绿色荧光蛋白-CCNG2表达载体的构建及鉴定

目的为进一步探讨细胞周期蛋白G2（CCNG2）基因功能奠定基础。方法以成人脑cDNA文库为模板,PCR扩增人CCNG2基因,In-Fusion技术定向克隆到pENTR1A中,酶切测序鉴定后重组到pcDNA6.2TM/EmG-FP-DEST Gateway载体,构建pcDNA6.2-EmGFP-G2。将鉴定正确的质粒瞬时转染人舌鳞癌细胞Tca-8113,24 h后观察,定量PCR检测CCNG2 mRNA表达。结果扩增得到1 032 bp的基因片段,经测序验证与GenBank中人CCNG2序列相符;pcDNA6.2-EmGFP-G2经酶切和测序鉴定无误。转染Tca-8113后,荧光信号除在胞质中表达外,在部分细胞的胞核DAPI染色弱信号区浓聚。转染该重组质粒后CCNG2 mRNA表达水平显著增高。结论成功构建了以绿色荧光蛋白作为报告基因的CCNG2表达载体,为进一步研究CCNG2基因功能奠定了基础。     

蛴螬提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制探讨

目的 观察蛴螬提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制。方法 采用MTT法检测蛴螬提取物处理过的人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制率,用免疫组化SP法检测用药前后增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki-67、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达改变,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果 用蛴螬提取物处理后的MCF-7细胞生长抑制率明显高于对照组,这种抑制作用呈浓度和时间依赖性;MCF-7细胞经蛴螬提取物处理后Ki-67、PCNA、CyclinD1表达均下降,且随着蛴螬提取物作用时间的延长,S期细胞比例明显升高。结论 蛴螬提取物在体外对人乳腺癌MCF-7细胞株有显著的增殖抑制作用,其机制可能与下调CyclinD1、Ki-67、PCNA的表达有关。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

目的 构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体，为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率，增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法 通过两次PCR，以pcDNA-VP3质粒为模板．扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3。将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点，构建重组凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3，将该重组表达载体分别以限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切鉴定，进一步将初步鉴定显示插入目的基因的质粒进行测序鉴定。结果 测序结果表明，本研究合成的凋亡素基因与Notebom报告的凋亡素基因序列一致，同源性为100％。在其起始密码子前添加了Kozak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE。结论 采用两次PCR法可将提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端，并构建成凋亡素真核表达载体。     

hSp17真核表达载体构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的构建人精子蛋白17（hSp17）基因的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hSp17,为其临床应用奠定基础。方法用PCR方法获取hSp17基因片段,NheⅠ、KpnⅠ双酶切、粘端连接的方法构建含有hSp17基因的pcD-NA3.1（＋）/hSp17真核表达载体。将该载体行脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,免疫细胞化学方法检测转染细胞hSp17蛋白表达,G418筛选稳定表达hSp17蛋白的细胞株。结果酶切和测序结果均证实pcDNA3.1（＋）/hSp17重组质粒的构建完全正确。免疫细胞化学方法证实外源性hSp17基因能够在卵巢癌HO8910细胞瞬时表达。经G418连续筛选,得到阳性克隆细胞株,并证实了外源性hSp17基因在卵巢癌HO8910细胞中稳定表达。结论成功构建了稳定表达外源性hSp17蛋白的卵巢癌细胞株;其可为卵巢癌的免疫治疗奠定基础。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的　构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。　方法　据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。　结果　成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。　结论　获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。     

人硫氧还蛋白基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)cDNA序列,进行真核表达载体的构建.方法 应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中,经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定;利用阳性脂质体Lipofectamine将其转入COS-7细胞(瞬时表达细胞),RT-PCR检测其表达情况.结果 将所得序列与GenBank(J04026)提供的序列比较,其酶活性中心(Trp-Cys-Gly-Pro-Cya)和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确;COS-7细胞中有hTRX的表达.结论 成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,并在COS-7细胞中得到了表达,为进一步探讨hTRX的生物活性和应用奠定了基础.     

P21真核表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖的影响

目的:构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其功能.方法:采用基因定点诱变技术获得核定位信号突变型P21基因.采用DNA重组技术,将突变型P21基因亚克隆至pDsRed1-C1真核表达质粒中,重组为pDsRed1-C1-P21NLS-.酶切鉴定及DNA测序,脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-P21NLS-的表达,荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位,台盼蓝拒染法检测质粒转染HepG2细胞生长曲线.结果:成功克隆了核定位信号野生型及突变型P21基因,成功构建TpDsRed1-C1-P21WT及pDsRed1-C1-P21NLS-重组质粒,酶切片段分别为4.7和0.5 kb,酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸序列数据库比对表明,核定位序列中共9个核苷酸发生变异,由CGAAAACGG突变为GCGGCCGCG,测序成功.高效表达的红色融合蛋白,野生型主要定位于细胞核:而突变型主要定位于细胞质.野生型P21抑制HepG2细胞的生长;突变型促进HepG2细胞的生长,二者差异具有统计学意义(P<0.01).结论:P21的亚细胞定位,对HepG2细胞增殖影响具有明显差异.胞核P21抑制肿瘤生长,而胞质P21促进肿瘤生长.     

乳腺癌组织中Cks1的表达及其对乳腺癌细胞凋亡的抑制作用

目的观察Cks1在乳腺癌组织中的表达,探讨其意义。方法采用免疫组化SP法检测100例乳腺癌组织中的Cks1;同时用RNA干扰敲降Cks1表达,观察其对乳腺癌细胞凋亡的影响。结果乳腺癌组织中Cks1阳性率为59％,与淋巴结转移和临床分期有关（P〈0．05）;敲降Cks1表达可显著增加乳腺癌细胞的凋亡。结论Cks1表达可促进乳腺癌发生发展,与其抑制细胞凋亡有关。     

hPOT1基因正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人端粒保护蛋白（human protection of telomeres，hPOT1）基因的正、反义真核表达载体，以进一步研究hPOT1蛋白的功能及作用机制。方法用限制性内切酶将hPOT1 cDNA从pLPCNMyc POT1质粒上切下来，经适当改造后以正、反方向插入到质粒pcDNA3．1（-）中，构建hPOT1基因的正、反义真核表达载体；用PCR、酶切及DNA测序的方法鉴定hPOTI基因正、反义表达载体序列和方向的正确性。结果PCR、酶谱分析及DNA测序结果表明hPOT1正，反义真核表达载体序列和方向正确。结论成功地构建了hPOT1正、反义真核表达载体，为进一步研究hPOT1在端粒保护，细胞衰老和凋亡中的作用奠定了基础。     

人Dact2基因真核表达载体的构建及其在结肠癌细胞中的表达

目的构建人Dact2基因真核表达载体。方法以人胎肝cDNA文库为模板,利用RT—PcR方法获得Dact2编码序列,构建并鉴定表达Dact2的pcMV6-Entry—GFP真核表达载体。Lipofectamine 2000转染结肠癌细胞株HT29,荧光显微镜和流式细胞仪观察和分析转染效率,westernblot检测Dact2蛋白表达。结果通过PcR扩增获得了2322bp的Dac￡2编码序列,通过酶切及测序证实Dact2序列正确插入真核表达载体pcMV6-Entry—GFP;转染空载体和Dact2表达质粒48h后,荧光显微镜下观察,可见两组细胞均表达绿色荧光蛋白,流式细胞仪分析结果显示瞬时转染效率分别为41．36％和39．88％。Western blot检测证实转染表达质粒组的细胞Dact2蛋白呈阳性表达。结论成功构建了人Dact2真核表达载体,为其功能研究奠定了基础。     

沙苑子黄酮对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响及作用机制

目的 探讨沙苑子黄酮（FAC）对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法取对数生长期MCF-7细胞,调整浓度为2×10^5／ml,接种于96孔板中,分为三组,实验组加入FAC使终质量浓度分别为0．500、0．250、0．125、0．063mg／ml,阴性对照组加入等体积培养基,阳性对照组加入5-Fu10μg/ml,每组设3个复孔,分别培养12、24、48、72h。MTT法检测各组各时点细胞增殖抑制率,流式细胞术测定细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中Bcl-2、AIF表达情况。结果FAC作用后MCF-7细胞抑制率及凋亡率明显升高,Bcl-2表达阳性率降低、AIF表达阳性率升高,且呈时间及剂量依赖性,与阳性对照组比较无显著差异。结论FAC对MCF-7具有增殖抑制和凋亡诱导作用,其机制可能为下调Bcl-2表达、上调AIF表达。     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的 构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达.方法 根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆.对经PCR、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的 片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证.脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT-PCR验证该基因的表达.结果 PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT-PCR的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达.结论 成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备.     

原白头翁素衍生物对人乳腺癌MCF-7细胞的抗增殖与诱导凋亡作用

目的探讨原白头翁素衍生物（溴甲基呋喃酮）体外对乳腺癌MCF-7细胞株的抗增殖及诱导凋亡作用。方法应用MTT法、倒置显微镜、HE染色、扫描电镜技术、吖啶橙/溴化乙锭荧光染色方法以及流式细胞技术检测原白头翁素衍生物对体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞的诱导凋亡及细胞形态学改变。结果MTT法示不同浓度原白头翁素衍生物对MCF-7细胞株均有抗增殖作用,并呈时间—浓度依赖性。倒置显微镜、HE染色、扫描电镜观察示核固缩、碎裂、凋亡小体形成等典型形态学改变。AO/EB双染色结果显示细胞死亡主要以凋亡为主。流式细胞示随着药物浓度的增加细胞凋亡率亦逐渐升高,S期细胞所占比例增大。结论原白头翁素衍生物在体外对人MCF-7乳腺癌细胞株有抗增殖及诱导凋亡作用。     

MTS1真核表达载体的构建和鉴定

多肿瘤抑制基因(MTS1)表达产物P16蛋白作为细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)的抑制物,使Rb蛋白磷酸化受阻,细胞不能由G1期进入S期,进而抑制细胞分裂增殖.为进一步开展消化道肿瘤防治研究,我们构建了MTS1真核表达载体,现报告如下.     

肝细胞生长因子受体靶向shRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定人肝细胞生长因子受体（cMet）的shRNA的真核表达载体。方法：人工合成针对cMet的4对shRNA序列并定向克隆到siRNA（small interference RNA）真核表达载体RNAi-Ready pSIREN-DNA-DsRed-Express Vector上；采用双酶切和测序法鉴定。结果：酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。结论：成功构建肝细胞生长因子受体靶向shRNA的真核表达载体。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体并分析插入的M2基因序列。方法从接种人流感病毒株A／PR／8／34（H1N1）的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用特异引物进行RT-PCR，扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段克隆入真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）。经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的M2基因序列进行分析。结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。序列分析有4个氨基酸出现变异，提交Genbank进行Blast比对显示同源性97％（Genbank／NCBI AY768951）。结论M2四聚体蛋白具有H^＋通道功能，能够协助病毒与宿主细胞膜融合后释放RNP复合体，还能稳定HA蛋白的结构。M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口。该结果将为甲型流感病毒基因工程疫苗，通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

靶向LIMK1的siRNA真核表达载体（pSUPER-LIMK1）的构建、鉴定及在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达

目的 构建靶向人LIMK1的siRNA 真核表达载体(pSUPER-LIMK1)并检测其在人成骨肉瘤MG63细胞中进行表达.方法 将设计的LIMK1的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-LIMK1真核表达载体,并将其转染入MG63细胞株中.采用RT-PCR检测pSUPER-LIMK1质粒转染后LIMK1在人成骨肉瘤中的基因表达,Western blot检测LIMK1蛋白的表达.结果 构建的真核表达载体pSUPER-LIMK1可在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达.结论 构建的人LIMK1-siRNA蛋白的真核表达载体pSUPER-LIMK1,为进一步骨肉瘤基因靶向治疗的研究奠定了基础.     

PTEN对乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞凋亡的促进作用及机制

目的观察野生型PTEN基因促进乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR凋亡的作用并探讨其机制。方法采用脂质体介导法将真核表达载体pEGFP-C1-PTEN及突变载体pEGFP-C1-PTEN-C124S转染人乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞。MTT法观察细胞对阿霉素的敏感性和耐药倍数,流式细胞技术检测细胞凋亡率,Western blot检测Bcl-2和Caspase-3蛋白。结果转染组的凋亡率为36.86%,高于对照组（3.75%）和C124S组（4.00%）（P均〈0.05）。转染组对阿霉素的耐药倍数显著降低（t=4.77,P〈0.05）,其半数致死剂量IC50值为对照组的26.1%。转染后细胞内Bcl-2表达降低,且检测到Caspase-3活性裂解片段。结论PTEN基因可能通过下调Bcl-2表达及活化Caspase-3来促进乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞凋亡,增加其对阿霉素的药敏性。     

乳腺癌患者血清Cyclin D1表达变化及意义

用ELISA法检测43例乳腺癌、12例良性乳腺肿瘤患者及12位健康成年女性查体者血清中Cyclin D1的水平。结果乳腺癌患者血清Cyclin D1水平明显高于良性乳腺肿瘤患者及健康查体者（P〈0.05）,且术前明显高于术后（P〈0.05）,临床分期Ⅱ期以上及发生淋巴结转移患者的血清Cyclin D1水平均明显升高（P〈0.05）。认为患者血清Cyclin D1水平可作为评价乳腺癌预后的指标。