D-GalN/LPS诱导大鼠急性肝衰竭中髓过氧化物酶和 Nrf2/HO-1信号通路的变化

目的 探讨D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)诱导急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)大鼠中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路的变化及ALF的发生机制。方法 SD大鼠随机分为对照组和ALF组。ALF组：将D-GalN 800 mg/kg和LPS 8μg/只同时腹腔注射,于注射后6、12和24 h检测血清总胆红素(TBiL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量。ELISA法检测血清MPO、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平,比色法测定MPO活性,RT-PCR检测肝组织Nrf2和HO-1的mRNA水平,Western blot法检测肝组织MPO、Nrf2和HO-1蛋白水平。结果 与对照组比较,ALF组血清MPO水平于造模后6 h升高,12 h为最高,24 h开始下降(23.33±2.06 vs. 33.00±3.16, 65.75±7.02, 53.92±5.63,P<0.05);血清TNF-α(1...     

人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

目的 构建肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒，为进一步研究其相互作用蛋白奠定基础。方法 将人肝再生增强因子的编码序列重组入pGBKT载体中，经酶切及序列分析鉴定构建正确后，转化酵母AHl09菌株，转化子在SD／-His／-Trp选择培养基上培养；滤纸法β-半乳糖苷酶活性测定；Westem blot检测目的蛋白表达情况。结果 正确地构建了人肝再生增强因子的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-hALR，其酵母AHl09转化菌在SD／-Trp培养基上30℃培养65h，长出φlmm菌落，而在SD／-Trp-His培养基上不生长，β-半乳糖苷酶活性检测呈阴性。Westem blot结果显示目的蛋白以35KD的融合蛋白形式表达。结论 诱饵质粒pGBKT7-hALR对宿主菌AHl09没有毒性作用，能稳定表达目的蛋白，不能自身激活报告基因，可用于酵母双杂交的筛选工作。     

重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代 半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.     

肝再生增强因子的生物学作用研究进展

肝再生增强因子(ALR)是近年来发现的一种新型的能促进肝脏再生和生长的细胞因子。目前对肝再生增强因子各方面都进行了比较深入的研究,尤其在生物学作用研究中发现了其在肝再生以外的很多功能。现就其生物学作用方面的研究进展作一综述。     

丹参多酚酸盐对急性肝衰竭大鼠的早期治疗作用研究

目的 研究丹参多酚酸盐对急性肝衰竭大鼠早期治疗效果并探讨其中可能的机制,方法建立D-氨基半乳糖(D-gag aetosamine,D-GaIN)和脂多精(LPS)诱导的大鼠急性肝衰竭模型,观察早期应用丹参多酚酸盐对大鼠存活率和肝组织病理改变的影响,以及对肝功能指标(ALT、AST、TB)的影响和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、门细胞介素-6(IL-6)的调节.结果 早期使用丹参多酚酸盐组(给药组)死亡比例为5/12,未给药组(AHF组)死亡比例为10/12,两组死亡率比较差异有统汁学意义(P<0.05),、肝组织病理学镜检显示,给药组肝组织结构基本完整,可见肝细胞肿胀,部分细胞空泡变性,并见碎片状坏死.少量充血和少量炎细胞浸润;AHF组见肝小叶结构破坏.肝细胞大片变性坏死,坏死区炎细胞浸润,肝窦扩张,可见淤血及出血,给药组病理形态学明显改善.给药组病理指数为0.19±0.10,AHF组为0.34±0.09,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),给药组ALT、AST和TB分别为(1593±706)U/L、(2978±521)U/L和(7.18±2.98)μmol/l..AHF组分别为(4973±1582)U/L、(5498±2730)U/L和(16.37±2.45)μmol/L,两组比较差异有统计学意义.蛋白免疫印迹法显示,给药组肝组织TNF-α和IL-6表达下调:结论使用丹参多酚酸盐对急性肝衰竭大鼠具有明显的治疗效果.其机制可能涉及下调促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达.     

NF-κB在肝细胞及肝脏疾病中作用的研究进展

核因子-κB（NF-κB）是近年来研究极为广泛的转录调控因子，具有多种转录调节活性。参与细胞因子、活化因子、生长因子和粘附分子及某些急性期反应蛋白转录活性的调控，在正常及疾病状态下、在肿瘤的发生和发展过程中有重要作用。NF-κB在肝细胞、肝癌细胞都有表达，在肝移植、肝缺血再灌注损伤等病理生理过程中均发挥重要作用。     

小凹-小凹蛋白的生物学特性

Caveolae(小凹 )是细胞质膜表面富含胆固醇的疏水性泡状内陷微区 ,是信号转导的信使中心 ,有利于信号分子间的相互作用。它们广泛存在于各种类型的细胞。Caveolin(小凹蛋白 )是Caveolae的表面标记蛋白 ,是各种信号分子的支架蛋白和负性调节蛋白 ;Caveolin 1是一种候选的肿瘤抑制因子。Caveolae Caveolin在体内参与了许多生物学过程。     

联合应用骨髓间充质干细胞与促肝细胞生长素治疗大鼠急性肝衰竭

目的 评价骨髓间充质干细胞(MSCs)和促肝细胞生长素(pHGF)联合治疗大鼠急性肝衰竭(ALF)的可行性.方法 将ALF造模成功的37只SD大鼠分为4组:CC14组(A组,9只),CCl4/MSCs(B组,9只),CC14/pHGF组(C组,9只)和CC14/pHGF+ MSCs组(D组,10只).用携带hrGFP基因的慢病毒感染MSCs(hrGFP-MSCs),并以hrGFP示踪.对C、D组大鼠给予CCl4,同时腹腔注射pHGF;B组和D组造模12h后肝内注射hrGFP-MSCs悬液.对各组大鼠分别在造模后24 h、72 h、7天检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平,造模后72 h检测血清IL-6、IL-10、TNF-α炎症因子水平,造模后24 h取肝组织行HE染色,造模72 h行PCNA免疫组化染色检测肝细胞增殖情况.造模后72 h后取注射部位肝组织行冰冻切片观察移植hrGFP-MSCs肝内分布情况,对非注射部位肝组织进行实时荧光定量RT-PCR检测hrGFP基因含量.结果 联合治疗后,ALF大鼠外周血ALT水平降低,IL 6、IL-10、TNF-α炎症因子水平下调,肝脏病理组织学损害减轻,肝细胞增殖率增高.造模后72 h,B组与D组注射部位肝组织内可见移植的hrGFP-MSCs,非注射部位肝组织未见hrGFP荧光阳性细胞,但用实时荧光定量RT-PCR技术可在非注射部位肝组织内检测到hrGFP基因,且D组含量高于B组.结论 pHGF与MSCs联合治疗大鼠ALF的疗效优于MSCs或pHGF单独治疗,可能与pHGF促使其肝内定植MSCs增多有关.     

NF-κB在肝细胞及肝脏疾病中作用的研究进展

核因子-κB(NF-κB)是近年来研究极为广泛的转录调控因子,具有多种转录调节活性。参与细胞因子、活化因子、生长因子和粘附分子及某些急性期反应蛋白转录活性的调控,在正常及疾病状态下、在肿瘤的发生和发展过程中有重要作用。NF-κB在肝细胞、肝癌细胞都有表达,在肝移植、肝缺血再灌注损伤等病理生理过程中均发挥重要作用。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆及序列分析

背景:肝再生增强因子是一种重要的次级肝再生因子,能够特异性地促进肝脏再生.目的:将乳鼠肝脏提取的RNA,利用特异引物克隆到肝再生增强因子基因,对其进行了生物信息学分析.设计、时间及地点:基因分子学体外实验,于2008-03/05在河南大学生命科学学院神经生物学实验室完成.材料:SPF级3日龄Wistar大鼠肝组织.方法:取3日龄Wistar大鼠肝组织.按异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提肝组织总RNA,按分子生物学实验指南的步骤进行反转录-聚合酶链反应方法扩增目的片段,用凝胶同收试剂盒回收纯化目的基因,连接T载体,转入大肠杆菌,提取质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.应用分子生物学软件对测序结果进行分析.主要观察指标:聚合酶链反应扩增条带观察;测序结果分析;丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点的预测;系统进化树分析.结果:聚合酶链反应扩增结果与目的片段位置一致,测序结果表明为肝再生增强因子mRNA,基因全长378 bp,在人、牛、小鼠、斑马鱼等物种中高度保守.结论:实验成功克隆了大鼠肝再生增强因子基因.     

Fibrinogen derivatives and platelet activation products in acute and chronic liver disease

1. The concentration in plasma of fibrinogen derivatives fibrinopeptide A (FPA) and B beta 1-42 and the platelet release products beta-thromboglobulin (beta TG) and platelet factor 4 (PF4) have been determined in patients with acute and chronic liver disease. 2. In 21 patients with fulmiant hepatic failure on admission in grade III or IV coma the plasma FPA, B beta 1-42, beta TG and PF4 levels were significantly increased compared with those in normal control subjects. On heparinization before haemoperfusion the FPA levels returned to the normal range and during resin and charcoal haemoperfusion there were no significant changes in the coagulation or platelet factors, except for a small increase in FPA with charcoal haemoperfusion. 3. In ten patients with compensated chronic liver disease there was a significant increase in B beta 1-42 and beta TG levels but not FPA and PF4 as compared with normal controls. 4. Interpretation of the results is complicated by the possible reduced clearance of these proteins as a result of renal failure in some of the patients with fulminant hepatic failure and also by the damaged liver itself. However, these results have confirmed that disseminated intravascular coagulation can occur in both acute and chronic liver disease.     

肝细胞生长因子对肝再灌注损伤的治疗作用

目的：观察肝细胞生长因子(HGF)对肝缺血再灌注(IR)损伤的治疗作用并探讨其作用机制。方法：建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型，在恢复灌注后立即经静脉给予HGF0．5mg／kg，以后每12h给药1次，而对照组仅给予平衡盐治疗。均检测肝功能、组织病理学变化以及肝脏重量变化，还利用免疫组化方法检测肝细胞PCNA表达情况，利用TUNEL法检测肝细胞凋亡情况。结果：在HGF治疗组，恢复灌注后血清ALT与透明质酸水平均明显下降。血清白蛋白水平升高。恢复灌注后24h在HGF治疗组肝坏死范围下降，TUNEL法检测恢复灌注后6h在HGF治疗组凋亡肝细胞下降。结论：HGF可促进IR造成的肝损伤的恢复，在IR损伤治疗中可能发挥一定的作用。     

Role of hepatitis C virus infection in German patients with fulminant and subacute hepatic failure

To investigate the possible role of hepatitis C virus (HCV) in fulminant and subacute liver failure, we tested serum and liver of 13 patients undergoing orthotopic liver transplantation for the presence of HCV RNA. HCV RNA was detected in specimens from two out of eight patients negative for all viral markers with suspected hepatitis non-A, non-B infection and in one out of four patients with hepatitis B virus infection. Only in this patient replication of HCV could be demonstrated. We conclude, that fulminant and subacute hepatic failure is induced by hepatitis C virus only in few patients with hepatitis non-A, non-B.     

超声作用下微泡携肝细胞生长因子治疗大鼠肝纤维化的实验研究

目的 探讨超声作用下微泡携肝细胞生长因子(HGF)对大鼠肝纤维化的治疗效果。方法 构建真核表达质粒pMD18-T/HGF;将实验大鼠随机分为5组：正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。建立肝纤维化模型,治疗14 d后处死大鼠,取血行检测丙氨酸转氨酶(ALT)评价肝功能,病理切片HE染色评价纤维化程度,免疫组化SABC法观察HGF蛋白,RT-PCR检测HGF mRNA。结果 治疗组治疗后血清肝功能优于模型组(P＜0.05),低剂量组与正常组间差异有统计学意义(P＜0.05),中、高剂量组与正常组间差异无统计学意义(P＞0.05)。病理切片示治疗组纤维化减轻;免疫组化见各治疗组HGF阳性表达,表达量随治疗剂量增高而增大(P＜0.05)。RT-PCR示各治疗组HGF mRNA表达高于模型组,且随治疗剂量的增大而增高(P＜0.05)。结论 超声作用下微泡携HGF可以有效抑制肝纤维化进程,其治疗效果在一定范围内随着治疗剂量的增大而增强。     

Intrasplenic hepatocyte transplantation: Evaluation of DNA synthesis and proliferation in auxiliary transplanted cells

The value of isolated hepatocyte transplantation as a temporary support in acute hepatic failure remains controversial regarding the functional capacities of freshly isolated and transplanted hepatocytes. To evaluate the survival rate of intrasplenically transplanted liver cells and their response to a proliferation stimulus like partial hepatectomy, 3H-thymidine incorporation into hepatic and auxiliary transplanted hepatocyte DNA was determined. The survival rate of intrasplenically transplanted hepatocytes was evaluated by analyses of m-albumin-RNA within the splenic tissue and compared to the morphological findings. The histological results show a marked decrease (greater than x 100) of intrasplenically transplanted hepatocytes within 1 week after injection. The amount of surviving cells then remained constant for 3 months without any signs of proliferation. After partial hepatectomy a stimulation of hepatic regeneration was observed in the remaining liver tissue but not in auxiliary transplanted hepatocytes. M-albumin-RNA determination of auxiliary transplanted hepatocytes revealed a decrease of m-albumin-RNA concentration of greater than 100 times within 24 h after transplantation indicating early cell necrosis of the transplanted cells. Since intrasplenically transplanted hepatocytes underwent an early cell necrosis without any evidence for a directly postoperatively inducible cell proliferation, it is concluded that a sufficient metabolic support in acute hepatic failure cannot be taken into consideration.     

急性肝功能衰竭急诊肝移植围术期治疗的单中心经验探讨

背景：急性肝衰竭行急诊肝移植患者围手术期治疗的病情复杂,风险大,并发症多,死亡率高,与普通肝脏移植有着明显不同。目的：总结急诊肝移植治疗急性肝功能衰竭的围手术期治疗经验,以提高急性肝功能衰竭的治疗成功率。方法：回顾性分析38例因急性肝功能衰竭行急诊肝移植患者的临床资料,男21例,女17例,年龄15-69岁。其中乙型肝炎病毒性肝炎23例（其中乙型合并丁型肝炎2例）,Wilsons病7例,3例为毒蕈中毒,2例不明原因药物肝脏损害,1例雷公藤多甙中毒,1例为外伤行肝脏部分切除后失代偿,1例尸体肝移植后患者。结果与结论：38例患者生存时间为13-1740d,中位生存时间为634d。患者的围手术期存活率为76%,1年存活率为63%,2年存活率为58%。9例围手术期死亡原因包括脑水肿及颅内高压、肾功能衰竭、严重肺部感染、多脏器功能衰竭、凝血功能障碍（颅内出血、上消化道出血等）、急性成人呼吸窘迫综合征、移植物原发性无功能。目前急诊肝移植仍是治疗急性肝功能衰竭最有效的方法,出血、感染、排异反应是死亡的主要原因,肝移植围手术期间每一环节的处理,对于肝移植的成功和患者长期存活具有重要意义。     

体外实验观察微泡-阳离子纳米脂质体复合物促进HGF基因转染

目的通过生物素-亲和素的特异结合,制备一种高效载肝细胞生长因子(HGF)基因的脂质微泡(LMB)-阳离子纳米脂质体复合物(LMB-CNLP),观察转染情况,探讨其对对数生长期的肝星状细胞株HSC-T6活性的影响。方法将HSC-T6细胞分为载HGF基因的LMB组、LMB-CNLP组和对照组(单纯质粒),超声辐照各组进行HGF转染。以荧光显微镜及流式细胞仪观测转染情况,ELISA试剂盒检测HGF蛋白表达情况,流式细胞仪检测HSC-T6细胞凋亡。结果 LMB-CNLP组HGF基因的转染率为41.29%,明显高于其他2组。转染后的细胞能持续表达HGF,且随着HGF蛋白增多,HSC-T6细胞凋亡率增高。结论超声辐照LMB-CNLP复合物能提高HGF基因在体外培养的HSC-T6细胞中的转染情况,促进HSC-T6凋亡,为基因治疗肝纤维化提供实验依据。     

慢性乙型病毒性肝炎抗病毒治疗的新认识

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者抗病毒治疗的目的是通过持续地抑制病毒复制,预防肝硬化、终末期肝病、原发性肝癌以及死亡,从而改善患者的生活质量,提高生存率。徘徊在免疫清除期的HBeAg阳性CHB患者、血清HBVDNA和ALT水平升高的HBeAg阴性CHB患者和肝硬化患者需要立即治疗。选择抗病毒药物时要综合考虑患者的临床特点、药物的抗病毒效率、出现耐药的风险、长期治疗的安全性、药物的价格和给药方式。核苷（酸）类似物类药物的长期治疗要关注选择性耐药突变问题。