H1299细胞中Plk3对p73转录活性的影响

背景与目的：研究表明蛋白激酶Plk3可以增加肿瘤抑制因子p53的转录活性,但对p73转录活性的影响尚不清楚,因此本实验旨在研究蛋白激酶Plk3对p73转录活性的影响。方法：选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及克隆形成实验的方法研究蛋白激酶Plk3及激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73转录活性的影响。结果：荧光素酶报告剂分析结果显示,单独转染p73基因可以增加p21WAF1和Bax启动子介导的荧光素酶的表达（P〈0.05）;共转染p73基因和Plk3基因,p21WAF1和Bax启动子介导的荧光素酶的表达与单独转染p73基因组相比显著降低（P〈0.05）,且呈浓度依赖性;而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p21WAF1和Bax启动子介导的荧光素酶的表达没有显著影响（P〉0.05）。RTPCR检测结果也显示,p73诱导p21WAF1和Bax的mRNA表达（P〈0.05）,Plk3降低了p73诱导的p21WAF1和Bax的mRNA表达水平（P〈0.05）;而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73诱导的p21WAF1和Bax的mRNA表达水平无显著影响（P〉0.05）。克隆形成实验结果显示,p73抑制了H1299细胞克隆的形成（P〈0.05）,Plk3降低了p73对H1299细胞克隆形成的抑制（P〈0.05）,而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73抑制H1299细胞克隆形成无显著影响（P〉0.05）。结论：Plk3可以抑制p73的转录活性,而激酶活性缺失的Plk3（K52R）对p73的转录活性无明显影响。     

p73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响

背景与目的:实验证明野生型p53基因能增强大多数非小细胞肺癌的化疗敏感性。p53基因的同源体p73与其在结构和功能上都具有高度的相似性。本研究拟探讨p73基因对人肺腺癌细胞株H1299化疗敏感性的影响。方法:通过脂质体介导将p73α基因导入人肺腺癌细胞株H1299,G418筛选获得稳定表达P73α的阳性细胞克隆。Westernblot检测转染细胞中P73α蛋白的表达;MTT法检测细胞存活率,观察转染细胞对阿霉素、顺铂的敏感性变化;采用流式细胞仪和TUNEL法检测.p73646化疗药诱导前后转染细胞凋亡的变化;克隆形成实验观察细胞生物学性状的变化。结果:转染p73α基因的H1299细胞可以稳定高表达P73α蛋白。MTT实验提示顺铂和阿霉素的IC50值分别减少了86.2%和99.2%,转染细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度(1.25μmol/L的顺铂或0.05μmol/L的阿霉素)作用下生长明显受到抑制。流式细胞术显示p73α基因转染后顺铂诱导的细胞凋亡率从10.1%升高到38.4%(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率从12.1%升高到49.3%(P<0.01)。克隆形成实验显示p73α基因转染能明显降低化疗后H1299细胞的克隆形成数(P<0.01),对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为1.8和2.6倍。结论:转染p73基因可以提高H1299细胞对阿霉素、顺铂等化疗药的敏感性。该作用可     

人黑素瘤抗原MAGE-A4对p53转录活性的影响

目的:探讨人黑素瘤抗原-A(melanoma antigen-A,MAGE-A)对p53转录活性的影响.方法:选用p53缺失型人肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告分析法、RT-PCR、Western印迹法、克隆形成实验和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling,TUNEL)等方法研究MAGE-A4对p53转录活性的影响.结果:荧光素酶报告分析结果显示,转染p53基因(25 ng)可以使p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达增加(P＜0.01);共转染恒定量(25 ng)的p53基因和不同量的MAGE-A4基因(100、200和400 ng)后, p21WAF1启动子介导的荧光素酶表达均明显高于单独转染p53基因时的表达量(P＜0.01).RT-PCR和Western印迹法检测结果也显示,转染p53基因可以使p21WAF1mRNA和蛋白表达水平增加(P＜0.01),共转染MAGE-A4基因和p53基因后,p21WAF1mRNA和蛋白表达水平均明显高于单独转染p53基因时的表达水平(P＜0.01).克隆形成实验及TUNEL染色结果显示,转染p53基因可以使H1299细胞克隆形成数减少及凋亡细胞数增加(P＜0.01),共转染MAGE-A4基因和p53基因以后,H1299细胞克隆形成数与单独转染p53基因组相比减少,而凋亡细胞数与单独转染p53基因组比较增加(P＜0.01).结论:MAGE-A4可以增强p53的转录活性及功能发挥.     

p53突变型乳腺癌细胞系中14-3-3σ对p73基因稳定性的影响

目的探讨在p53突变的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，14-3-3σ对p73基因稳定性的影响。方法采用基因转染、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白质印迹检测（Western blot）和放线菌酮（CHX）蛋白抑制分析的方法研究14-3-3σ对p73基因稳定性的影响。结果RT-PCR显示，单独转染1μgp73后，p73与GAPDH的灰度值比为0．635；转染1μgp73＋1μgld-3-3σ和1μgp73＋2μg14-3-3σ后，p73与GAPDH的灰度值比分别为0．643和0．631。Western-blot显示，单独转染1μgp73后，p73与actin的灰度值比为0．333；转染1μgp73＋1μg14-3-3σ和1μgp73＋2μg14&#183;3-3σ之后，p73与actin的灰度值比分别为0．797和0．826。放线菌酮蛋白抑制分析显示：单独转染p73的对照组，放线菌酮处理0、1、2、4、6h后，p73与actin灰度比值分别为0．075、0．166、0．124、0．100和0．092；而共转染p73和14-3-3σ的实验组结果分别为0．963、0．244、0．244、0．234和0．185。结论在转录水平上，14-3-3σ．不影响p73基因的稳定性；而在蛋白表达水平上，14-3-3σ可以增加p73基因的稳定性。     

c-Met小分子酪氨酸激酶抑制剂ARQ197对肺癌H1299细胞放射增敏作用的实验研究

目的 观察酪氨酸激酶抑制ARQ197对肺癌H1299细胞的放射增敏作用及机制。方法 首先用不同浓度的重组人肝细胞生长因子(HGF)和ARQ197分别处理H1299 细胞,应用克隆形成实验法检测细胞增殖,筛选出用于放射敏感性研究的HGF和ARQ197的合适浓度。随后将细胞分为对照组、HGF处理组、ARQ197处理组、HGF+ARQ197处理组,观察不同组别之间差异。最后用蛋白印记检测HGF、单纯放射或联合应用ARQ197对c-Met及下游Akt和Erk1/2蛋白表达和活化的影响。结果 H1299细胞的克隆形成率随着HGF浓度增加呈进行性升高,而ARQ197则进行性下降。LQ模型细胞存活曲线示HGF、HGF+ARQ197处理及ARQ197对H1299细胞的放射增益比分别为0.85、1.20、1.27(存活分数为0.1时的剂量比)。H1299细胞在HGF刺激后p-cMet、p-Akt、p-Erk1/2高表达,HGF+ARQ197中随着ARQ197浓度增加p-cMet、p-Akt、p-Erk1/2蛋白表达进行性下降。细胞接受2 Gy照射后p-cMet、p-Akt、p-Erk1/2高表达,但照射+ARQ197后p-cMet、p-Akt、p-Erk1/2蛋白表达显著下降,但总的cMet、Akt、Erk1/2蛋白表达无明显变化。结论 ARQ197通过抑制HGF/c-Met及其下游传导通路的活化对离体肺癌H1299细胞有显著放射增敏作用。     

厄洛替尼对非小细胞肺癌H1299细胞放射增敏研究

目的 探讨表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂对人非小细胞肺癌细胞放射敏感性的影响及其可能的机制。方法 体外培养人非小细胞肺癌细胞H1299。CCK-8检测厄洛替尼对H1299的毒性作用,并计算 IC50及 IC20,将 IC20作为后续试验的药物作用浓度。克隆形成实验检测射线联合厄洛替尼对H1299的作用,计算放射敏感性参数,绘制细胞存活曲线。流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡。Western blot检测细胞EGFR/PI3K/AKT通路及凋亡相关蛋白表达。结果 厄洛替尼对H1299具有一定增殖抑制作用,IC50为27.3μmol/L、 IC20为3.3μmol/L。X射线联合 IC20浓度厄洛替尼能够降低H1299的克隆能力,使 G0/G1期、G2/M期比例增加,S期减少比例,细胞凋亡增加;抑制pEGFR及pAKT蛋白表达,增加凋亡相关蛋白Active Caspase 3、Cleaved PARP表达。结论 厄洛替尼对H1299具有放射增敏作用,其可能的机制是厄洛替尼联合射线抑制EGFR/PI3K/AKT通路,降低细胞损伤修复能力,改变细胞生长周期,诱导细胞凋亡。     

肺癌mdig基因对H3k9me3的去甲基化作用

目的:观察肺癌mdig基因对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基的甲基化状态的作用。方法:用过表达和沉默mdig质粒转染人类肺腺癌细胞系A549细胞建立稳定转染细胞系,通过免疫蛋白印迹法和免疫荧光法检测mdig对H3k4me3、H3k4me2、H3k4me1,H3k9me3、H3k9me2、H3k9me1,H3k27me3、H3k27me2、H3k27me1,H3k36me3、H3k36me2、H3k36me1及H4k20me3的甲基化状态的影响。结果:免疫蛋白印迹法显示过表达mdig引起H3k9me3的表达减弱,沉默mdig引起H3k9me3的表达增强,组蛋白H3上的4、27、36和组蛋白H4上的20位点上的赖氨酸残基甲基化状态未见明显变化。免疫荧光法显示沉默mdig引起H3k9me3的荧光表达增强,与免疫蛋白印迹法结果一致。结论:肺癌mdig基因对H3k9me3有去甲基化的作用,未见其对其他赖氨酸位点的去甲基化作用。     

p63和p73的表达与苯并(a)芘致H1299和16HBE细胞DNA损伤的关系

背景与目的:研究p63与p73的mRNA表达与BaP致人肺腺癌细胞(H1299)和人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤的关系.材料与方法:分别用不同浓度BaP(8、16、32、64和128 μmol/L)处理H1299和16HBE两种细胞,在4 h和12 h时,使用相应的生化检测试剂盒分别测定细胞裂解液中MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性,用qRT-PCR方法测定处理后细胞的p53、p63、p73、mdm2和mdm4的mRNA水平;用Comet实验评价细胞DNA损伤程度.结果:16、32和64 μmol/L BaP处理4 h时,两种细胞MDA水平显著性升高,SOD和GSH-Px活性显著性下降(P<0.05).用BaP处理H1299和16HBE细胞4 h和12 h时均观察到DNA损伤随浓度增加而加重,且呈剂量-效应关系(P<0.01),mdm2、mdm4 mRNA表达水平升高(P<0.01).不过仅在12 h时p53基因mRNA表达水平较对照组显著增加(P<0.01).在4 h和12 h时点,仅在H1299细胞的p63和p73 mRNA表达增加(P<0.05). 结论:在BaP致p53缺失的H1299细胞的DNA损伤中,BaP可能通过不依赖p53信号通路激活了p63和p73 mRNA的表达.     

p33ING1b对鼻咽癌细胞HNE1增殖的影响

背景与目的：作为ING1的一种主要表达产物，p33^ING1b蛋白结合和稳定p53后诱导肿瘤细胞周期阻断或引起细胞凋亡。本研究通过建立高表达p33^ING1b的鼻咽癌细胞HNE1模型，探讨p33^ING1b对鼻咽癌细胞增殖影响及分子作用机制。方法：利用脂质体介导转染HNE1细胞，RT—PCR法筛选p33^ING1b高表达的阳性克隆，绘制生长曲线检测细胞增殖速度，免疫组化法检测细胞中p53的表达分布，流式细胞术检测细胞周期，Western blot法检测p53、p21、Stat3、C-myc和Cyclin D1蛋白水平。结果：转染ING1后p33^ING1b表达水平显著升高，HNE1细胞增殖能力受到抑制，出现G0／G1期的阻滞、S期比例下降。细胞中Stat3、C—myc和CyclinD1表达水平显著降低，p53与p21表达水平上升。结论：p33^ING1b可能通过促进HNE1细胞中p53和阻断Stat3两种不同信号传导通路抑制鼻咽癌细胞的增殖。     

p53基因245位点突变对非小细胞肺癌细胞H1299的影响

背景与目的:p53基因突变是肺腺癌发生中的常见的分子生物学事件,第245位点突变为其突变热点之一,因此研究p53基因第245位点突变可能为肺腺痛的诊断、治疗提供一定的理论基础.本研究旨在研究肺癌常见的245位点突变对p53缺失的人肺腺癌细胞系H1299的影响.方法:应用流式细胞术观察脂质体瞬时转染p53基因第245突变体(G245V)对细胞凋亡的影响,同时用稳定转染观察克隆形成率和生长曲线的不同.结果:转染G245V突变体的H1299细胞凋亡平均数低于转染野生型p53基因的细胞,差异有统计学意义(P<0.001);大中克隆形成数量比导入野生型p53基因的细胞大中克隆形成数量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);细胞的生长速度也明显加快.结论:p53基因第245位点发生突变后基本丧失了野生型p53的功能,是肿瘤细胞增殖的原因之一.     

MAGE-A9对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中P53转录活性及功能的影响

目的：探讨黑素瘤相关抗原-A9（melanoma-associated antigen,MAGE-A9）对人乳腺癌细胞中P53转录活性及功能的影响。 方法：通过LipofectamineTM 2000体外转染质粒pcDNA3.0、pcDNA3.0-p53、pCMV6-MAGE-A9 和pcDNA3.0-p53/MAGE-A9至人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting检测细胞中 p21WAF1 mRNA和蛋白的表达,荧光素酶报告基因分析检测细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶表达活性,MTT法检测转染不同质粒对MDA-MB-231细胞增殖的影响。 结果： 转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 mRNA和蛋白表达水平均明显低于pcDNA3.0-p53组\[(0.15±0.01) vs (0.18±0.02),(0.03±0.00) vs (0.06±0.01);均P<0.05\]。转染pcDNA3.0-p53质粒可以增强MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶的表达\[(58.56±3.47) vs (1.00±0.12),P<0.01\],转染pcDNA3.0-p53/MAGE-A9后,MDA-MB-231细胞中 p21WAF1 启动子介导的荧光素酶的表达较转染pcDNA3.0-p53组明显降低\[(22.02±4.91) vs (58.56±3.47),P<005\]。与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-p53组MDA-MB-231细胞增殖率明显明显降低\[(228.89±2239)% vs (337.23± 23.67)%,P<0.05\];而pcDNA3.0-p53/MAGE-A9组MDA-MB-231细胞增殖率明显高于pcDNA3.0-p53组\[(291.51±591)% vs (228.89±22.39)%,P<0.05\]。 结论： MAGE-A9可抑制MDA-MB-231细胞中P53的转录活性及细胞增殖。     

Effects of curcumin on proliferation of NB4 cells and acetylation of histone H3 and P53

Objective: To investigate the effects of curcumin on the proliferation of NB4 cells and the acetylation of histone H3 and no-histone p53. Methods: NB4 cells were cultured and Weated with or without curcumin at different concentration (50 μmol/L, 25μmol/L,12.5μmol/L, 6.25μmol/L, 3.125μmol/L) at various time points (oh, 4h, 8h, 12h, 24h). Western blot analysis was performed to determine the level of acetylated histone H3, p53 and acetylated p53, MTT assay was performed to examine the proliferation of NB4 cells. Results: the proliferation of NB4 cells was inhibited by curcumin in atime- and dose-dependent manner, the IC50 at 24h and 36h were 40μmol/L and 25μmol/L respectively. The levels of acetylated histone H3 and acetylated p53 were increased obviously. Conclusion: curcumin possessed the founction of deacetylases inhibitor, increased the level of acetylated histone H3 and the expression of tumor suppressor p53, enhanced later‘s activity, and inhibited the proliferation of NB4 cell.     

P33ING1、p53在膀胱移行细胞癌中的表达及与细胞凋亡的相关性

目的:探讨抑癌基因P33ING1在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其与p53蛋白表达及细胞凋亡的相关性.方法:利用免疫组化S-P法和TUNEL.法检测83例BTCC及11例正常膀胱黏膜组织P33ING1、p53的表达及细胞凋亡指数(AI).结果:83例膀胱移行细胞癌组织中,P33ING1蛋白的阳性表达率为59.03%,而正常膀胱黏膜组织中P33ING1蛋白阳性表达率为90.9%.P33ING1蛋白表达与膀胱移行细胞癌的WHO肿瘤分级有相关性.spearman相关分析表明P33ING1蛋白表达与p53蛋白表达正相关(P<0.05).AI与P33ING1及p53蛋白表达无相关性.结论:P33ING1在膀胱移行细胞癌中表达下降可能在膀胱移行细胞癌的发生、发展过程中起重要作用,P33ING1与p53基因具有协同作用,同时检测p53的状态和P33ING1表达水平,对于膀胱癌的诊断、治疗和预后判断可能具有积极意义.     

沉默LncRNA HOXD-AS1调控miR-454-3p表达增加H460细胞放射敏感性

目的 探究LncRNA HOXD-AS1靶向调控miR-454-3p表达对肺癌H460细胞放射敏感性影响。方法 qRT-PCR检测HOXD-AS1、miR-454-3p表达量,流式细胞术检测细胞凋亡率,克隆实验检测细胞放射敏感性。蛋白印迹法检测细胞中Caspase-3、Cyclin D1、γ-H2AX的蛋白表达量。结果 照后细胞中HOXD-AS1表达升高(P<0.05),miR-454-3p表达降低(P<0.05)。沉默HOXD-AS1促进细胞凋亡、增加放射敏感性,促进Caspase-3、γ-H2AX蛋白表达,抑制Cyclin D1表达;HOXD-AS1可靶向结合miR-454-3p并可负向调控其表达。结论 沉默HOXD-AS1可靶向调控miR-454-3p促进肺癌细胞凋亡及抑制细胞存活进而提高放射敏感性。