血小板低温保存的初步研究

血小板输注应用的进展,要求体外长期保存血小板,低温保存是目前公认细胞长期保存的最好方法。本研究用体外回收率、血小板聚集试验、血小板低渗休克试验与透射电镜观察等手段,研究了不同降温方法与冻存条件下血小板的活力。结果发现:(1)用自动控温装置降温效果最好。(2)选用5％DMSO低温保护剂与1℃/min降温率为最好冻存条件,此时70％以上血小板活力得以保存。(3)血小板低温损伤主要发生在降温时融合热释放期(-6℃以上)。(4)-20℃冻存是不可取的。(5)血小板聚集功能在冻存后严重下降,有必要进一步研究解决方法。     

使用GMA及PAS-Ⅲ2种添加液冷藏保存血小板的体外研究

目的比较2种不同添加液对4℃冷藏血小板的体外形态、活力和活化程度等指标的差异,分析特定的添加液对4℃冷藏血小板的保护作用。方法取8份单采血小板,将其一分为二,各保留35%血浆,分别添加葡萄糖甘露醇腺嘌呤血细胞保存添加液(GMA)和血小板保存添加液Ⅲ(PAS-Ⅲ)2种不同保存添加液,置4℃条件下保存,于5d后取样测定有关指标。结果在保存5d期间,GMA-PCs的低渗休克反应明显高于PAS-Ⅲ-PCs;而P-选择素的表达则显著低于后者;另外,前者IL-6的产生亦显著低于后者;2组PCs的血小板形变能力、GPⅠbα表达、乳酸生成无显著性差异。结论在4℃冷藏条件下采用血小板保存添加液替代血浆保存单采血小板,对保持血小板体外质量,GMA优于PAS-Ⅲ。     

4℃冷藏保存血小板对体外血小板减少模型的纠正效果

目的对比分析4℃冷藏保存血小板与22℃振荡保存血小板对体外血小板减少模型的纠正效果,为冷藏保存血小板临床应用提供实验室依据。方法采用血栓弹力图及血小板计数等指标,评价分析不同保存时间的4℃冷藏保存血小板和22℃振荡保存血小板对体外血小板减少模型的纠正效果。结果 4℃冷藏保存血小板和22℃振荡保存血小板在保存到d 1、3、5时,对相同血样制备的血小板减少模型进行纠正,血小板计数从(10-30)×10~9/L纠正到100×10~9/L以上,4℃冷藏保存血小板到7-14 d时,同样达到纠正目的。4℃冷藏保存10-14 d的血小板与22℃振荡保存d 5的血小板对血小板减少模型进行纠正,纠正后的TEG-MA值均在正常值范围内,达到纠正效果。结论4℃冷藏保存10-14 d的血小板与22℃振荡保存5 d的血小板对体外血小板减少模型进行纠正,从血小板计数到TEG-MA值均达到了纠正效果,佐证4℃冷藏保存10-14 d的血小板具有良好的止血效果。     

二甲基亚砜(DMSO)对血小板体外聚集功能的影响

目前,DMSO冰冻保存血小板作为22±2℃液体保存血小板的补充产品,在外科手术应用中已取得良好的临床疗效[1].然而冰冻血小板仍缺乏统一的质量标准[2],而且现有体外功能测定并不一定能完全反映其在体内发挥功能的实际情况[3].必须寻求能如实反映血小板体内功能的指标及简便易行的质量控制方法才能控制生产工艺,提供质量可靠的冰冻血小板制品.为此,笔者通过检测花生四烯酸诱导的DMSO终浓度不同的液体血小板体外聚集功能,进一步分析讨论了聚集功能作为DMSO冰冻保存血小板质量控制的指标是否合适?现将结果报告如下.     

第二信使调节剂和2%二甲亚砜对血小板冻存后计数的影响

目的探讨第二信使调节剂混合物（thrombosol：阿米洛利、硝普钠、腺苷）各组成成分及其浓度变化对血小板冻存后计数的影响。方法第一阶段将新鲜浓缩血小板分为6组，分别应用2％DMSO、6％DMSO、2％DMSO＋thrombosol和2％DMS0＋thrombosol中1种组分为低温保护剂；第二阶段将新鲜浓缩血小板分为10组，分别应用2％DMS0、6％DMSO、2％DMSO＋thrombosol和2％DMSO＋不同浓度组合阿米洛利和硝普钠为低温保护剂。各组分于-80℃保存1周和1月后，复温血小板并计数。结果第一阶段：2％DMSO＋腺苷组血小板冻存后计数与2％DMSO组的差异无显著性（P〉0．05），但显著低于其他4组（P〈0．05或P〈0．01）；第二阶段：2％DMSO＋1／2thrombosol中浓度（阿米洛利＋硝普钠）组血小板冻存后计数显著高于2％DMSO组（P〈0．01），与6％DMSO组和2％DMSO＋thrombosol组相当（P〉0．05）。结论就保护血小板冻存后计数降低而言，2％DMSO＋1／2thrombosol中浓度（阿米洛利＋硝普钠）作为低温保护剂的效果与6％DMSO或2％DMSO＋thrombosol的相当，优于其他各组。     

改良血小板添加液低温(10℃)保存血小板的动物实验研究

目的对添加海藻糖的血小板添加液替代70%血浆冷藏的血小板进行动物体内输注效果评价。方法采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板,将浓缩血小板分3组保存。血浆常温组:添加100%血浆,22℃保存;添加液低温组:添加70%PAS-ⅢM/30%血浆,10℃保存;冰冻保存组:添加100%血浆,-85℃保存。以新鲜血小板为对照,常温血浆保存组在d 3,添加液低温保存组在d 3、7、9,冰冻保存组在d 20复苏后分别检测血小板缺乏兔模型的血小板24 h回收率和生存率。结果除保存9 d的添加液低温组血小板存活率明显低于新鲜血小板存活率(P<0.05)外,血浆常温组、添加液低温组以及新鲜血小板的24 h回收率和存活率相互比较差异均无显著统计学意义(P>0.05)。冰冻保存组血小板24 h回收率和存活率均低于其他各组(P<0.05)。结论改良的PAS-ⅢM能够替代血浆在低温条件下用于血小板的保存,能维持血小板的体内功能。     

血小板保存新策略

血小板在常温(22℃±2℃)连续振荡下保存,对细菌生长极有利,从而易使血小板遭受细菌污染,并且因为保存期短,不能适应血小板临床需求量的迅速增加[1].解决这一问题的最好办法就是降低血小板的储存温度,进行血小板冷藏保存 [2].血小板冰冻保存可使血小板的保存期延长,但冻存后的血小板存活率明显降低且冰冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)对受者具有毒副作用,在洗涤去除DMSO的过程中,血小板易激活、损伤[3].     

4℃冷藏保存血小板功能变化

目的对比分析4℃冷藏保存血小板与22℃振荡保存血小板的功能变化,为制定冷藏保存血小板技术提供实验室依据。方法对4℃冷藏保存血小板(实验组)于保存到d1、d3、d5、d7、d10、d14、d21,7个时间点和22℃振荡保存血小板(对照组)在保存到d1、d3、d5、d7,4个时间点进行采集血样,采用血栓弹力图、血小板聚集仪、流式细胞仪对不同保存条件下血小板进行检测。结果 4℃冷藏保存血小板血栓弹力图指标在7d内组间比较无统计学差异(P0.05),MA值储存d3起逐渐降低,但储存到21 d时,仍在正常值范围内。22℃振荡保存血小板的血栓弹力图5项指标在保存5d内出现低凝趋势(P0.05)。4℃冷藏保存血小板保存d1后血小板最大聚集率均50%,高于22℃振荡保存(P0.05),血小板保存到d5,COLL和ACA诱导的最大聚集率在4℃冷藏保存时仍保持在80%以上,而22℃保存在d5时点,4种诱导剂的聚集率均低于5%。4℃冷藏保存10-14 d时,4种聚集率虽有降低,但仍明显高于22℃保存d5时的聚集率(P0.05)。血小板表面活化的PAC-1(活化的IIb/IIIa)和CD62P(P-selectin)在4℃冷藏保存到d10-14时仍有大量血小板处于中晚期活化状态,22℃保存到d5时呈现高度晚期活化状态。结论 4℃冷藏保存血小板较22℃振荡保存血小板具有较好的聚集、止血功能和较高的活性,可在体外保存10-14 d。     

当归多糖对抗LY294002引发的血小板凋亡的研究

目的:研究当归多糖(angelica polysaccharide,APS)对体外冷藏保存血小板的抗凋亡作用及其机制。方法:将血小板样本分为4组:4℃冷藏的血小板空白对照组、4℃冷藏保存血小板APS处理组、LY294002处理组和LY294002加APS共同处理组。采用流式细胞仪检测血小板膜糖蛋白CD41、CD61的表达及血小板凋亡率、凋亡蛋白酶Caspase-3的表达以及线粒体膜电位的变化。Western blot检测分析APS通过PI3K/AKT信号通路抗血小板凋亡的作用机制。结果:LY294002组血小板凋亡率明显提高,血小板膜糖蛋白CD41、CD61的表达活性随着LY294002作用浓度的升高逐渐下降(r=-0. 953);与空白对照组相比,LY294002组的血小板凋亡率明显升高(P0. 05),而LY294002和APS共同处理组的血小板凋亡率较前者下降(P 0. 05),这提示,APS对体外冷藏血小板具有抗凋亡作用。APS还能降低血小板凋亡蛋白酶Caspase-3的表达和抑制线粒体膜电位的降低,以及刺激血小板PI3K/AKT通路的活化。结论:APS对体外冷藏保存的血小板具有抗凋亡作用,其机制可能与活化PI3K/AKT信号通路,减少细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表达和稳定线粒体膜电位有关。     

以尿苷二磷酸半乳糖为添加剂冷藏兔血小板的研究

本研究探讨以尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)为添加剂的血小板冷藏保存方法。采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板悬液(PC),在悬液中添加UDP-Gal,放4℃冰箱储存10天。尔后观察血小板(Plt)数量?血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)?血小板聚集功能(PagT)?血小板促凝活性实验(PF3aT和APCT)和血小板凋亡(apoptosis)的变化。将冷藏兔血小板用Cr51标记后,检测输入兔体内后的血小板生存时间。结果表明加入UDP-Gal冷藏保存10天后的PC的Plt、MPV、PDW、血小板促凝血活性与新鲜PC相比均无显著性变化(P(0.05);而冷藏对照PC的Plt明显减少,MPV、PDW显著增大,血小板促凝血活性减低,与新鲜PC相比差异有显著性(P>0.01);加入UDP-Gal的PC冷藏保存10天后的血小板凋亡率与新鲜PC相比有所增高(P(0.05),但明显低于冷藏对照组(P(0.01),其血小板聚集率(诱聚剂为阳离子没食子酸丙酯,C-PG)减低,但仍能保持在新鲜血小板的50%以上。添加UDP-Gal时冷藏保存10天的血小板与新鲜的血小板在体内的生存时间相近(P(0.05),输注兔体内72小时时的血小板存活率在新鲜对照组、UDP-Gal冷藏保存组和冷藏对照组分别为57.5%±7.2%、50.3%±6.3%和0.1%±0.5%。结论尿苷二磷酸半乳糖对冷藏保存的兔血小板有保护作用,并能延长冷藏兔血小板在体内的生存时间。     

高血小板浓度在采集和冷冻干浓缩血小板中的影响

采用5％或6％二甲基亚砜(DMSO)冷冻保存血小板是浓缩血小板(PC)长期保存的最佳方法,这个浓度的DMSO对血小板没有毒性。虽然冷冻和融化过程由于血小板膜完整性丧失,引起血小板激活和细胞溶解,但冷冻保存血小板能被安全地输注,其止血功能优于22C保存5天的PC,且回收率相似。     

高血小板浓度在采集和冷冻干浓缩血小板中的影响

采用5％或6％二甲基亚砜(DMSO)冷冻保存血小板是浓缩血小板(PC)长期保存的最佳方法，这个浓度的DMSO对血小板没有毒性。虽然冷冻和融化过程由于血小板膜完整性丧失，引起血小板激活和细胞溶解，但冷冻保存血小板能被安全地输注，其止血功能优于22C保存5天的PC，且回收率相似。     

4℃冷藏保存血小板的代谢变化

目的对比分析4℃冷藏保存血小板与22℃振荡保存血小板代谢情况,为制定冷藏保存血小板技术提供实验室依据。方法对4℃冷藏保存血小板于保存到d1、d3、d5、d7、d10、d14、d21,7个时间点和22℃振荡保存血小板保存到d1、d3、d5,3个时间点时采集血样,检测不同保存条件下的血小板血气指标、生物化学指标和低渗休克反应率。结果 4℃冷藏保存血小板在保存7 d内pH、Na~+、Ca~(2+)、Cl~-值无明显变化(P0.05),22℃振荡保存血小板pH、Na~+、Ca~(2+)、Cl~-、PCO_2、PO_2、Lac、HCO_3~-、ctCO_2、Gap(K~+)保存5 d内均有明显变化(P0.05)。血小板保存d5时,22℃保存血小板的pH值明显低于4℃保存血小板,而LDH和Lac值明显高于4℃保存(P0.05)。LDH、pH、K~+、PCO_2、PO_2、Lac、HCO_3~-、ctCO_2、Gap(K~+)2组间比较均有差异(P0.05)。4℃冷藏保存5 d内血小板低渗休克恢复率变化不明显(P0.05),而22℃保存血小板HSR恢复率d5与d1相比降低53.77%。结论 4℃冷藏保存血小板与22℃振荡保存血小板在代谢方面比较,冷藏保存血小板具有代谢慢、乳酸产生少、pH降低慢及葡萄糖消耗低等特点,4℃冷藏保存血小板10-14 d时仍有一定的HSR恢复率。就血小板代谢数据比较,4℃冷藏保存血小板建议保存10-14 d。     

白细胞过滤对冰冻保存浓缩血小板制剂细胞因子和血小板功能的影响

目的探讨白细胞过滤对浓缩血小板悬液(platelet concentrate suspend,PCs)在冰冻保存前后的一些细胞因子及血小板体外功能的影响。方法取25份浓缩血小板样品(40ml/份),将每份样品再等分为4份,其中2份白细胞过滤(过滤组),另2份不过滤(未过滤组);将过滤组和未过滤组的分别常规保存和冰冻保存。常规保存0、1、3d和冰冻保存3个月解冻后0、1、3d的所有样品均采用ELISA法测定IL-2、IL-6、INFγ-、TNF-α、IL-10的含量;对冰冻保存复溶后当天的样品和新鲜样品分别作血小板聚集功能、粘附功能及血小板第Ⅲ因子活性检测;采用配对t检验作统计分析。结果未过滤组PCs冰冻保存后复溶0d与常规保存0d的PCs细胞因子的水平无明显升高,两种条件保存后1、3d细胞因子的水平均显著升高;过滤组PCs在冰冻保存和常规保存时细胞因子均无显著变化。过滤组和未过滤组PCs经冰冻保存后的血小板体外功能活性均无明显变化。结论PCs中的细胞因子在常规保存及冰冻保存复溶后随时间延长呈显著性增加趋势,白细胞过滤可明显减轻这种效应。白细胞过滤对冰冻保存的血小板体外功能活性无明显影响。     

4℃冷藏保存血小板对体外大失血模型的纠正效果

目的探讨4℃冷藏保存血小板对体外大失血模型的纠正效果。方法手工汇集(10人份)血小板200mL等分为2×100 mL,分别于4℃冷藏保存和22℃振荡保存,共计制备5×200 mL,等分后放置4℃冷藏冰箱和22℃血小板振荡保存箱。采用血液稀释法(全血∶盐水=1∶9)制备体外大失血模型,应用TEG检测指标及血常规等指标对比、评价悬浮红细胞、新鲜冰冻血浆与4℃冷藏保存血小板(简称4℃血小板)或22℃振荡保存血小板(简称22℃血小板)按1∶1∶1比例对体外大失血模型的纠正效果。结果保存1、3、5 d时,4℃血小板组和22℃血小板组在对相同血样制备的体外失血模型纠正,Plt(×109/L)从20-27分别升至127-161 vs 128-160(P0.05),TEG-MA值(mm)由12.7-14.4分别升至45-51 vs 47-50,TEG-R值(min)由27.7-9.9分别升至4.4-4.3 vs 4.5-4.7(P0.05)。保存7-14 d,4℃血小板组:Plt(×109/L)由18-27纠正到162-161,TEG-MA值(mm)由8.8-14.5纠正为46-43,TEG-R值(min)由24-13纠正为5.5-5.2(P0.05)。结论按悬浮红细胞、新鲜冰冻血浆和4℃冷藏保存血小板作用于体外大失血模型达到了纠正效果,佐证了4℃冷藏保存10-14 d的血小板具有良好的止血效果。     

血小板4℃冷藏保存方法的实验研究

目的探讨以尿嘧啶二磷酸半乳糖为添加剂的血小板冷藏保存方法。方法采集兔心脏血,按常规方法制备浓缩血小板悬液(PCs),在悬液中添加5g/L的尿嘧啶二磷酸半乳糖(UDP-Gal),于37℃孵育2h后,放4℃冰箱储存10d。而后观察血小板(PLT)数量、血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板聚集功能(PagF)、血小板促凝活性(APCT)和血小板膜AnnexinV结合率的变化;将添加UDP-Gal冷藏保存的兔血小板输入兔血小板减少症模型体内,检测输注后1h和24h兔耳出血时间和血小板回收率(PPR)。结果添加UDP-Gal冷藏保存10d的PCs中PLT数量、MPV、PDW、APCT与新鲜PCs相比,差异均无显著性(P>0.05);其血小板凋亡率与新鲜PCs相比有所增高,但显著低于冷藏对照组(P<0.01),血小板聚集率(诱聚剂为阳离子没食子酸丙酯,C-PG)减低,但仍能保持在新鲜血小板的50%以上;而冷藏对照PCs的PLT数量显著减少,MPV、PDW显著增大,且血小板促凝血活性减低,血小板PagF丧失。UDP-Gal冷藏保存的兔血小板可明显缩短兔耳出血时间(P<0.01),而冷藏对照PCs输注前后兔耳出血时间的变化无显著性(P>0.05);新鲜血小板组、UDP-Gal+冷藏血小板组、冷藏血小板对照组输入兔血小板减少症模型体内1h和24h的PPR分别是66.1%±0.5%、47.8%±0.6%,60.9%±0.3%、41.6%±0.4%、47.7%±0.5%、9.4%±0.5%,UDP-Gal+冷藏兔血小板组与新鲜兔血小板相比,其PPR的差异无显著性(P>0.05),UDP-Gal+冷藏兔血小板组和新鲜兔血小板组的PPR均显著高于冷藏血小板组(P<0.01)。结论添加尿嘧啶二磷酸半乳糖的兔血小板冷藏保存后的体内外功能良好。     

血小板冷冻保存的研究

用终浓度4％二甲基亚砜(DMSO)作为防冻剂,于—30℃和—80℃冷冻保存血小板以开展低温保存血小板的输注。体内外研究结果表明:DMSO对血小板粘附和单一诱聚剂所致的聚集有可逆性抑制作用;洗涤去除DMSO后,粘附、聚集可以恢复。联合诱聚剂所致的聚集不受DMSO影响。冻存后的血小板粘附、聚集和低渗休克反应较冻前有所降低,与保存时间(1和3个月)无关。—80℃保存的血小板质量优于—30℃保存者。输注—80℃保存的血小板可提高患者的血小板数,因而能有效地预防和控制因血小板减少导致的出血。     

细胞低温损伤机理与血小板冰冻保存

近年来 ,冰冻保存的血小板用于临床已取得实效。但在冰冻血小板复融时常发生纤维蛋白析出等不利情况 ,多为血小板损伤造成 ,影响冰冻血小板质量。掌握细胞低温损伤原理 ,对冰冻血小板制备、保存中需要注意的事项具有很好的指导意义。现综述如下。1　细胞低温保存的基本原理　　低温下 ,活细胞内的生物新陈代谢急剧减弱 ,使细胞或组织可长期保存。可供科研和医疗使用 ,如 :输血、骨髓移植、人工受精等。2　进行低温保存的主要步骤2 .1　细胞或组织中加入防冻剂 ,如二甲亚砜 (DMSO)。2 .2　一同降温至某一温度值下 ,如 :- 80℃ (超低温冰柜 …     

不同温度保存的血小板的代谢情况及功能变化

目的:对比分析4℃冷藏保存和22℃振荡保存的血小板的代谢情况及功能差异,为制定冷藏保存血小板技术提供实验依据。方法:分别对4℃冷藏保存的血小板和22℃振荡保存的血小板于保存时间点d 2、4、6、11、15和21取样,检测不同保存条件下的血小板各代谢指标以及血栓弹力图(TEG)。结果:4℃保存6 d时,血小板的p H、PO2、PCO2、MPV、GLU值均无明显变化(P 0. 05),Plt数降低,PDW和LDH升高(P 0. 05);而22℃保存6 d时,仅血小板的MPV值无明显变化(P 0. 05); p H、PCO2、GLU、Plt降低,PO2、LDH、PDW升高(P 0. 05)。同一保存期内,PO2、p H、Plt、MPV、LDH、GLU在2组间比较均有差异,4℃保存的血小板p H值、MPV明显低于22℃保存的血小板,而GLU、PO2、LDH和Plt明显高于22℃保存的血小板(P 0. 05)。从d 15开始,4℃保存的血小板的PCO2检测不出,Plt计数也突然迅速降低。在功能方面,随着保存期延长,4℃保存的血小板MA值降低不明显,而22℃保存的血小板MA值降低明显,且同一保存期内4℃保存的血小板的MA值高于22℃保存的血小板。结论:4℃保存的血小板比22℃振荡保存的血小板代谢慢,且同一保存期内,4℃保存的血小板的聚集功能强于22℃保存的血小板。     

血小板保存的应用性研究进展

<正>血小板在临床常用于治疗血小板减少症患者的活动性出血、血小板功能障碍或预防恶性肿瘤相关的血小板减少症的出血。当前我国采供血机构血小板的常规保存条件为(22±2)℃,震荡保存,保存期限为5d。22℃震荡保存期限短且发生细菌污染概率远超低温保存,易导致输血不良反应的发生,影响输血安全。目前,主要从血小板添加剂溶液替代血浆保存血小板、4℃冷藏保存血小板、-80℃深低温冰冻保存血小板等方面进行研究,缓解储存过程造成的损伤,减少细菌污染,延长血小板保质期,笔者拟就以上几个方面对血小板保存的研究及应用进展综述如下。