shRNA沉默Kir6.2基因表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建shRNA体内表达载体pGenesil-3-shRNA,研究抑制Kir6.2基因表达对HepG2细胞增殖和侵袭的影响. 方法 以Kir6.2基因为目的 基因,以产生shRNA质粒载体pGenesil-3为表达模板,细胞内转录合成2条shRNA.重组质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定和测序后,使用Lipofectamine 2000转染HepG2细胞.实验分为SK组(未转染)、SK-HK组(阴性对照),SK-K1(转染干扰序列1)组和SK-K2(转染干扰序列2)组.G418筛选出荧光单克隆进行培养.Westernblot检测Kir6.2蛋白在各组细胞中的表达.MTT法和Transwell系统分别检测各组细胞的增殖和侵袭能力. 结果 经酶切、测序鉴定,重组质粒符合设计要求.Western blot检测结果显示SK组,SK-HK组、SK-K1组和SK-K2组Kir6.2蛋白质相对表达量分别为0.9349±0.0443,0.9098±0.0195,0.2869±0.0295,0.3256±0.0341;和对照组相比,实验组Kir6.2蛋白减少.MTT法检测SK组、SK-HK组、SK-K1组、SK-K2组细胞的增殖分数分别为0.7523±0.0681,0.7351±0.0589,0.2494±0.0485,0.2261±0.0298,F=0.2401,P=0.000.Transwell实验结果显示,SK组、SK-HK组,SK-K1组、SK-K2组细胞的穿膜数分别为47.0±7.1,40.7±8.0,14.3±5.1,15.0±3.7,F=-30.74,P=0.000.和对照组相比,实验组HepG2细胞增殖和侵袭能力均明显降低.结论 抑制HepG2细胞Kir6.2基因的表达可降低HepG2细胞的增殖和侵袭能力.     

FAK基因靶向miRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建靶向黏着酶（FAK）基因的miRNA真核表达质粒,为其在胃癌相关研究中的应用奠定基础。方法设计合成两条针对FAK基因的特异性miRNA干扰序列,定向克隆到pcDNATM6．2-GW／EmGFP—miR真核表达载体上,经鉴定后转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR及Western—blot技术鉴定重组体对细胞FAK基因表达的干扰效果。结果针对FAK基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,转染BGC-823细胞后,细胞FAKmRNA及FAK蛋白表达均明显降低。结论针对FAK基因的miRNA真核表达质粒成功构建,该质粒可用于miRNA进行靶向FAK的相关研究。     

长链非编码RNA核仁小分子RNA宿主基因1对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨长链非编码(lnc)RNA核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)1在胃癌中的表达水平及其对胃癌细胞增殖和侵袭过程的影响。方法实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SNHG1在胃癌细胞SGC7901、BGC823和正常胃上皮细胞NGEC中的表达水平及采用SUHG1的小干扰RNA(si-SNHG1)干扰后SNHG1的表达水平;噻唑蓝(MTT)法检测沉默SNHG1对SGC7901、BGC823细胞增殖的影响,Transwell小室检测沉默SNHG1对SGC7901、BGC823细胞侵袭能力的影响。Western印迹法检测沉默SNHG1前后增殖标志物Ki67和侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9在SGC7901、BGC823中的表达变化。结果 SNHG1在胃癌细胞株中的表达显著高于正常胃上皮细胞株(P0.05);沉默SNHG1能显著抑制Ki67、MMP-2、MMP-9的表达。结论 lncRNA SNHG1在胃癌细胞中高表达,沉默SNHG1对胃癌细胞的增殖、侵袭起抑制作用,SNHG1可能成为治疗胃癌的一个有效靶点。     

miR-126-3p靶向AKT2对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的 探讨微小RNA-126-3p(miR-126-3p)对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测正常葡萄膜组织及葡萄膜黑色素瘤组织中miR-126-3p的表达。采用葡萄膜黑色素瘤MUM2B细胞作为研究对象,在细胞中分别转染miR-126-3p mimics及其阴性对照miR-NC、si-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)2及其阴性对照si-NC,分别记为miR-126-3p组、miR-NC组、si-AKT2组、si-NC组。甲基噻唑基四氮唑(MTT)、平板克隆形成实验检测增殖;Transwell小室实验检测迁移及侵袭;靶基因预测miR-126-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证靶基因,Western印迹检测AKT2蛋白表达。MUM2B细胞中共转染miR-126-3p mimics与AKT2过表达载体,用以上方法检测细胞增殖、迁移及侵袭能力。结果 与正常葡萄膜组织相比,miR-126-3p在葡萄膜黑色素瘤组织中表达水平显著降低(P<0.05);转染miR-126-3p mimics或si-AKT2后MUM2B细胞...     

干扰RNA靶向抑制埃兹蛋白对胃癌细胞增殖的影响

目的探讨埃兹蛋白(ezrin)对胃癌细胞生长和侵袭转移能力的影响。方法选取胃癌细胞系(AGS)作为研究材料,构建ezrin干扰载体,脂质体转染下调ezrin的表达,分别通过RT-PCR和Western blot法检测阻抑效应。以噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖。结果RT-PCR和Western blot结果显示,脂质体转染对ezrin mRNA和蛋白表达水平均有显著下调作用。下调ezrin蛋白后,AGS细胞的增殖受到显著抑制,与干扰前比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论ezrin在胃癌生长过程中发挥重要作用,有可能成为抑制胃癌发生发展的新靶点。     

靶向Midkine基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向midkine基因的siRNA 的表达载体,为研究midkine在肿瘤中作用提供一个新的方向.方法 根据基因库中midkine cDNA 序列设计和合成针对人midkine 基因的siRNA 寡核苷酸,定向克隆入质粒载体PGCsiU6,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA 测序.结果 酶切鉴定、DNA 测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变.结论 成功构建了靶向midkine 基因表达的siRNA 干扰质粒载体PGCsiU6/midkine,为进一步运用RNA干扰技术进行midkine 基因功能研究奠定了基础.     

蛋白激酶B短发夹环RNA表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的构建靶向蛋白激酶B基因的短发夹环RNA表达载体,观察其对血管平滑肌细胞增殖活性的影响。方法设计多个针对大鼠蛋白激酶B基因的短发夹环RNA序列,化学合成方法合成并经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLXIN,包装后获得蛋白激酶B的逆转录表达载体,感染血管平滑肌细胞,Northern blot和Western blot法检测蛋白激酶B及其下游底物的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法检测血管平滑肌细胞增殖活性的改变。结果成功构建蛋白激酶B基因的逆转录病毒载体并包装,感染血管平滑肌细胞,证实其能显著抑制蛋白激酶B的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染血管平滑肌细胞的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期。结论成功构建蛋白激酶B基因逆转录病毒RNA干扰表达载体,感染血管平滑肌细胞能够明显抑制其分裂、分化和增殖。     

FUT3-miRNA重组质粒对人胃癌KATO-III细胞增殖的影响

目的:研究利用miRNA干扰技术抑制FUT3基因表达对人胃癌KATO-Ⅲ细胞增殖的影响.方法:将前期实验构建成功的2对针对FUT3基因的特异性miRNA表达载体,用脂质体转染入人胃癌KATO-Ⅲ细胞,RT-PCR检测FUT3基因表达水平的变化;免疫细胞化学法、流式细胞术检测其合成抗原sLeA表达变化;MTT法、克隆形成实验检测FUT3基因的表达抑制对KATO-Ⅲ细胞增殖的影响.结果:转染FUT3-miRNA的2个干扰组FUT3基因mRNA相对表达量分别为0.41±0.01,0.36±0.02,明显低于对照组(0.71±0.05)和空载体组(0.65±0.03,P<0.05);细胞表面合成抗原sLeA的表达水平,FUT3-miRNA1组为35.51%±0.36%,FUT3-miRNA2组为26.05%±1.14%,明显低于对照组(52.79%±2.62%)与空载体组(49.75%±1.29%,P<0.05);与对照组(5.60%±0.63%)和空载体组(8.90%±0.91%)相比较,FUT3-miRNA1组(38.10%±1.96%)和FUT3-miRNA2组(49.04%±2.37%)能明显抑制细胞的增殖(P<0.05);细胞的克隆形成能力FUT3-miRNA1组(14.10%±1.70%)和FUT3-miRNA2组(12.50%±1.96%),显著低于对照组(29.79%±3.05%)和空载体组(28.92%±2.10%,P<0.05).结论:FUT3靶向miRNA真核表达载体可有效抑制胃癌细胞的增殖能力.     

靶向Akt2基因RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的 利用RNA干扰技术,以Akt2为靶基因,设计并构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法 利用GenBank中已知Akt2的mRNA基因序列设计具有短发夹结构的两条寡核甘酸序列,经退火形成互补双链,与pGEM-T Easy载体进行连接,经蓝白筛选后以T7和SP6为引物进行PCR鉴定,对表达载体pRNAT-U6.2及亚克隆产物进行双酶切,将得到的基因及线性化的表达载体再次连接,利用PCR方法进行重组体的筛选鉴定并进行测序分析.结果 将合成的DNA序列克隆到表达载体上,经PCR扩增筛选鉴定和测序鉴定证实为所需序列.结论 Akt2靶向RNA干扰重组表达载体构建成功.     

靶向载脂蛋白M基因小干扰RNA表达载体构建及其功能

目的设计和构建载脂蛋白M基因特异性的小干扰RNA体内表达载体,筛选抑制载脂蛋白M表达的有效小干扰RNA,并初步探讨载脂蛋白M的功能。方法以载脂蛋白M为目的基因,以产生小干扰RNA质粒载体pSilencerTM2.1-U6为表达模板,细胞内转录合成4条小干扰RNA,并构建携带荧光素酶报告基因的重组质粒载体plucF-载脂蛋白。将重组质粒载体plucF-载脂蛋白与产生小干扰RNA的质粒pSilencerTM2.1-U6共转染293T细胞,定量测量荧光素酶活性,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效小干扰RNA,然后将小干扰RNA转染L-02,逆转录聚合酶链反应检测载脂蛋白M mRNA的表达,进一步证实小干扰RNA对载脂蛋白M表达的抑制效果,酶联免疫吸附法检测有效小干扰RNA对载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白B和载脂蛋白E合成和分泌的影响。结果合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为86%和91%,并特异性抑制肝细胞载脂蛋白M mRNA的表达;有效小干扰RNA能够有效抑制载脂蛋白AⅠ合成和分泌(P<0.05),而载脂蛋白B和载脂蛋白E的含量无明显改变(P>0.05)。结论成功构建并筛选到针对载脂蛋白M基因表达的有效小干扰RNA质粒,为研究冠心病的发病机制奠定基础。     

生存素siRNA表达质粒对MGC-803细胞增殖的影响

目的:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,观察 RNA干扰沉默生存素基因对胃癌MGC-803细胞增殖的影响．方法:用脂质体介导将生存素siRNA表达质粒转染 MGC-803细胞,通过倒置显微镜观察转染后细胞形态学的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期的变化,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测生存素mRNA的表达水平．结果:生存素siRNA表达质粒转染组MGC-803细胞变圆、浮起,生存素siRNA表达质粒明显下调MGC-803 细胞内生存素mRNA的表达,与空白对照组相比降低了48．2％,阻断细胞周期在G1期(77．4％),显著抑制细胞增殖,siRNA转染组细胞吸光度比空白组显著降低 (24 h:0．272±0．048 vs 0．576±0．018;48 h:0．270±0．060 vs 0．809±0．027;72 h:0．143±0．046 vs 1．015±0．075;均 P<0．01)．转染24,48和72 h后的抑制率分别为53．4％, 66．7％和86.3％．结论:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,可有效下调生存素在MGC-803细胞中的表达,并在体外抑制细胞的增殖．     

RhoA、C干扰载体的构建及其对直肠癌HCT116细胞相应基因表达的影响

目的 构建RhoA和RhoC干扰载体,观察其对结直肠癌细胞内RhoA和RhoC基因表达的抑制作用.方法 设计合成针对人RhoA和RhoC基因序列的各4对含有小发夹结构的寡核苷酸序列,将其连入pGensil-1质粒中,构建特异性shRNA表达载体并转染结直肠癌细胞HCT116.应用荧光定量PCR法检测HCT116细胞中的RhoA和RhoC mRNA.结果 成功构建了特异性shRNA表达载体,将其转染HCT116细胞后,细胞内RhoA和RhoC mRNA的表达水平与未转染组相比,P＜0.05.结论 构建的RhoA和RhoC shRNA干扰载体能有效抑制HCT116细胞的RhoA mRNA和RhoC mRNA表达.     

小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因1对肝癌细胞增殖和凋亡水平的影响

肝癌是全世界范围的高发恶性肿瘤,在亚洲的发病率、病死率都很高。肝癌的分子学发病机制尚不完全清楚,包括基因结构和功能的缺陷、癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞周期紊乱、染色体的非整倍体出现以及细胞凋亡途径受阻等。垂体瘤转化基因(PTTG)1是细胞周期调节蛋白,能抑制姐妹染色单体分离,导致染色体不稳定,形成非整倍体。在成人大多数正常组织中PTTG1表达较弱,甚至检测不到,而在垂体肿瘤等多种肿瘤细胞中表达明显升高,PTTG1基因可能是一种潜在的抗癌基因治疗靶点[1]。本研究用小干扰RNA (siRNA)降低肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721细胞中PTTG1的表达,检测PTTG1表达下调对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,探讨PTTG1对肝癌细胞生物学行为的影响以及作为肝癌治疗靶基因的可能性。     

胃癌细胞增殖相关基因研究进展

恶性肿瘤治疗困难和预后不良的主要原因,就在于其易复发转移,而恶性肿瘤细胞转移扩散与其细胞增殖活性密切相关.因此抑制肿瘤细胞的恶性增殖,是治疗恶性肿瘤的关键所在.本文着重阐述了与胃癌细胞增殖过程密切相关的端粒酶、核转录因子、环氧化酶等基因以及参与细胞周期调控的原癌基因、抑癌基因的异常表达及临床意义,这些基因或单独作用,或相互协同,参与胃癌细胞的增殖,使肿瘤细胞生长以增殖过多、凋亡过少的失控性生长为特征.     

胰腺癌CFPAC1细胞增殖诱导配体基因shRNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的shRNA慢病毒表达载体.方法 应用基因工程技术,筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列,与pGCL-GFP载体连接,构建慢病毒表达载体LV-shAPRIL;将连接产物转化到DHSα感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.再用LV-shAPRIL、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.重组慢病毒感染CFPAC1细胞,实时定量PCR和Western blotting检测CFPAC1细胞APRIL mRNA和蛋白的表达.结果 PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为5×107TU/ml.构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周,APRIL mRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73%、70%和71%;APRIL蛋白表达量分别下降了66%、63%和62%(P＜0.05).而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异(P＞0.05).结论 成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV-shAPRIL.     

吴茱萸碱对人胃癌SGC7901细胞增殖、侵袭的影响及机制探讨

目的观察吴茱萸碱对胃癌细胞增殖、侵袭的影响,并探讨其机制。方法采用不同浓度的吴茱萸碱处理人胃癌细胞SGC7901,用软琼脂集落培养试验检测癌细胞增殖情况,Boyden小室检测癌细胞侵袭能力;分别采用荧光实时定量RT-PCR法和Western blot法检测癌细胞中的中期因子（MK）mRNA及其蛋白。结果 SGC7901经吴茱萸碱处理后,恶性增殖和穿膜细胞数均明显下降,且呈剂量依赖性（P均〈0.05）;吴茱萸碱处理后,SGC7901的MK mRNA及蛋白表达均明显下调,且呈时间、浓度依赖性（P均〈0.01）。结论吴茱萸碱可明显抑制胃癌细胞的增殖及侵袭能力,其机制可能与下调MK基因表达有关。