茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用

目的探讨茶黄素对体外培养人骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨诱导作用及其能力。方法将第二代人BMSCs分为茶黄素组、对照组,茶黄素组加入浓度为10 mmol/L茶黄素,对照组不干预。对比观察两组干预后细胞形态,钙结节、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原及骨钙素（OCN）免疫组化染色结果,并检测各组4、8、12、16 d各时点ALP、OCN活性。结果茶黄素组钙结节、ALP、Ⅰ型胶原及OCN免疫组化染色均呈阳性,对照组均为阴性;茶黄素组各时点ALP、OCN活性均高于对照组（P均〈0.05）。结论茶黄素可促进人BMSCs向成骨细胞分化。     

地塞米松对人肺泡上皮细胞中SLC34A2基因表达和钙、磷转运的影响

用不同浓度地塞米松与人肺泡上皮细胞A549共培养24h,检测该细胞SLC34A2 mRNA及细胞上清液中的钙、磷。结果显示,高浓度地塞米松组SLC34A2 mRNA表达量明显高于对照组和其他浓度地塞米松组（P均〈0．05）,细胞上清液中的钙、磷含量则明显低于对照组和其他浓度地塞米松组（P均〈0．05）。认为高浓度地塞米松促进人肺泡上皮细胞的SLC34A2基因表达及细胞外液的钙、磷转运。     

鼠成骨细胞诱导兔BMSCs成骨的实验观察

目的观察乳鼠成骨细胞诱导乳兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨情况。方法取SD大鼠乳鼠颅盖骨,采用组织块培养法培养成骨细胞;取乳兔长骨,采用全骨髓培养法培养BMSCs;用Transwell双层细胞培养板共育,实验组于培养上室接种成骨细胞,对照组培养上室不接种细胞,两组培养下室均接种BMSCs。观察BMSCs形态变化,用酶标仪检测诱导分化后BMSCs的ALP活性,RT—PCR检测BMSCs中的骨钙素、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、Ⅰ型胶原基因。结果共培养后实验组BMSCs形态逐渐向成骨样细胞转化,对照组无明显变化;实验组BMSCs中ALP活性高于对照组,实验组的BMSCs的骨钙素、BMP-2、Ⅰ型胶原基因有所表达,对照组无表达。结论乳鼠成骨能够诱导乳兔BMSCs向成骨细胞分化。     

PI3K／Akt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化调控中的作用

目的：研究PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）增殖及分化的影响。方法采用贴壁法体外分离人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,加入PI3K抑制剂LY294002（1、10μmol/L）,应用MTT法测定细胞增殖,常规成骨诱导分化培养3或7d,采用碱性磷酸酶（ALP）染色观察成骨分化水平,化学比色法测定ALP活性,茜素红染色后观察矿化钙结节数量并定量分析,Westernblot检测磷酸化Akt蛋白表达,应用Realtime-PCR检测各组细胞BMP2、Runx2、OPN及Osterix等成骨分化标记物的基因表达水平。结果从24至72h,LY294002对hMSCs增殖均产生显著抑制,随时间推延,可见抑制增殖效果增强（P＜0.05）。ALP染色和定量测定提示10μmol/L的ALP活性最强,在不同时间显著高于对照组和1μmol/L组（P＜0.05）。成骨诱导培养3和7d,1、10μmol/L组矿化量都显著高于对照组（P＜0.05）。10μmol/L组矿化量在成骨诱导7d也显著高于1μmol/L组（P＜0.05）。Westernblot检测结果证实成骨诱导可激活Akt磷酸化蛋白表达,但LY294002可抑制该蛋白磷酸化。成骨诱导分化7d,1、10μmol/L均明显促进BMP2、Runx2、OPN、Osterix4种基因mRNA表达（均P＜0.05）。结论PI3K/Akt信号通路参与hMSCs增殖和分化过程。成骨分化伴随下游Akt蛋白表达。PI3K抑制剂可抑制hMSCs增殖,但同时促进其向成骨分化和矿化。     

氟对骨髓基质细胞增殖和成骨能力的影响

目的探讨氟对体外培养的大鼠骨髓基质细胞（MSCs）增殖能力与成骨能力的影响。方法体外培养大鼠MSCs。噻唑蓝（MTT）比色法分析不同染氟水平下MSCs的增殖能力；光、电镜下观察不同染氟水平下MSCs成骨转化能力和相应超微结构变化。结果与对照组比较，低水平染氟（0．02mg／L）96h后促进MSCs增殖（P〈0．05）；较高水平染氟（0．05～1．00mg／L）72h即可促进MSCs增殖（P〈0．05或〈0．01）；高水平染氟（10．00、20．00mg／L）对MSCs具有抑制增殖和促细胞凋亡作用（P〈0．01）。较高水平染氟（2．00～20．00mg／L）时MSCs成骨转化受抑（P〈0．01），较低水平染氟（0．01～1．00mg／L）时MSCs成骨转化增强（P〈0．01）。结论低水平染氟促进MSCs增殖。成骨转化能力增强；高水平染氟抑制MSCs增殖，促进细胞凋亡，抑制MSCs成骨转化能力。     

不同来源血清和细胞因子对骨髓基质细胞成纤维细胞集落形成的影响

目的观察sD大鼠骨髓基质细胞（BMSC）体外培养的生物学特性并加以鉴定,并探讨不同来源血清和细胞因子对其成纤维系祖细胞（CFU-F）产率的影响。方法取SD大鼠骨髓,进行BMSC原代培养。传代后分别观察其生长特性,绘制贴壁率,测定生长曲线,并应用流式细胞仪鉴定细胞表型;采用体外长期液体培养法观察CFU—F的产率。结果原代培养的BMSCs生长良好,倍增时间约为40小时,传代后12小时贴壁率达85％以上;胎牛血清较脐血清和马血清能促进CFU-F的增值和分化。与未加细胞因子对照组相比,单用细胞因子SCF,SDF-1均可促进CFU—F的增殖,但二者之间差异无显著性（P〉0．05）,同时加入SCF,SDF-1可明显的促进CFU-F的增殖,并优于单用SCF和SDF-1（P〈0．05）。结论体外培养的BMSCs生长稳定,传代后细胞适应性强;胎牛血清中可能较脐血清和马血清存在较多的对CFU—F有促进作用的生长因子;SCF可协同SDF-1促进CFU-F的增殖。     

体外增殖培养的骨髓间充质干细胞移植后在脑梗死大鼠脑内的存活

目的观察应用维生素C（Vc）和碱性成纤维因子（bFGF）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外增殖培养,移植到脑梗死大鼠体内后,在脑内的存活情况。方法①采用密度梯度离心及贴壁法分离大鼠BMSCs。按培养液中加入的不同因子分为4组：对照组、Vc组（50μg/m1）、bFGF组（1μg/L）以及Vc＋bFGF组（50μg/ml Vc和1μg/L bFGF）,在体外对BMSCs进行培养并观察各组细胞的增殖情况。采用MT丁比色法分别于培养第1、2、3、5和7天,测定细胞在450nm波长处的吸光度（A）值;采用流式细胞仪检测培养96h后的细胞周期。②采用线栓法制备20只大鼠右侧大脑中动脉闭塞2h模型,并随机分为2组：联合Vc＋bFGF培养的BMSCs移植组（10只）和对照BMSCs移植组（10只）。将相应组别的BMSCs细胞移植人脑梗死24h后的大鼠体内。分别于移植后第1、2和3周,制备大鼠脑组织切片并行BrdU免疫组化染色。结果①形态学观察显示,Vc＋bFGF组的BMSCs增殖最快,对照组则相对缓慢。②各组细胞的A值于培养第2天开始增加,Vc组和bFGF组在第3天达到高峰（F=728．52和F=197．18,P〈0．05）,Vc＋bFGF组在第5天达到高峰（F=1771．32,P〈0．05）,第7天均有所下降。第2天起,bFGF组、Vc组与bFGF＋Vc组的A值均高于对照组;第3天起,Vc＋bFGF组高于Vc组与bFGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。③Vc组、bFGF组与Vc＋bFGF组细胞处于增殖期（s＋G2＋M期）的百分比均较对照组高,差异有统计学意义（P〈0．05）。④BMSCs移植后第2周,联合Vc＋bFGF培养的BMSCs移植组大鼠脑组织切片中BrdU阳性细胞计数较对照组高;第3周两组阳性细胞计数均有下降,但前者仍较后者高。差异均有统计学意义（P〈0．01）;Brdu阳性细胞主要分布在梗死灶周围。结论Vc与bFGF均可促进大鼠BMSCs的增殖,二者联用较单用其一的效果更好;脑梗死大鼠移植增殖培养后的BMSCs,其在脑组织中的成活能力明显增强。     

低氧下丹参酮ⅡA对人胃癌SGC-7901细胞HIF-1α与c-Myc表达的影响

目的观察低氧下丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）对人胃癌SGC-7901细胞低氧诱导因子let（HIF-1α）与c—Myc表达的影响和二者的相关性。方法用氯化钴创建低氧模型,设常氧对照组、低氧对照组和低氧加不同浓度Tan Ⅱ A组。分别取0．5、2．0、10．0mg／L Tan ⅡA干预低氧胃癌细胞48h后,免疫细胞化学二步法检测HIF-1α和c—Myc蛋白表达的变化。结果Tan ⅡA呈剂量依赖性地抑制HIF—1α和c—Myc蛋白表达,且二者呈高度正相关（r=0．901,P〈0．05）。结论低氧条件下,Tan ⅡA可同时抑制人胃癌SGC-7901细胞HIF-1α和c—Myc蛋白的表达,提示Tan ⅡA可能对抑制肿瘤的无氧糖酵解和VEGF表达具有重要作用。     

氦-氖激光对大鼠骨髓间充质干细胞生长及神经分化潜能的作用

目的观察氦-氖（He-Ne）激光治疗仪对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长和神经分化潜能的作用。方法采用全骨髓培养法获取Sprague-Dawley大鼠的原代BMSCs,取第3代培养的细胞,分为实验组（He-Ne激光治疗仪处理10 min）和对照组（空气暴露相同时间）。采用CCK8法检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,锥虫蓝染色测定细胞活力,并采用细胞免疫荧光技术鉴定BMSCs的神经干细胞分化潜能。结果①细胞呈纤维状贴壁生长,表型鉴定结果为CD90、CD29表达阳性,CD45表达阴性,符合BMSCs的表型特点。②实验组和对照组的细胞增殖活性比较,差异无统计学意义,P〉0.05。③实验组细胞的早期凋亡率为（1.10±0.26）%,与对照组细胞的（1.43±0.06）%比较,差异无统计学意义,P〉0.05。实验组的细胞活力为（96.2±0.6）%,与对照组的（96.2±0.7）%比较,差异亦无统计学意义,P〉0.05。④实验组和对照组的BMSCs在神经干细胞培养液中培养后,均可呈现悬浮生长的神经球;免疫荧光染色显示,神经球中细胞的Nestin染色阳性。结论 He-Ne激光治疗仪对BMSCs的增殖和活力无明显影响,未引起细胞凋亡,未改变BMSCs向神经干细胞分化的潜能。     

盐酸法舒地尔对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的观察盐酸法舒地尔对体外培养神经干细胞（NSCs）分化的影响。方法体外分离培养NSCs,通过不同浓度的盐酸法舒地尔干预后,采用免疫细胞化学及流式细胞技术检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果分离培养的NSCs具有自我复制、增殖能力,可以表达Nestin;诱导分化后的细胞可以表达NSE和GFAP。免疫细胞化学染色提示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞显著高于对照组（P〈0．05）,但是不同浓度盐酸法舒地尔之间元统计学差异（P〉0．05）。流式细胞仪检测结果显示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞比例明显增加,与对照组相比有统计学差异（P〈0．05）。结论盐酸法舒地尔可以促进NSCs向神经细胞方向分化。     

rVisfatin干预人脂肪细胞的功能研究

取外科手术病人腹部网膜脂肪组织,进行人前体脂肪细胞的原代培养并于培养24h后诱导其分化。适时用不同浓度（1ng/ml、50ng/ml）的rVisfatin进行干预,48h检测人前体脂肪细胞的增殖,脂肪细胞的分化程度;检测脂联素mRNA的表达。结果：1ng/ml rVisfatin使人前体脂肪细胞MTT值增加14．3％（P〈0．05）,50ng／ml增加17．5％（P〈0．05）,经rVisfatin干预的人脂肪细胞胞浆中,脂肪的堆积多于对照组;rVisfatin干预组人脂肪细胞脂联素mRNA的表达量高于不加rVisfatin的对照组,1ng／ml组使脂联素的mRNA表达量增加31％,50ng／ml组增加55％。结论：rVisfatin能促进人前体脂肪细胞的增殖和分化;脂联素mRNA的表达。     

华蟾素对肝癌细胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影响

目的探讨华蟾素对离体肝癌细胞株SMMC-7721的增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将肝癌细胞株SMMC-7721分为实验组及对照组,细胞培养后取对数生长期细胞,实验组加入0．4、0．6、0．8μmol／L华蟾素,对照组不加药,采用MTr法检测两组24、48h增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期比例及凋亡率,RT-PCR法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3mRNA表达,Westernblot法检测髓系白血病基因（Md）-1的蛋白表达。结果实验组增殖抑制率明显高于对照组,且呈时间和剂量依赖性,P均〈0．05;实验组凋亡率明显高于对照组,P〈0．05;实验组Caspase．3mRNA表达量明显高于对照组,P〈0．05;Mcl-1蛋白表达量明显低于对照组,P〈0．01。结论华蟾素对肝癌细胞株SMMC-7721具有增殖抑制及凋亡诱导的作用,其机理可能为使Caspase-3表达升高,Mcl-1表达降低。     

胰岛素样生长因子-1对MC3T3-E1细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响

目的观察胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对体外培养的小鼠前成骨样MC3T3-E1细胞增殖及Ⅰ型胶原蛋白合成的影响,探讨IGF-1对骨代谢可能的影响机制。方法不同浓度rhIGF—1刺激体外培养的MC3T3-E1,用噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖能力。结果一定浓度IGF-1能明显增加戍骨细胞数量（P〈0．05）,在1ng／mL～100ng／ml。这种作用与IGF-1的浓度呈正相关;经rhIGF-1的刺激,成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达明显高于对照组（P〈0．05）;半定量RT—PCR显示在rhIGF-1干预48h后,Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达较对照组明显增加。结论IGF-1对MC3T3-E1细胞有明显的促增殖作用,在0．1ng／mL～100ng／mL之间呈浓度依赖性,IGF-1能促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达。     

骨髓基质干细胞对肝细胞与肝纤维化细胞增殖影响的体外研究

目的探讨微环境对骨髓基质干细胞（BMSCs）分化的影响以及BMSCs对肝纤维化细胞（CFSC）和肝细胞增殖的作用。方法分离、培养大鼠原代BMSCs和肝细胞,用PKH26荧光标记BMSCs,将标记后的BMSCs与肝细胞/CFSC进行接触和非接触共培养,用抗白蛋白抗体/抗α、平滑肌抗体对BMSCs进行检测;BMSCs条件培养液与CFSC共培养,倒置显微镜下计数CFSC的细胞数量变化。结果BMSCs与肝细胞共培养72h,白蛋白染色均出现阳性,且接触共培养的BMSCs白蛋白染色阳性率高于非接触共培养（P〈0.01）。肝细胞与BMSCs非接触共培养48h后,肝细胞的数量明显多于对照组（P〈0.01）。BMSCs与CVSC共培养体系中BMSCs的形态无明显变化,且αSMA染色未出现阳性。BMSCs条件培养液能抑制CFSC的增殖,作用时间越长,抑制作用越明显（P〈0.01）。结论肝细胞形成的局部微环境能诱导BMSCs向肝样细胞分化,BMSCs能够促进肝细胞生长并对CFSC的增殖有明显的抑制作用。     

雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响

目的初步探讨雷洛昔芬对成骨细胞骨形成作用机制。方法采用新生大鼠颅盖骨酶消化法体外培养成骨细胞,在培养液中加入不同浓度雷洛昔芬（0、10^-8、10^-7、10^-6mol/L）,在共同条件下培养。测定各项骨形成指标（增殖测定、碱性磷酸酶活性定量和矿化结节形态计量）。结果雷洛昔芬（10^-8mol/L组和10^-7mol/L组）的MTT、ALP测试结果及矿化结节形态计量高于对照组,且有统计学意义,P〈0.05。结论雷洛昔芬能够促进大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖、分化及矿化,与雌激素作用类似。     

降钙素基因相关肽对滑膜来源间充质干细胞增殖与成骨分化的调控作用

目的：观察降钙素基因相关肽（CGRP）对滑膜来源间充质干细胞（SMSCs）增殖和成骨分化的调控作用。方法分离大鼠来源的SMSCs,选取第3代SMSCs细胞进行增殖和成骨分化实验,CCK-8法检测SMSCs细胞活性,并进行碱性磷酸酶活性检测。结果 CGRP诱导SMSCs增殖第4天实验组、对照组细胞吸光度相对比分别为1．34±0．08、1．40±0．07,第6天分别为1．76±0．12、1．89±0．14,第8天分别为1．84±0．13、2．35±018,两组比较,P均＜0．05。 CGRP诱导SMSCs成骨分化第5天实验组、对照组碱性磷酸酶活性分别为1．38±0．05、1．00±0．02,第10天分别为1．75±0．10、1．44±0．06,两组比较,P均＜0．05。结论 CGRP可以促进SMSCs增殖和成骨分化。     

骨水泥对椎间盘细胞凋亡、基质蛋白多糖及胶原代谢的影响

目的探讨骨水泥材料对藻酸盐凝胶系统中的椎间盘细胞凋亡、细胞外基质蛋白多糖和胶原代谢的影响。方法兔椎间盘标本于藻酸盐凝胶系统中分别使用普通培养液（对照组）、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥（PMMA组）、磷酸钙骨水泥（CPC组）及丝素复合磷酸钙骨水泥（SF／CPC组）浸出培养液培养至1、2、3周时,对各组标本行Hoechst33342和PI染色,检测细胞死亡率;免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达;番红O染色检测基质多糖含量。结果第1周时,PMMA组及CPC组细胞死亡率均高于对照组及SWCPC组,PMMA组高于CPC组（P〈0．05）;第3周时,CPC组高于对照组和SF／CPC组（P均〈0．05）。第1、2周时,PMMA组及CPC组Ⅱ型胶原含量明显降低（P〈0．05）,第3周时,CPC组有一定恢复,SWCPC组与对照组近似（P〉0．05）。各组基质蛋白多糖平均光密度值均随时问呈下降趋势,PMMA组下降最明显（P〈0．05）。结论PMMA对藻酸盐凝胶系统培养的椎间盘细胞活性、Ⅱ型胶原及基质蛋白多糖代谢影响最明显,SF／CPC较CPC对椎间盘组织有更好的生物相容性。骨水泥材料可加速椎间盘的退变,影响程度与材料的类型有关。     

游离脂肪酸对人脐静脉内皮细胞eNOSmRNA及ET-1mRNA表达水平的影响

目的研究游离脂肪酸（FFA）对离体培养人血管内皮细胞（HUVEC）eNOS mRNA和ET-1mRNA表达水平的影响。方法用不同的FFA培养HUVEC，分为C16：0、C18：0、C18：1、C18：2、C24：0及对照组，每组选用4个浓度，孵育24h，用RT—PCR方法，半定量测定eNOS mRNA和ET-1mRNA的表达。结果①C18：1、C18：2组（t≥200μmol／L）eNOS mRNA表达值低于对照组（P〈0．05）且呈浓度依赖性，而C18：2组eNOS mRNA表达值比C18：1组低（P〈0．05）。②C18：1组以及C18：2组ET-1mRNA表达值低于对照组（P〈0．05），呈浓度依赖性。③C16：0、C18：0、C24：0组（≥200μmol／L），ET-1mRNA表达值增高（P〈0．05），呈浓度依赖性。④C18：0、C18：1、C18：2各组相同FFA水平相比较，ET-1mRNA表达水平依次降低（P〈0．05）。⑤C18：1、C18：2组eNOS mRNA与ET-1mRNA表达值之比高于对照组（P〈0．05）。C16：0、C18：0、C24：0各组此比值低于对照组（P〈0．05）。C18：0、C18：1、C18：2各组同浓度FFA条件下此比值依次升高（P〈0．05）。C16：0、C18：0、C24：0各组同浓度FFA条件下此比值无显著差异（P〉0．05）。结论①FFA对内皮细胞eNOS mRNA表达水平的影响与链长无关，而与FFA饱和程度有一定关系。②不饱和脂肪酸（UFA）降低eNOS mRNA以及ET-1mRNA表达；提示UFA倾向于维护血管舒张功能。③饱和脂肪酸（SFA）呈浓度依赖性促进ET-1mRNA表达可能是导致内皮功能障碍的部分原因。