系统中的高效表达及纯化,并分析其免疫反应性.方法 将携带bar基因的重组质粒pET28a-bar转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,确定最佳诱导表达条件.获得的重组蛋白经镍亲和层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,测定抗体效价,以获得的抗BAR的抗血清作为一抗进行Western blot反应,检测蛋白的免疫反应性,分析该原核表达蛋白与转bar基因油菜中蛋白的等同性.结果 利用原核表达系统成功实现了BAR重组蛋白的高效表达,其最适表达条件为:0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、20℃和120 r/min摇床转速诱导过夜.以纯化后的目的蛋白作为抗原免疫小鼠,得到抗BAR的抗血清.以间接ELISA法测定抗血清效价达1∶102 400,将其作为一抗进行Western blot反应,结果显示该抗体与原核表达的重组蛋白及转bar基因油菜中的BAR蛋白均能特异性结合.结论 获得了高纯度的BAR重组蛋白,制备了特异性抗BAR多克隆抗体.原核表达的重组蛋白与转bar基因油菜中的BAR蛋白具有相同的免疫反应性,为进行转bar基因产品的食用安全性评价提供实验依据.     

人卵GST-ZP3融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性的检测

目的:在大肠杆菌中表达人卵透明带3(Human zona pellucida3,HuZP3)蛋白并对其进行纯化。方法:将HuZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和序列分析后,用重组质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导产生GST-HuZP3融合蛋白并通过Glutathione Sepharose 4B纯化。以纯化的融合蛋白免疫纯系Balb/C小鼠制备抗血清。抗血清的效价采用ELISA检测。结果:成功地构建GST-HuZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST-HuZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价抗GST-HuZP3抗血清,且该抗血清可识别大肠杆菌表达的重组ZP3。结论:获得高表达的GST-HuZP3融合蛋白并证实其具有良好的免疫原性,可作为抗原研制开发检测不孕妇女体内是否存在抗自身ZP3抗体的诊断试剂盒。     

丙型肝炎病毒核心区多肽的抗原表位分析和原核表达

目的 分析HCV核心区多肽的抗原表位,选择具有优势抗原表位的多肽用原核表达载体表达,并获得该表达载体的稳定表达菌株. 方法 根据软件分析选取带有优势抗原表位的HCV核心区多肽,找出对应DNA序列,逆转录PCR扩增目的基因,克隆到原核表达载体中进行诱导表达.表达的目的蛋白用His Bind Columns纯化,用ELISA法检测其免疫活性. 结果 获得了序列正确的HCV-core基因和表达良好的该基因原核表达载体pET-28a-core,该表达载体表达的目的蛋白可被很好地纯化并具有良好的HCV抗原活性. 结论 成功地重组了HCV核心区蛋白,获得了HCV抗原性良好的HCV核心区抗原.     

寨卡病毒NS1单克隆抗体制备及其在临床诊断中的应用

目的 用寨卡病毒非结构蛋白NS1免疫小鼠并制备鼠源单克隆抗体,建立捕获ELISA方法检测寨卡病毒NS1蛋白.方法 合成NS1基因序列构建真核表达载体pcDNA3.1-NS1,转染HEK293细胞收集上清,经Ni+柱亲和层析法纯化NS1蛋白.以纯化的NS1重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取脾脏进行细胞融合,筛选阳性细...     

结核多组分重组蛋白疫苗EPRHP014的免疫原性和保护效果的初步评价

目的初步评价自主构建的结核多组分重组蛋白疫苗EPRHP014免疫原性和保护效果, 为研制结核新疫苗、有效防控结核病提供科学基础。方法选择结核分枝杆菌全长蛋白抗原3种(EsxH、Rv2628和HspX)和经表位预测和优化的表位优势蛋白抗原2种(nPPE18和nPstS1), 共5种组分构建蛋白抗原组合物EPRHP014, 包括融合表达纯化的多组分蛋白抗原(EPRHP014f)和分别表达纯化单个蛋白构成多组分混合蛋白抗原(EPRHP014m)。EPRHP014f和EPRHP014m分别辅以铝佐剂制备多组分蛋白疫苗, 采用卡介苗(BCG)作对照。皮下注射免疫BALB/c小鼠后, 采用ELISA法检测血清特异性抗体效价, 采用ELISpot和Luminex技术检测多种细胞因子分泌情况, 采用结核分枝杆菌体外生长抑制试验观察其免疫保护作用。结果采用t检验或秩和检验进行统计分析。结果 EPRHP014m和EPRHP014f免疫小鼠后均能诱导产生高效价的IgG抗体及其亚型IgG1和IgG2a, 抗体效价与BCG免疫组小鼠差异无统计学意义(P>0.05)。EPRHP014f组诱导产生的分泌IFN...     

恙虫病东方体56-kDa型特异性抗原基因的表达及抗原性鉴定

目的表达和鉴定恙虫病东方体特异性诊断抗原,为恙虫病诊断试剂的研发提供实验基础。方法从恙虫病病例血液标本中提取恙虫病东方体核酸,PCR扩增4个不同基因型56-kDa特异性抗原基因,目的基因被定向克隆到原核表达载体pET-30a (+),在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定和镍柱纯化,用患者恢复期血清进行免疫印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的抗原性。结果从4个不同基因型别的病例血清中扩增出Karp、Kato、TA763和Gillima的部分56-kDa抗原基因,片段大小为1 350 bp～1 410 bp,分别表达并纯化出分子量大小为56. 59 kDa～58. 44 kDa的4个重组蛋白,重组的4种蛋白均与恢复期病例血清有良好的反应。结论成功表达出恙虫病东方体4个型特异性抗原蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原性。     

亚洲带绦虫包虫诊断抗原P-29基因克隆表达

目的 识别亚洲带绦虫包虫诊断抗原P-29(Hydatid disease diagnostic antigen P-29)的已知序列并行克隆和蛋白表达及免疫学研究.方法 利用在线生物信息学工具序列分析后以亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析.结果 重组体构建成功并以包涵体形式存在,破包涵体纯化蛋白并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫病人血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达.     

柯萨奇病毒A6外壳蛋白VP1基因重组表达及活性鉴定

目的表达柯萨奇病毒A6(CVA6)外壳蛋白VP1,鉴定重组蛋白免疫活性,为CVA6血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从HN421/HN/CHN/2011河南分离株基因组扩增VP1基因,经酶切连接到表达载体p ET30a中,转化大肠杆菌(BL21DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因表达,并对重组蛋白进行纯化,SDSPAGE和Western blot方法对重组蛋白分析鉴定其免疫活性。结果 PCR方法扩增的VP1基因长度为980 bp;经PCR扩增和测序鉴定插入到表达载体的基因片段与预期目的片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量为34 k Da;经大肠杆菌高效表达和纯化获得了重组蛋白CVA6-VP1,通过Western blot分析,该重组蛋白与手足口病患者血清反应产生特异杂交带。结论本研究成功克隆并构建了CVA6 VP1基因高效原核表达系统,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为EV71诊断试剂的研究奠定了基础。     

新型隐球菌Cap10蛋白的重组表达及多克隆抗体制备

目的:重组表达新型隐球菌Cap10蛋白并制备特异抗体,为新型隐球菌的检测和诊断提供特异抗原和抗体。方法:选择CAP10基因开放阅读框架(ORF)抗原表位集中、保守性高的片段,经过大肠杆菌偏嗜的密码子优化后进行基因合成,将目的片段克隆至原核表达载体pQE30中构建重组蛋白表达载体pQE30-CAP10并鉴定,IPTG诱导重组蛋白在M15中表达,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定;镍柱纯化后,免疫家兔制备抗血清。结果:在大肠杆菌中成功表达Cap10,其纯度大于95%;二免后家兔血清抗体效价达到200万以上。结论:获得了高纯度的Cap10蛋白及高效价的多克隆抗体,为新型隐球菌的检测和致病机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。