宁波地区结核分枝杆菌基因突变位点确证及与异烟肼、利福平耐药关系研究

【摘要】： 目的 阐明宁波地区初治肺结核患者结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因突变特征,深入分析基因突变与异烟肼（INH）、利福平(RFP)耐药关系,为临床抗结核治疗提供科学依据。方法 采用1%比例法对889例结核分枝杆菌临床分离株进行药敏检测,对其中的耐药菌株提取DNA,PCR扩增,对耐药菌株katG、inhA、rpoB基因测序,分析三种基因特征及基因突变与单耐药、耐多药关联性。结果 889例结核分枝杆菌临床分离株中,发现39例耐药结核分枝杆菌,其中单耐药24例,单耐药率2.70%,15例耐多药,耐多药率1.69%。39例耐药菌株中,有14例耐多药菌株发生rpoB、katG基因错义突变,突变率93.33%,3例发生inhA基因错义突变,突变率20.00%,rpoB基因450位点（ser450leu）突变率53.33%,katG基因315位点（ser315thr）突变率86.67%,463位点（arg463leu）突变率93.33%。3例单耐利福平菌株rpoB基因在463位点（arg463leu）全部发生错义突变。21例单耐异烟肼菌株中有19例发生katG基因错义突变,突变率90.47%,315位点（ser315thr）突变率63.16%,463位点（arg463leu）突变率78.95%;9例发生inhA基因错义突变,突变率42.86%,145位点（val145gly）突变率77.77%;5例发生rpoB基因错义突变,突变率23.81%,位点较分散。另外,39例耐药菌株中,有10例发生rpoB、katG、inhA多基因联合突变,突变率25.64%。结论 rpoB、katG、inhA基因突变与初治肺结核患者耐药密切相关,上述三种基因在450（ser450leu）、315（ser315thr）、463（arg463leu）、145（val145gly）等位点突变是本地区结核分枝杆菌对异烟肼、利福平耐药的重要机制之一。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG点突变的快速检测

目的：探讨快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）耐药基因型的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测了30株INH敏感菌株及30株耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分枝杆菌H37Rv作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，30株INH耐药株中28株观察到katG基因扩增产物。以H37Rv标准株为对照，30株敏感株SSCP带谱与对照相同；28株INH耐药株中13株与对照相同，15株有不同程度的差异。与药敏试验比较，PCR－SSCP检测INH耐药结核菌的敏感性为57%，特异性为100％。结论：多数结核分枝杆菌耐INH是由于katG基因突变所致，用PCR－SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分枝杆菌INH耐药基因型的目的。     

DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变的临床应用

目的:探讨DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变的临床应用效果。方法:通过数字表法选择2014年5月—2016年5月初步诊断为结核病患者70例的痰样,使用DNA微陈列芯片法快速检测,并同时通过传统药敏试验和DNA测序法进行再次检查以作为对照。结果:70株结核分枝杆菌中药物敏感株芯片杂交共计20株,这一结果完全符合标准株,符合率100%(20/20),30株耐利福平(RIF)临床分离株均检测到rpoB基因突变,基因突变检出率为100%(30/30),50株异烟肼耐药株中有41株检测katG基因突变,检出率82.00%,9株检测到inhA基因突变,检出率18.00%(9/50),这一检测结果和测序结果完全符合。结论:DNA微陈列芯片法快速检测结核分枝杆菌rpoB、katG和inhA基因突变效果良好,虽然暂且不能代替传统的药敏试验方法,但其检测的灵敏度高,特异性和重复性好。     

59株耐药结核分枝杆菌DNA芯片检测结果分析

目的 探讨结核分枝杆菌基因突变和耐药性的关系。方法 用DNA芯片检测和测序对59株耐药结核分枝杆菌进行耐异烟肼(katG、inhA、ahpC)、耐利福平(rpoB)基因检测。结果 59株耐药分枝杆菌菌株中。分别有40株(40／59)测出ropB基因突变。有32株(32／59)测出katG基因突变。另有三株katG缺失．同时测出两种及两种以上基因突变32株，改良罗氏培养法检测出27株为耐异烟肼、利福平菌株中，基因芯片检测24株(24／27，占88．9％)有基因突变。其中18株存在两种或两种以上基因突变(18／27)。另抽取11株进行DNA测序，与芯片检测结果完全相符。结论 用DNA芯片检测结核分枝杆菌对异烟肼、利福平的耐药性有较高的特异性和灵敏度，与培养法检测结果基本吻合。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的 探讨结核分支杆菌对异烟肼(INH)的耐药分子机制,检测KatG、inhA基因突变在结核分支杆菌对INH耐药性测定中的应用价值.方法采用PCR和PCR-SSCP方法对95株结核分支杆菌临床分离株和47例耐INH肺结核患者痰标本KatG基因突变进行检测.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,44株药物敏感株的KatG、inhA基因突变率分别为4.5%、0.51株耐INH分离株中,31株KatG基因发生突变,突变率为60.8%;3株inhA基因发生突变,突变率为5.9%.47例耐INH肺结核患者痰标本中,KatG基因44例扩增阳性、inhA基因40例扩增阳性,其基因突变检测率分别为47.7%、7.5%.结论 KatG基因突变是INH耐药性的重要分子机制,inhA基因与INH耐药性有相关性.     

华南地区380株结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变情况分析

目的探讨华南地区异烟肼耐药结核分枝杆菌临床分离株katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA和ndh基因的突变特点。方法在广州地区分枝杆菌菌株库中, 选择异烟肼耐药性测定结果明确的380株来自华南地区结核病患者的结核分枝杆菌临床分离株, 其中异烟肼耐药株236株和异烟肼敏感株144株, 对380株结核分枝杆菌临床分离株的5种异烟肼耐药基因片段进行序列测定分析。描述性分析各基因突变出现的频率。结果在INH耐药株和敏感株中分别发现26个位点29种突变类型、16个位点17种突变类型, 均以katG基因315AGC(S)→ACC(T)、mabA-inhA基因-15T→C最为常见, 发生率分别为48.73%(115/236)、17.37%(41/236)和9.72%(14/144)、9.72%(14/144);在katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA和ndh中分别发现3个位点5种突变、5个位点5种突变、11个位点13种突变、6个位点6种突变和11个位点11种突变, 在INH耐药株和敏感株中5个基因突变的发生率分别为52.12%(123/236)、22.46%(5...     

结核分支杆菌异烟肼耐药性的杂交检测

目的通过检测结核分支杆菌KatG基因、inhA基因突变情况,分析核酸杂交检测方法在耐异烟肼耐药性测定中的应用价值。方法应用PCR扩增和核酸杂交检测方法对35例耐异烟肼肺结核患者痰标本和102株结核杆菌临床分离株KatG、inhA基因突变进行杂交检测。结果 102株结核杆菌临床分离株中,42株对异烟肼敏感的菌株中KatG、inhA基因突变率为4.8%、0。60株对异烟肼耐药菌株株中,KatG基因突变率为61.6%（38/60）;inhA基因突变率为5.0%（3/60）。结论应用PCR和核酸杂交检测技术检测结核杆菌KatG、inhA基因突变情况,可以提供结核杆菌对异烟肼耐药性的初步诊断。     

广东地区临床分离结核分枝杆菌KatG、rpoB、rpsL耐药基因变异研究

目的本研究主要针对从广东地区500例疑似结核病患者痰液中分离的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药情况与其对应的突变基因katG、rpoB、rpsL 关系研究.方法采用PCR和DNA测序法对结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB 和rpsL 基因进行序列分析.结果分离得到耐INH 35株、耐RFP 27株、耐SM 25株.INH耐药株katG 基因突变率为71.4%(25/35),RFP耐药株rpoB 基因的突变率为81.5%(22/27),SM 耐药株rpsL 基因突变率为76%(19/25);INH以Ser315Thr突变60%(21/35)最常见,RFP以Ser531Leu突变55.6%(15/27)最常见,SM以Lys43Arg位氨基酸突变72%(18/25)常见.结论 katG、rpoB 和rpsL 基因突变被证实是广东地区结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性产生的主要分子机制,PCR-DNA测序法可快速检测结核分枝杆菌INH、RFP和SM耐药性.     

基因芯片技术诊断耐多药结核病的临床应用研究

摘要： 目的 探讨基因芯片法检测耐多药结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因 rpoB、katG 和 inhA 突变的特点, 评估其临床应用价值。 方法 选取 2013—2014 年石家庄地区耐多药结核分枝杆菌临床分离株 76 株, 采用基因芯片法检测 rpoB、katG 及 inhA 基因耐药突变位点及频率, 以比例法药敏结果为金标准, 评价基因芯片法检测菌株耐药的准确度、灵敏度和特异度, Kappa 检验评价基因芯片法和比例法药敏结果的一致性。 结果 在 76 株石家庄地区耐多药结核分枝杆菌临床分离株中, 69 株检测到 katG/inhA 基因发生单一或联合突变, 其中 katG 基因优势突变位点为 315, 占 89.9%（62/69）, 5.8%（4/69）存在 inhA -15（C→T）突变, 4.3%（3/69）发生 katG 315 位点和 inhA 启动子区域的联合突变。 73 株检测到 rpoB 基因发生突变, 优势突变位点为 531, 占 64.4%（47/73）; 其次是 526, 突变率为 15.1%（11/73）; 12.3%（9/73）发生 516 位点突变; 1.4%（1/73）发生 513 位点突变; 1.4%（1/73）发生 533 位点突变; 另有 5.5%（4/73）发生多位点的联合突变。 以比例法药敏结果为金标准, 基因芯片法检测利福平耐药的敏感度为 96.1%（73/76）, 特异度为 100.0%（50/50）, 总准确度为 97.6%（123/126）; 检测异烟肼耐药的敏感度为 90.8%（69/76）, 特异度为100.0%（50/50）, 总准确度为 94.4%（119/126）; 基因芯片法检测耐多药结核的敏感度为 86.8%（66/76）, 特异度为100.0%（50/50）, 总准确度为 92.1%（116/126）。 结论 本地区耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因优势突变类型为katG 基因 315 位点和rpoB 基因 531 位点, 基因芯片法可快速、有效诊断耐多药结核病。     

PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究

目的：应用PCR－SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变,评价此方法用于结核分杆菌利福平（RFP）及异烟肼（INH）耐药性试验的意义。方法：以结核分支杆菌H37Rv为对照,30例耐RFP（单耐或多耐）、21例耐INH（单耐和多耐）的结核分枝杆菌临床分离株及10例敏感菌株;39例菌阳肺结核患者及30例非结核 性肺部疾病患者痰标本,采用PCR－SS－CP技术检测痰标本和菌株中的结核杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变,并与药敏试验对照。结果：PCR－SSCP检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG及ahpC基因突变的阳性率分别为79％（31／39）、46％（18／39）及5％（2／39）.结论：PCR－SSCP可望成为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平及耐异烟肼的快速方法。     

成骨细胞的功能与损伤和骨质疏松的防治

骨质疏松是一种全身性骨骼疾病,导致骨折风险增加。成人的骨量通过破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成作用来维持动态平衡,治疗骨质疏松症的理想策略是抑制破骨细胞的骨吸收和/或增强成骨细胞的骨形成功能。目前针对保护成骨细胞及增强其功能的骨质疏松疗法相对较少。因此,本文针对成骨细胞相关功能蛋白、各种细胞损伤机制（内质网应激、氧化应激、机械过载、微小RNA和长链非编码RNA的影响等）及骨质疏松的治疗与预防作一综述,以期为针对增强成骨细胞功能的骨质疏松治疗策略提供新思路。     

PTEN和DNA含量与非小细胞肺癌侵袭转移的关系探讨

目的 研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中抑癌基因PTEN的表达和DNA含量与NSCLC侵袭、转移的关系.方法 采用免疫组织化学SP方法检测PTEN在78例肺癌标本中的表达,并用流式细胞术检测30例肺癌标本中DNA含量.结果:肺癌标本中PTEN蛋白总缺失率为42.3%,有淋巴结转移组和无淋巴结转移组肺癌表达缺失率分别为52.1%和26.7%(P＜0.05),其表达缺失率随TNM分期增加而上升,分期越晚表达缺失率越高.PTEN缺失率高者生存时间短.DNA指数(DI)的分布范围在1.04～1.93.异倍体肿瘤24例,DI值随TNM分期增加而增加(P＜0.05),与淋巴结转移呈正相关.结论 肺癌组织中PTEN的表达与肺癌淋巴结转移有显著相关性,肺癌细胞DNA含量与肺癌TNM分期及淋巴结转移密切相关.检测PTEN蛋白表达和DNA含量将有助于判断肺癌的转移及预后.     

CD44与肿瘤侵袭、转移及预后的关系

CD44是一种跨膜受体蛋白 ,属于黏附分子家族 ,可与透明质酸等配体结合 ,介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附。近年来发现CD44及其变异体在许多肿瘤细胞中异常表达 ,且与肿瘤的发生发展及患者的预后存在着一定的关系 ,因此 ,可作为一个辅助性指标预测肿瘤的发展情况     

Seasonal variation of alkaloids of Adhatoda vasica and detection of glycosides and N-Oxides of vasicine and vasicinone

The distribution pattern of the alkaloids of A. Vasica has been studied with change of season. The study also resulted in the detection of glycosides and N-oxides of vasicine and vasicinone.