中成药中沙门氏菌环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

目的 建立以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法 选择沙门氏菌的毒力因子invA基因作为检测模板,采用Primer Exploer V5软件设计3组LAMP引物[正向外引物（F3）、反向外引物（B3）,正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）,正向环引物（LF）、反向环引物（LB）],以4种沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌）和3种非沙门氏菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产志贺氏毒素大肠埃希氏菌）的细菌DNA为模板,进行LAMP快速检测。结果 在反应温度为65℃、反应时间为60 min条件下,即可快速检测4个亚种沙门氏菌,其检测灵敏度可达10 cfu/mL,且试验结果易于观察,筛选的引物特异性良好。结论 所建立的方法灵敏度高、特异性好、检测快速,可应用于中成药中沙门氏菌的快速检测。     

环介导等温扩增检测孕妇血清中巨细胞病毒方法的建立

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测孕妇血清中人类巨细胞病毒(HCMV)DNA的方法.方法 在确定血清标本DNA阳性的基础上,建立、优化LAMP检测方法,并对特异性和敏感性进行评估,同时将检测结果与荧光定量PCR(FQ-PCR)相比较.结果 LAMP扩增产物电泳后出现了特有的梯状条带,酶切结果与预期相符,检测下限为10个拷贝,与FQ-PCR相比,符合率达96.4%.结论 该方法灵敏度高、特异性强、操作简便迅速,适合用于HCMV筛查.     

结核分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测方法的建立及应用

目的 建立结核分枝杆菌实时荧光核酸恒温扩增检测方法(SAT-TB),并探讨其在结核病诊断中的应用.方法 设计特异性引物和探针,构建SAT检测体系,并优化.通过不同浓度H37Rv标准菌株检测评估其灵敏性.结果 结核分枝杆菌SAT检测灵敏度为10 CFU/ml;非结核分枝杆菌及常规细菌未检出TB RNA.肺结核患者痰液标本中结核分枝杆菌SAT检出率为54％,显著高于痰培养法的40％ (p＜0.05)及痰涂片法的34％ (P＜0.01).结论 SAT方法应用于结核分枝杆菌检测,快速方便、灵敏度高、特异性强,可以应用于临床结核病诊断.     

B群链球菌及其大环内酯类耐药基因LAMP快速可视化检测方法的建立和初步应用

目的 建立一种快速可视化检测B群链球菌(GBS)及其大环内酯类耐药基因的环介导恒温扩增(LAMP)方法,为临床GBS检测提供新方法。方法 针对GBS特异性基因cfb和大环内酯类耐药基因ermB、mefA/E和linB设计LAMP反应的引物;建立并优化LAMP的反应体系和反应条件,反应结果通过DNA扩增曲线和肉眼观察反应液颜色变化判断;以携带上述基因的质粒DNA为检测标准,确定LAMP方法检测目标基因的敏感性与特异性,并与PCR方法的检测结果比较;采用LAMP方法检测临床300份孕产妇阴道直肠拭子标本中GBS,与分离培养法的检出率进行统计学分析;采用LAMP方法检测80株GBS临床分离株中大环内酯类耐药基因,并与药敏试验结果进行统计学分析。结果 建立了快速可视化检测GBS及其大环内酯类耐药基因的LAMP反应体系和方法,该法在63℃、45 min内完成;该法能够特异性检测pMD-cfb、pMD-ermB、pMD-mefA/E、pMD-linB质粒DNA,其灵敏度为10-5 ng/μL,是PCR方法灵敏度的100倍;对300份孕产妇阴道直肠拭子标本进行检测,LAMP方法对GBS检出率为12....     

重组酶介导扩增技术与传统聚合酶链反应技术在甲状腺癌DNA甲基化检测中的应用比较

目的 建立重组酶介导的核酸扩增(RAA)技术特异性检测DNA甲基化的新方法并与传统的DNA甲基化特异性PCR(MSP)方法进行比较.方法 选取OXTR基因作为目的基因,提取样品外周血基因组DNA,经亚硫酸氢盐修饰后分别以MSP和RAA技术进行特异性检测DNA甲基化实验.结果 2种技术皆能扩增出OXTR非甲基化条带,而RAA技术成功扩增OXTR甲基化条带.结论 RAA是一种新型的等温体外核酸扩增技术,实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增,可成为替代MSP乃至其他PCR实验的新方法.     

基于酶促恒温扩增技术快速鉴别天麻真伪检测方法的建立与应用

目的:基于酶促恒温扩增(enzymatic recombinase amplification, ERA)技术建立一种可快速定性鉴别道地药材天麻真伪的方法。方法:遵循ERA引物设计原则,应用Oligo 7.0软件根据天麻及其常见伪品的ITS2基因组序列,筛选优化天麻ERA特异性引物,应用Primer Premier 5.0软件设计天麻特异性PCR鉴别引物,通过对ERA、PCR反应体系的优化,最终确定ERA最佳反应时间为17 min,最适反应温度为40℃;PCR最优退火温度为57℃,循环为32次,对所建立的方法进行灵敏度、特异性验证,并选取中药市场市售天麻样品进行检测。结果:所设计的天麻ERA鉴别引物与其常见伪品间无交叉反应,特异性良好;重复性结果显示,3次重复性检测结果一致,未出现假阳性与假阴性;该方法对天麻基因组DNA的灵敏度为1 pg·μL^-1,比传统PCR灵敏性高;ERA技术能够用于天麻市售样品的快速鉴定,且检测结果与PCR方法相同。结论:所建立的检测方法操作简单、快速,具有较高的特异性和灵敏度,为道地药材天麻的真伪鉴别提供了一种新手段。     

应用环介导等温扩增法进行卡马西平安全用药监测

目的建立环介导等温扩增法（100p-mediated isothermal amplification,LAMP）检测卡马西平引起严重皮肤损害的标志基因HLA-B＊1502的技术平台。方法对所收集的病例,分别应用LAMP和金标准SSP-PCR进行标志基因HLA-B＊1502的检测,验证LAMP方法的准确性。结果LAMP和SSP-PCR检测38例对照组和2例药疹组患者基因型结果完全一致。结论LAMP操作简单快捷,且准确可靠,可以在临床上广泛推广,提高卡马西平安全用药水平。     

炭疽杆菌双重可视化LAMP检测方法的建立

目的：建立同时检测炭疽杆菌 capA 基因、PA 基因的双重环介导等温扩增（ Loop?mediated isothermal amplification,LAMP）方法,用于防范生物恐怖威胁。方法设计和合成分别针对炭疽杆菌capA基因、PA基因的引物对,通过优化参数,建立可同时检测capA基因、PA基因的双重LAMP方法,测试敏感性和特异性,并应用于模拟样本和实战检测。结果双重LAMP的检测capA基因、PA基因的敏感性均可达到50模板拷贝每反应,并具有良好的特异性,在重大保障活动中得到检验。结论双重LAMP方法具有可以同时筛查、简单快速、灵敏度高等优点,在炭疽杆菌检测方面有良好应用前景。     

The rapid and sensitive detection of edible bird's nest (Aerodramus fuciphagus) in processed food by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

Edible bird's nest (EBN) is a well-known and precious traditional Chinese herbal material (CHM). Because of this, preventing the adulteration of EBN efficiently and precisely is crucial to protect consumers' interests and health. In this study, a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed for the detection of EBN using specifically designed LAMP primers. The results demonstrated that the identification of EBN by LAMP assay was specific and rapid (within 1 h). It had no cross-reaction with EBN adulterants, including white fungus, egg white and pig skin, in different ratios. The relative detection limit was 0.01% EBN in the adulterants. Moreover, the sensitivity of LAMP in authenticating EBN was 10^?8 μg, it showed higher sensitivity than that of conventional PCR with 10⁵ fold. When genomic DNAs extracted from boiled or steamed EBN samples were used as templates, LAMP for EBN detection was not affected and was reproducible after heat processing. In conclusion, the LAMP assay established herein could be applicable for authenticating EBN and for identifying commercial EBN products in herbal markets.     

改良ELISA一步法检测小儿粪便轮状病毒

目的 探讨改良ELISA一步法检测小儿腹泻粪便的轮状病毒,为临床提供可靠的诊断依据。方法 应用快速轮状病毒抗原酶标诊断试剂盒(RotaFast)进行改良的ELISA一步法检测小儿腹泻粪便轮状病毒抗原695例。结果 经检测小儿腹泻粪便695例,阳性率达75．97％(528/695)。结论 改良ELISA一步法检测小儿粪便轮状病毒,具有快速、敏感,方法简单,结果准确等优点。     

Rapid detection of Panax ginseng by loop-mediated isothermal amplification and its application to authentication of Ginseng

We have developed a novel method called loop-mediated isothermal amplification (LAMP) to detect Panax ginseng, the botanical source of Ginseng (Ginseng Radix), and to distinguish P. ginseng from Panax japonicus. Six allele-specific primers (two outer primers, two inner primers, and two loop primers) were designed based on the 18S ribosomal RNA gene sequence of P. ginseng, and LAMP was performed using those primers and total DNA extracted from P. ginseng as template. Amplifications were observed from approximately 30 min onwards at DNA concentrations of 0.5 to 10.0 ng. The presence of loop primers shortened the reaction time considerably. In contrast, in the reactions using total DNA from P. japonicus as template, no amplifications were observed. LAMP also enabled us to distinguish Ginseng from Japanese Ginseng (Panacis Japonici Rhizoma). LAMP was proven to be a rapid, highly sensitive, and specific method for the detection of P. ginseng and Ginseng.     

细胞色素P450 2D6等位基因CYP2D6C的特异扩增法测定

细胞色素Ｐ４５０２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）第２７０３－５位ＡＡＧ缺失造成表达产物第２８１位赖氨酸缺失的等位基因称为ＣＹＰ２Ｄ６Ｃ．利用等位基因特异扩增法（ＡＳＡ）原理,建立了ＡＳＡ－ＰＣＲ测定ＣＹＰ２Ｄ６的方法．经３９６例测定,说明本法快捷,污染少．测定结果显示ＣＹＰ２Ｄ６Ｃ不属于ＣＹＰ２Ｄ６酶缺陷等位基因,表型仍为快代谢．     

口服轮状病毒活疫苗罗特威研究进展

轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的最主要病原体,是全球范围内导致婴幼儿发病和死亡的主要病因之一。我国5岁以下婴幼儿轮状病毒腹泻发病人数每年超过1 000万,每年导致大约3～4万名婴幼儿死亡。接种安全有效的疫苗是预防轮状病毒腹泻的主要手段。口服轮状病毒活疫苗罗特威于2001年获准上市,累计接种已超过3 000万剂,安全有效,可有效降低轮状病毒腹泻的发病率。     

轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性培养及免疫原性分析

目的:研究轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上的适应性及其免疫原性。方法:将轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在Vero细胞上连续传代20代,进行适应培养,通过RNA-PAGE、PCR、核酸电泳、病毒滴度及小鼠免疫试验鉴定其遗传稳定性和免疫原性。结果:筛选出1株Vero细胞适应株(Ls)。该毒株在Vero细胞上稳定传代20代,具有遗传稳定性,且自第5代后病毒滴度均稳定在7.0 lgTCID50.mL-1以上。动物免疫结果表明,Vero细胞适应株Ls诱导小鼠产生高滴度的血清抗体。结论:Ls株可在Vero细胞上稳定增殖,具有遗传稳定性和良好的免疫原性。     

环介导等温扩增技术检测慢性阻塞性肺疾病伴下呼吸道感染病原菌397例价值研究

目的 探讨环介导等温扩增技术（LAMP）,即呼吸道病原菌核酸联合检测（13联）对慢性阻塞性肺疾病（COPD）伴下呼吸道感染病原菌检测的临床应用价值。方法 选取梅州市人民医院2018年1月至2020年12月住院病人临床诊断为COPD伴急性下呼吸道感染的病例397例,其中有入住普通病房的病例195例,需要呼吸机辅助通气而入住重症监护室的病例202例,每例病人均留取痰液/支气管肺泡灌洗液/支气管吸出物送检LAMP(13联)检测和病原菌培养,比较入住不同病房治疗的COPD伴下呼吸道感染病原菌经LAMP(13联)检测出的病原菌分布特点,计算LAMP(13联)检测的灵敏度和特异度,以及统计分析LAMP(13联)检测与传统培养方法检测结果的一致性,探讨LAMP(13联)方法对COPD伴下呼吸道感染的临床应用价值。结果 LAMP检测方法对普通病房、重症监护室的COPD伴下呼吸道感染病原菌的检测阳性率分别为45.13%、47.03%,均比传统培养方法高（P<0.05）;根据LAMP检测结果,入住普通病房的COPD病人感染病原菌排在前三名为流感嗜血杆菌34例（17.44%）、耐甲氧西林葡萄球菌25例...     

影响轮状病毒半数细胞感染剂量法滴定的因素分析

目的:确定影响轮状病毒感染增殖过程的因素,以提高滴度检测结果的重复性和可靠性。方法:采用半数细胞感染剂量法(CCID50)结合ELISA(CCID50-ELISA)判断病毒在细胞上有无复制来检测病毒滴度。结果:不同细胞代次、接种浓度、培养时间、培养液种类和接种细胞孔数均会对病毒滴定结果造成显著影响。结论:轮状病毒滴度检测的线性和准确性与细胞状态与培养环境相关。CCID50-ELISA法检测轮状病毒滴度有良好的重复性和耐用性。