蛋白激酶SGK3基因的克隆及其在乳腺癌细胞中的表达

目的探讨通过克隆蛋白激酶(SGK)3基因并将其转染乳腺癌MCF-7细胞建立高表达SGK3的MCF-7细胞系的稳态性。方法利用真核表达载体N-端增强型绿色荧光蛋白(p EGFP-N1)通过基因克隆技术构建重组质粒,通过菌落PCR和DNA测序方法对重组质粒进行鉴定。通过PEI介导将重组质粒p EGFP-N1-SGK3转染至乳腺癌MCF-7细胞中,荧光显微镜和Western印迹方法对基因转染效率以及融合蛋白GFP-SGK3的表达进行鉴定。结果成功构建了真核表达质粒,将其命名为p EGFP-N1-SGK3;在荧光显微镜下可见多数细胞发出绿色荧光,表明获得了较高的转染效率;Western印迹结果显示,在转染p EGFP-N1-SGK3的细胞中可见阳性条带,而MCF-7亲本细胞和转染空载体的对照组细胞无阳性条带。结论成功构建了重组质粒p EGFP-N1-SGK3,获得了稳定表达融合蛋白GFP-SGK3的MCF-7细胞系,可用于后续SGK3细胞内功能的研究。     

X射线对转染Smac基因重组质粒的MCF-7细胞表达及增殖和凋亡的影响

目的探讨Egr-1启动子介导Smac基因的重组质粒pshuttle-Egr1-hSmac的辐射诱导特性,以及联合X射线照射后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法将构建完全正确的pshuttle-Egr-1-hSmac质粒转染到人乳腺癌MCF-7细胞中,24h后给予X射线照射,24h后提取总RNA和蛋白,分别采用RT-PCR和Western印迹法检测细胞中SmacmRNA和蛋白的表达;分别采用MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡的变化。结果未照射组及转染和空载体pshuttle组未见SmacmRNA和蛋白表达;而转染pshuttle-Egr-1-hSmac的MCF-7细胞在0.5Gy照射后未见其mRNA和蛋白表达;1、2和5Gy照射后明显增高,尤其以5Gy表达最高;2Gy照射后4h未见表达,而8～48h则逐渐增加,尤其以48h最高。MTT结果显示,转染了pshutlle质粒后存活率稍有降低,而凋亡未见明显变化;转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒后细胞存活率未见明显降低,而凋亡百分率稍有增加(P0.05);经过2Gy照射后各组存活率降低,凋亡百分数明显增加(P0.05,P0.01),尤其以转染pshuttle-Egr-1-hSmac质粒更明显。结论X射线照射联合pshuttle-Egr1-hSmac能通过提高细胞内Smac的表达,并有效抑制MCF-7细胞增殖,促进细胞凋亡,提示Smac基因联合放射治疗可能成为肿瘤治疗的新策略。     

Survivin启动子驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的了解Survivin启动子在HepG2肝癌细胞与3T3细胞中诱导Trail蛋白表达能力的差异,并评价其驱动Trail诱导肝癌细胞凋亡的能力。方法以pGL3-surp340质粒为模板,扩增Survivin340启动子,构建重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail。将重组质粒分别转染HepG2肝癌细胞和3T3细胞,通过Western Blot检测两种细胞中Trail蛋白表达的差异。利用流式细胞术检测HepG2肝癌细胞及3T3细胞转染重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail后细胞凋亡的情况。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail,转染HepG2和3T3两种细胞后,通过Western Blot检测,HepG2肝癌细胞Trail蛋白表达的相对灰度值为0.49±0.43,较3T3细胞Trail蛋白表达(0.15±0.37)明显增强(P0.05)。利用流式细胞术检测,HepG2肝癌细胞转染重组质粒组的凋亡率(%)为11.59±0.74,空白质粒组为3.45±0.52,未转染组为2.67±0.34;3T3细胞重组质粒组的凋亡率(%)为3.26±0.24,空白质粒组3.16±0.15,未转染组2.83±0.27。HepG2细胞转染重组质粒组凋亡率明显高于其他对照组(P0.05)。结论含Survivin基因启动子的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail在肿瘤细胞中能增强Trail蛋白的表达,并能诱导HepG2肝癌细胞凋亡。     

人ZEB1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡的影响

目的：探讨ZEB1基因与肝癌的关系,进一步揭示ZEBl基因在肝癌发生发展过程中的作用。方法：利用基因重组技术构建pCI-neo-ZEB1真核表达载体：脂质体介导转染技术转染肝癌细胞系HepG2。采用WesternBlot技术检测重组质粒的转染效率,CCK8比色法测定重组质粒转染对HepG2细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后HepG2细胞凋亡率。结果：重组质粒经Nhel和Xbal双酶切、测序与ZEBl基因序列一致;利用脂质体介导将pCI-neo-ZEB1重组质粒转染HepG2细胞株,经WesternBlot技术检测ZEB1基因在蛋白水平稳定高表达;与对照组比较,人HepG2细胞株转染pCI-neo-ZEB1真核表达载体后细胞增殖能力增强,细胞凋亡率明显降低。结论：成功构建重组质粒Pci-neo-ZEB1并转入肝癌细胞株HepG2后,细胞增殖能力增强,凋亡减少。     

RNAi对人乳腺癌MCF-7细胞E2F1、TS基因表达的抑制作用

目的观察RNA干扰（RNAi）技术对乳腺癌细胞MCF-7中E2F1、胸苷酸合成酶（TS）基因表达的靶向抑制作用。方法设计合成并构建重组质粒pSIREN-E2F1，将重组质粒转染MCF-7细胞。筛选稳定转染的单克隆细胞扩大培养，应用RT-PCR方法检测各组细胞E2F1、TS mRNA表达情况。结果转染组E2F1、TS基因表达均受到抑制：结论RNAi技术特异、高效抑制靶基因E2F1及TS表达。     

siRNA逆转乳腺癌细胞MDR1及MDR3介导阿霉素耐药的研究

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)对多药耐药基因MDR1及MDR3介导的乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐阿霉素的逆转作用。方法pSuppressorNeoABCB1(针对MDR1的siRNA)及ABCB4(针对MDR3的siRNA)质粒转染MCF-7/ADR及MCF-7细胞(乳腺癌亲本细胞株),流式细胞术检测细胞凋亡,MTT检测MCF-7/ADR细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50),RT-PCR检测MDR1及MDR3mRNA的表达。结果转染pSup-pressorNeoABCB1的MCF-7/ADR细胞凋亡率(18.21%±1.65%)高于转染pSuppressorNeoABCB4的细胞凋亡率(9.07%±2.17%),P<0.05;二者与转染空载体组的细胞凋亡率(0.2%±0.36%)相比,P均<0.01;pSuppressorNeoABCB1质粒对阿霉素的相对逆转效应高于pSuppressorNeoABCB4质粒(P<0.05);两个质粒转染组的MDR1和MDR3mRNA表达均受到明显抑制(P均<0.01)。结论针对MDR1及MDR3基因的siR-NA可逆转乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性。     

原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．     

WWOX 基因转染对卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及其机制探讨

目的：探讨外源性WWOX基因转染对人卵巢癌干细胞增殖的抑制作用及机制。方法用脂质体介导的方法将pcDNA3．1-WWOX真核表达载体转染人卵巢癌干细胞,分为pcDNA3．1-WWOX重组质粒组、空质粒组及未转染组。应用G418筛选阳性细胞克隆并扩增,Western blot法检测各组细胞WWOX蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞DNA周期变化,Western blot方法检测各组细胞Cyclin D1、CDK4蛋白的表达。结果重组质粒组WWOX蛋白高表达,空质粒组及未转染组细胞未检测到WWOX蛋白的表达。重组质粒组细胞的G0/G1期细胞比例高于空质粒组及未转染组（P＜0．01）,S期比例低于空质粒组及未转染组（P＜0．01）。重组质粒组Cyclin D1、CDK4表达均低于空质粒组及未转染组（P＜0．05）。结论 WWOX基因转染可能通过下调Cyclin D1、CDK4的表达而抑制人卵巢癌干细胞增殖,可能为卵巢癌的生物治疗开辟新的思路。     

pEGFP-C1-反义生存素重组质粒的构建和转染

目的 构建pEGFP-C1-反义生存素（survivin)重组质粒，并转染入人MKN-45低分化胃腺癌细胞株，观察转染前后生存素基因的表达及对凋亡的影响。从基因水平探讨反义生存素核酸治疗胃癌的分子生物学机制。为今后利用反义基因治疗肿瘤提供实验和理论依据。方法 应用基因重组技术构建 pEGFP-C1-反义生存素重组质粒，通过脂质体转染法转染人MKN-45胃腺癌细胞株，以流式细胞仪方法检测细胞凋亡，以RT-PCR技术检测质粒转染前后生存素基因mRNA的表达。结果 pEGFP-C1-反义生存素重组质粒转染MKN-45低分化胃腺癌细胞株后细胞凋亡明显增加，G2/M期细胞减少，同时生存素基因在mRNA水平被抑制。结论 反义生存素核酸能抑制细胞增殖。减少生存素基因的mRNA表达而促进胃癌细胞凋亡。     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

HCV NS2对细胞凋亡及DNA损伤应答信号的影响

目的构建HCV NS2的真核表达质粒,了解HCV NS2蛋白对细胞凋亡及DNA损伤应答信号的影响。方法以pCMV-tag2B为载体,采用双酶切法构建HCV NS2基因重组载体pCMV-tag2B-NS2,进行酶切分析和DNA测序鉴定;在Huh7细胞中转染相应质粒,分别采用Western blot和DAPI染色分析CPT处理或未处理时NS2对DNA损伤应答信号和凋亡的影响,采用流式细胞术检测NS2蛋白对细胞周期的影响。结果酶切和DNA测序证实pCMVtag2B-NS2重组质粒构建成功,HCV NS2蛋白可在Huh7细胞中正确表达并且活化DNA损伤应答信号,但不影响细胞周期进程;DAPI染色检查,NS2转染组和空载体转染组细胞凋亡率分别为(15.33±0.88)%和(4.66±0.88)%,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建了真核表达载体pCMV-tag2B-NS2,其表达产物HCV NS2蛋白可诱导DNA损伤应答通路的活化并且促进Huh7细胞凋亡。     

人CCR7基因真核表达载体构建及表达

目的构建人CCR7基因真核表达质粒，使其在真核细胞中稳定表达，为其临床应用奠定基础。方法以RT—PCR法从临床肺腺癌标本中扩增出CCR7编码区序列，定向克隆至载体pEGFP—N1中构建质粒pEGFP—CCR7，采用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒DNA导人肺腺癌A549细胞中，加入G418对细胞进行筛选获得稳定表达CCR7的细胞，并用流式细胞仪对重组质粒的表达进行鉴定。结果PCR、酶切及测序结果证明重组质粒pEGFP—CCR7构建正确，荧光显微镜及流式细胞术在稳定转染A549细胞中检测到人CCR7的表达。结论人CCR7基因真核表达质粒已成功构建并稳定转染肺癌A549细胞株；本研究为临床应用提供了实验依据。     

RKIP过表达对儿童白血病CCRF-CEM细胞系凋亡的影响

目的观察Raf激酶抑制蛋白（RKIP）对儿童白血病细胞系CCRF-CEM凋亡的影响。方法以RT-PCR方法从HepG2细胞总RNA中克隆RKIP基因CDS区,并亚克隆至pCDNA3.0质粒,构建RKIP重组质粒载体pCD-NA3.0-RKIP,以电穿孔法转染pCDNA3.0-RKIP与对照质粒pCDNA3.0至儿童白血病细胞系CCRF-CEM,建立过表达RKIP的细胞系。Western blot法检测转染48 h后细胞RKIP与磷酸化ERK的表达水平。转染72 h后,用Annex-in-V与PI双标、流式细胞仪检测细胞凋亡比例。结果成功构建携带RKIP的重组质粒载体pCDNA3.0-RKIP,通过电穿孔转染,在CCRF-CEM细胞成功高表达。与对照细胞相比,RKIP过表达CCRF-CEM细胞磷酸化ERK水平降低,凋亡比例显著增高（P〈0.01）。结论 RKIP过表达诱导CCRF-CEM细胞凋亡,可能机制是通过抑制Ras-ERK信号通路。     

血清糖皮质激素调节蛋白激酶3过表达对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨血清糖皮质激素调节蛋白激酶3(SGK3)基因过表达对乳腺癌细胞凋亡的影响。方法构建pEGFP-N1-SGK3重组质粒,用载体质粒pEGFP-N1和重组质粒pEGFP-N1-SGK3转染乳腺癌MCF7细胞;MTT法观察转染细胞的增殖情况,流式细胞术分析细胞凋亡情况,RT-PCR检测凋亡相关基因表达。结果利用pEGFP-N1-SGK3质粒转染乳腺癌MCF7细胞,建立表达SGK3蛋白的细胞系;通过细胞增殖实验发现,SGK3的过表达可促进MCF7细胞增殖;流式细胞术分析显示,外源性SGK3可抑制MCF7细胞凋亡的发生,并影响凋亡相关基因bad、bcl-xl的表达。结论 SGK3的过表达可抑制乳腺癌MCF7细胞凋亡。     

重组腺病毒对Hela、MCF-7的转染效率及其介导的hTRAIL基因体外抑瘤作用

目的 研究重组腺病毒感染宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MCF-7的转染效率,并观察重组腺病毒介导的人肿瘤坏死因子(TNF)相关诱导凋亡配体(hTRAIL)基因对Hela、MCF-7生长的影响.方法 将Hela和MCF-7细胞接种至12孔板,培育24 h后加入不同感染滴度的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP,用流式细胞仪检测其转染效率;将Hela细胞和MCF-7细胞接种至96孔板,24 h后转染重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL,72 h用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测肿瘤细胞的存活率.结果 Ad-CMV-EGFP对Hela和MCF-7细胞的转染效率在一定范围内随着感染复数(MOI)的增加而增高,转染 Ad-CMV-hTRAIL的Hela细胞的存活率明显低于转染Ad-CMV-EGFP的病毒对照组(P＜0.05).结论 腺病毒对Hela和MCF-7细胞均有较高的转染效率,且腺病毒介导的hTRAIL基因对Hela细胞具有明显的体外抗瘤作用.     

B和C基因型HBV核心蛋白促细胞凋亡的比较

目的:比较B,C两种基因型HBV核心蛋白在促进肝细胞凋亡方面的差异,以期初步阐述HBV基因型与临床关系的发病机制.方法:用PCR扩增4份(B和C基因型各2份)HBV-C区DNA片段,通过基因重组、分子克隆和亚克隆等方法,合成4份不同基因型和临床表型的重组真核表达质粒.鉴定后,将他们分别转染至肝癌细胞系HepG2中,采用MTT法和流式细胞仪测定转染细胞的细胞增殖率和细胞凋亡率等指标.结果:4份重组真核表达质粒均构建成功,转染至HepG2后通过内参照EGFP可鉴定出均有HBV-C蛋白表达.流式细胞仪提示C型/重型HBV转染组的细胞凋亡率显著高于B型/携带HBV转染组(8.8%±2.0%vs6.4%±0.8%,P<0.05).结论:C型HBV核心蛋白较B型HBV更能促进肝细胞凋亡,HBV基因型与临床相关性可能与此有关.     

过表达HSP20的慢病毒载体对H2O2诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的构建过表达大鼠热休克蛋白20(HSP20)基因慢病毒载体,探讨其对H2O2诱导的大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠HSP20基因pHIV-HSP20过表达质粒慢病毒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其转染效率;包装慢病毒并转染H9C2心肌细胞;72 h后观察其转染效率,RT-PCR法检测细胞HSP20 mRNA表达,CCK-8、Hochest33258染色法检测H2O2诱导后H9C2心肌细胞凋亡情况。结果成功构建了HSP20慢病毒过表达载体,经293FT细胞包装后,其对H9C2细胞72 h的转染效率为95%;与慢性病毒组比较,H9C2细胞转染72 h后HSP20 mRNA水平显著升高,细胞活力下降,心肌细胞凋亡率明显降低(P均<0.01)。结论过表达HSP20能显著抑制H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

丙型肝炎病毒核心区蛋白对 HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响

目的　研究丙型肝炎病毒核心区 (HCV C)蛋白对肝癌细胞HepG2细胞周期、细胞凋亡和细胞端粒酶活性的影响。方法　首先运用基因重组技术构建含有HCV C基因的真核表达质粒pcDNA3.1( ) ,然后利用脂质体介导将重组真核表达质粒转染HepG2 ,经G4 18筛选获得稳定转染HepG2细胞 (HCV C转染HepG2细胞 ) ,经逆转录 聚合酶链反应技术 (RT PCR)和间接免疫荧光法证实其中有HCV C蛋白表达。然后进行如下实验 :( 1)利用四甲基偶氮唑蓝比色 (MTT)法检测HCV C转染HepG2细胞、空白质粒转染HepG2细胞和未转染HepG2细胞的生长增殖率 ;经流式细胞术(FACS)检测 3组细胞的细胞周期 ;( 2 )经流式细胞术检测细胞凋亡率 ;( 3)经端粒重复扩增 酶联免疫吸附试验 (TRAP ELISA)法检测上述 3组细胞端粒酶活性表达情况。结果　 ( 1)HCV C转染HepG2细胞增殖率显著高于空白质粒转染HepG2和未转染HepG2细胞增殖率 ;HCV C转染HepG2细胞S期所占百分率高于未转染HepG2细胞S期所占百分率 ;( 2 )HCV C转染HepG2细胞凋亡率显著低于无HCV C转染细胞凋亡率 ;( 3)上述 3组细胞端粒酶活性之间差异无显著性。结论　 ( 1)HCV C蛋白具有抑制细胞凋亡的作用 ;( 2 )HCV C蛋白促进HepG2从G0 /1期进入S期 ,从而可能促进细胞生长增殖 ,抑制细胞凋亡 ;( 3)HCV     

Krüppel-like factor4慢病毒表达载体构建及其对胃癌细胞BGC-823生物学行为的影响

目的 构建Krüppel-like factor4(KLF4)过表达慢病毒载体,探讨其对胃癌细胞株BGC-823生物学行为的影响.方法 检测BGC -823中KLF4 mRNA的表达水平;用真核表达质粒pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP,将KLF4基因连人慢病毒载体pLv-UbC-IRES2-EGFP中,构建pLv-KLF4-IRES2-EGFP重组慢病毒表达载体.将酶切和测序鉴定后的重组质粒转染至BGC-823中,观察转染情况,RT-PCR检测KLF4 mRNA.慢病毒包装后转染BGC-823细胞,Western印迹检测KLF4蛋白.结果 重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确;pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP转染BGC-823细胞后KLF4 mRNA升高.慢病毒包装后转染BGC-823检测到目的蛋白KLF4.KLF4能够将细胞阻滞于G1/S,抑制其生长、促进细胞凋亡,减少细胞侵袭能力.结论 转染BGC-823后KLF4蛋白检测证实慢病毒载体成功构建,KLF4能抑制胃癌细胞的恶性转化.     

人宫颈癌基因反义核酸抑制肝癌细胞生长作用的实验研究

目的探讨针对人宫颈癌基因(HCCR)反义核苷酸影响肝癌细胞增殖、凋亡的作用。方法构建pcD-NA3.1-HCCR反义真核表达质粒,转染HepG2细胞,实时定量PCR检测HCCR mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平,流式细胞仪观察HepG2细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖活性。结果HCCR反义核酸可有效抑制HepG2细胞HCCR的表达,与转染前相比,转染后24小时HCCR mRNA水平下降到16%,其蛋白表达水平在24小时也明显降低。对细胞的增殖与凋亡活性检测显示:转染HCCR反义质粒后,HepG2细胞增殖受到抑制,转染后24小时抑制率为47.62%(P<0.05),细胞凋亡率为14.34%±0.91%,较对照组明显增多(t=21.799,P<0.05),细胞分裂多停止在G0G1期。结论HCCR反义核酸可以抑制HepG2细胞中HCCR的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞停滞于G1期。HCCR反义核酸用于肝癌细胞的基因治疗具有一定的潜在意义。