酵母双杂交系统：探寻与内皮素受体相互作用的蛋白质

酵母双杂交系统：探寻与内皮素受体相互作用的蛋白质文立民张兆山黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１内皮素是近年来新发现的一种血管活性多肽。它是迄今所知体内最强烈、最持久的血管收缩因子，不仅可促进血管收缩，而且可刺激心血管系统的细胞增生及肥...     

内皮素A受体在颅脑创伤的脑微血管内皮细胞上的表达及意义

了解内皮素Ａ受体在颅脑创伤后脑微血管内皮细胞中的作用。方法对家兔致克额顶为着力部位的撞击伤，动态研究脑组织呐皮素含量及内皮素Ａ受体ｍＲＮＡ表达和定位变化，内皮素Ａ受体拮抗剂ＢＱ１２３治疗效应，观察对脑创伤后局部脑血流量和脑不量的影响。     

吸入内皮素A受体阻滞剂对实验性急性肺损伤的影响

目的观察吸入内皮素A(ETA)受体阻滞剂对急性肺损伤(ALI)动物模型肺氧合功能及肺炎性变化的影响。方法选择16只ALI模型犬,随机分为实验组(L组)和对照组(C组),每组8只。分别于肺灌洗前(T0)、灌洗后即刻(T1)、灌洗后1h合并雾化治疗30min(T2)、灌洗后2h(T3)、灌洗后3h(T4)、灌洗后4h(T5)监测两组血流动力学指标、血气和血浆内皮素-1(ET-1)水平。取肺组织观察肺炎性变化。结果两组心率(HR)、平均动脉压(MAP)和心输出量(CO)在各时点均无显著性差异(P>0.05);两组CO均于T2、T3、T4和T5时降低(P<0.05);L组T3、T4、T5时段平均肺动脉压(MPAP)明显低于C组(P<0.01);与C组比较,L组动脉氧分压(PaO2)、动脉氧饱和度(SaO2)、混合静脉血氧饱和度(SvO2)于T2、T3、T4、T5时点显著升高(P<0.01);动脉二氧化碳分压(PaCO2)和肺分流值(Qs/Qt)于T4、T5时点明显降低(P<0.01)。与T0比较,两组ET-1水平在ALI后均升高,L组ET-1水平在T2、T3、T4、T5时段低于C组(P<0.05)。两组均有肺损伤改变,L组肺间质炎和肺间质出血度低于C组(P<0.05)。结论吸入低剂量ETA受体阻滞剂能改善ALI的氧合和换气功能,减轻炎性改变。     

内皮素A型受体胞内区cDNA的克隆及序列分析

内皮素Ａ型受体胞内区ｃＤＮＡ的克隆及序列分析研究简报文立民张兆山李淑琴黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１内皮素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）是一种血管活性多肽，它是迄今所知体内最强烈、最持久的血管收缩因子，它不仅可促进血管收缩，而且可刺激心...     

内皮素受体拮抗剂的药理学与临床研究进展

1988年发现了内皮素（Endothelin,ET),ET有3种形式的异型体,分别称为ET－1,ET－2和E－3,ET经内皮素转换酶,ECEs)作用而激活,激活的ET与其受体结合而发挥作用,ET受体分为ETA和ETB受体,ETB受体又分为ETB1和ETB2受体,ET1是至今发现的最强的缩血管物质,其缩血管作用是通过ETA和ETB2受体介导的,ETB1受体介导血管舒张作用,内皮素受体拮抗剂有BQ123为代表的肽类分子,在体内代谢快,口服生物利用度低,限制了它们的临床应用。因此,非肽类ET受体拮抗剂取得了重要进展,包括磺酰胺类,羟丁内酯类,芳基茚羧酸类与其它结构类,这一类药物有可能成为心血管系统（包括慢性心衰,心率失常,心室重构,高血压,脑溢血及蛛网膜下腔出血）重要药物,对肾脏,肺,肝脏疾病及外伤,烧伤等也可能产生良好的作用,ETA／B非选择性受体拮抗剂是否比选择性ETA受体拮抗剂更优越,尚有争论。选择性ETA／B2受体拮抗剂可能更为理想,国内对该类药物的药理与临床应用研究也取得了重要进展。     

内皮素-1对肺组织成纤维细胞上内皮素受体基因表达的影响

 目的 探讨肺组织成纤维细胞中内皮素-1对内皮素受体A-mRNA的表达的影响.方法 用内皮素-1刺激培养的肺组织成纤维细胞,利用反转录PER的方法测定其受体A-raRNA的表达.结果 发现ET-1刺激后出现受体表达下调现象.结论 此现象可能是机体本身自我调节的代偿机制.     

酵母双杂交技术研究与内皮抑制素相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术研究与内皮抑制素(endostatin)发生相互作用的蛋白，有助于阐明其本身抑制血管生成作用的分子机制。方法：应用酵母双杂交系统3，以内皮抑制素为诱饵，筛选人肝cDNA文库，寻找能与之相互作用的蛋白。利用生物信息学技术，一对一酵母回复性杂交，β-GAL实验等提供的信息，筛除假阳性克隆。结果与结论：经过酵母双杂交共获得281个克隆，经过验证，有6个阳性克隆，这些蛋白基因有可能与内皮抑制素的作用过程有关。     

应用酵母双杂交筛选与hSOX4相互作用的蛋白质

目的：寻找与hSOX4相互作用的蛋白质，为该基因的功能研究提供新的线索。方法：采用酵母双杂交方法，以hSOX4的第1～133位氨基酸SOX4（1-133）和第130-380位氨基酸SOX4（130-380）分别作为诱饵筛选人乳腺文库，经过重复验证排除假阳性以确定阳性克隆。结果：以SOX4（1-133）作为诱饵最终筛出了4个阳性克隆，经测序及生物信息学分析，这4个克隆为同一基因来源：UBE2I（ubiquitin-conjugating enzyme E2I，Ubc9）。以SOx4（130-380）为诱饵未能筛出阳性克隆。结论：Ubc9能与SOX4（1-133）发生相互作用，它们的相互作用可能与SOX4的转录调控有关。     

内毒素血症时肝组织中内皮素A型受体基因定位和转录表达

内毒素血症时肝组织中内皮素Ａ型受体基因定位和转录表达刘宝华陈惠孙王代科胡德耀周继红文亚渊内皮素（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｓ，ＥＴｓ）具有强烈而持久的缩血管效应．ＥＴｓ只有与靶细胞上的内皮素受体结合，方可实现其生物学效应［１］．内皮素Ａ型受体（ｅｎｄｏｔｈ...     

应用酵母双杂交研究G-CSF受体胞内区结合蛋白

目的：探寻与G-CSF受体胞内区相互作用的下游蛋白因子，揭示G-CSF受体信号转导通路的可能机制。方法：采用敏感性较高的酵母双杂交体系，筛选小鼠胎肝文库，并通过体内双杂交实验进行验证。结果：获得了11种阳性基因片段，对其中铁蛋白重链片段在体内验证了相互作用。结论：提示在小鼠胎肝中G-CSF受体作为胞内信号转导的起始点，与众多胞浆内蛋白因子相结合，对于揭示G-CSF受体信号转导可能存在的各种通路起到重要的提示作用。     

应用相互作用陷阱发现蛋白质

相互作用陷阱双称两个杂交系统，是寻找与某种已知蛋白相互作用的蛋白的新型遗传学方法。综述了该方法的基本原理、步骤及应用前景。     

芥子气中毒早期肝组织ET-1及ETAR转录表达的研究

目的：探讨芥子气中毒早期肝组织内皮素-1(ET-1)、内皮素A型受体(ETAR)的变化和意义。方法：应用免疫组化及RT-PCR技术，观测大鼠芥子气中毒后肝组织ET的含量及ET-1，ETAR mRNA水平的变化，以及该变化与肝组织损伤的关系。结果：中毒后肝组织ET的含量先下降后增加，12h达峰值；中毒后肝prepro ET-1 mRNA的表达在2-6h低于对照组，12h增加达峰值；ETAR mRNA的表达没有明显的变化。结论：ET-1及其受体ETAR在芥子气中毒后肝的病理生理过程中可能起着重要作用。     

分化抑制因子ID1''基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测

目的：构建酵母双杂交用分化抑制因子IDl’基因的诱饵载体，并检测其自激活作用。方法：PCR扩增ID1’，基因全长，酶切后与诱饵载体pHybLex/Zeo连接形成重组诱饵载体，电穿孔方法转化到酵母细胞EGY48中，β—半乳搪昔酶滤膜分析检测重组诱饵载体对报告基因LacZ的自激活情况。结果：扩增出IDl’基因全长，成功构建了重组诱饵载体pHybLex/Zeo—IDl’，经酶切和测序鉴定正确；重组诱饵载体无自发激活报告基因功能。结论：重组诱饵载体构建成功，对报告基因无自激活作用，为下一步cDNA文库筛选莫定了基础。     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因

目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列。结论筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础。     

运用酵母双杂交系统筛选与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白

目的 运用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选出与埃博拉病毒(EBOV)GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在EBOV传染病中的生物学功能.方法 利用重组PCR技术构建诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,将诱饵菌株与人肝cDNA文库菌株进行杂交筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析,然后再利用酵母回复性实验进一步验证,排除假阳性结果.结果 成功构建了诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,筛选出6个可能与GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白,分别是COMMD1、ALB、PSMD8、APOA2、CYP2E1、HP.酵母回复性实验进一步说明了COMMD1和APOA2与NP蛋白可能存在相互作用.结论 酵母双杂交筛选出多个可能与EBOV的GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的捕获蛋白,为研究EBOV的致病机制提供了参考.     

HLH缺失型Id2候选相互作用蛋白

目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白.方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建 BD∶ Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的ds cDNA文库;采用共转化方法进行Id2-DBM-δHLH相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,采用PCR方法扩增阳性克隆中的AD∶ cDNA序列并测序;将获得的AD∶ cDNA质粒分别与BD∶ Id2-DBM-δHLH诱饵质粒共转化酵母进行配对验证.结果:酵母双杂交方法共筛选到19个阳性克隆,PCR方法在这19个克隆中共扩增到28条片段,序列测定证实含18个不同的基因,对其中的13个进行配对验证后证实了其中8个与HLH缺失型Id2相互作用,这8个基因分别是:UXT、VIM、KRT7、FHL2、SEI1、PCBP1、SIVA和LSM2.结论:本研究首次利用HLH缺失型Id2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选识别了一族新的Id2相互作用蛋白,为进一步研究Id2的功能调控以及非HLH依赖的功能活性奠定基础.     

胸部开放伤海水浸泡致ALI犬体内SP-A、B的变化

目的探讨胸部开放伤后海水浸泡致急性肺损伤(ALI)肺表面活性蛋白A和B(SP-A、SP-B)的表达变化及机制。方法16只健康犬锐器致开放性气胸后随机均分为实验组(S组)和对照组(C组),每组8只。S组胸腔内灌注海水(35mg/kg)制备ALI动物模型,C组不注入海水。所有犬持续观察6h。采用ELISA法检测灌注前(0h)及灌注后2、4、6h的TNF-α、IL-8,肺组织及血清中SP-A、SP-B含量的变化。于灌注后6h测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A、SP-B的含量。实验结束后处死动物,留取肺组织块匀浆测定SP-A、SP-B含量,并行肺病理组织学检查,采用免疫组化染色观察SP-B在肺内的表达情况。结果S组海水灌注后4、6h时BALF及血清中IL-8、TNF-α均显著高于C组(P<0.05)。S组BALF及肺组织匀浆中SP-A、SP-B含量明显减低,血清中SP-A(灌注后4、6h)、SP-B(灌注后6h)含量增加(P<0.05),但C组SP-A、SP-B的改变不明显。S组肺内SP-B阳性的Ⅱ型肺泡上皮细胞数量较C组明显减少,SP-B蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论胸部开放伤后海水浸泡致ALI时肺...     

血管紧张素原基因M235T和血管紧张素受体1基因A1166C多态性与飞行员原发性高血压的相关性

目的探讨血管紧张素原(AGT)基因M235T和血管紧张素受体1(AT1R)基因A1166C多态性与飞行员原发性高血压的相关性,为飞行员原发性高血压的预防提供依据。方法用聚合酶链反应(PCR)和限制性酶切检测48例飞行员原发性高血压患者和50例飞行员健康对照者的AGT M235T和AT1R A1166C多态性。结果飞行员高血压组AGT M235基因型和等位基因频率与健康对照组有明显差异,而AT1R A1166C两组间差异无统计学意义。结论 AGT M235T基因多态性与飞行员原发性高血压相关。