慢性乙型肝炎患者血清HBV增强子I区分子特征分析

目的分析乙型肝炎病毒基因组中增强子I区的特征,进一步探讨乙肝慢性化的机制。方法收集16份慢性乙型肝炎患者的血清标本HBV—DNA,扩增HBVEnhI基因,PCR产物测序后对HBV进行分型,并分析HBVEnhI突变情况。结果10例（62．5％）标本HBVEnhI基因PCR扩增阳性,测序标本经在线Genotyping比对后,均属于B型,与参考序列AFl00309同源性最高,10份标本的HBVEnhI区共发现12个突变位点。结论HBVEnhI基因存在多位点突变,此可能为促进病毒复制导致乙肝慢性化的机制。     

HBsAg与抗-HBs同时阳性慢性乙肝患者HBV基因全序列分析

目的 报告HBsAg与抗-HBs同时阳性慢性乙肝患者基因序列变化特点.方法 对三例HBsAg与抗-HBs同时阳性慢性乙肝患者血清中HBV DNA基因全序列进行PCR扩增、测序,并对测序结果及S区氨基酸进行分析.结果 测序结果发现三例患者血清中HBV S区氨基酸均发生替换突变,并且,三例患者中HBV DNA发生碱基替换的位点大部分相同,且替换后碱基基本相同.结论 HBsAg与抗-HBs同时阳性慢性乙型肝炎患者常发生S区氨基酸序列突变,双阳现象的出现亦可能与S区外其他位点碱基突变有关.     

DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较

目的建立和优化扩增慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因的PCR方法,比较DNA测序法与线性反向探针杂交法检测HBV基因突变情况,并对耐药相关基因突变及其意义进行分析。方法采用巢式PCR法扩增93例慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因反转录酶区,对PCR产物进行DNA测序,采用Bioedit6．0．5、Seqman TMⅡ、EditSeq TM和MegAlign软件分析结果;同时随机抽取40份血清进行线性反向探针杂交,比较两者的检测结果,并对11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在93份标本中DNA序列测定法检测到碱基突变113个,其中与LAM相关突变50份（53．78％）,与ADV相关突变6份（6．46％）,与LdT相关突变3份（3．23％）,与ETV相关突变3份（3．23％）;在40份血清中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为87．5％（35140）,氨基酸位点一致为98．0％（431／440）。此外,还检测到V84I、S85C、A181S、L229W、N238T等与耐药相关的突变位点。结论应用线性反向探针杂交检测虽然比较快捷,但其价格昂贵且只能检测已知常见的变异位点;建立在巢式PCR基础上的DNA序列测定法敏感性与线性反向探针杂交法相当,两者检测结果有较高的符合率,但似可检出更多的耐药相关突变。     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA和松弛环状DNA耐药突变检测及比较

目的 建立检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)逆转录酶区(RT)耐药位点的方法,并分析HBV cccDNA与松弛环状DNA(rcDNA)RT区耐药位点及耐药突变率的差异. 方法利用滚环扩增法(RCA)同时扩增20例慢性乙型肝炎患者肝组织中HBVcccDNA和HBV载量为108拷贝/ml血清中的rcDNA,再以该扩增产物为模板,以跨缺口引物扩增HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区;巢式PCR直接扩增同一患者血清中HBV rcDNA RT区.HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区扩增片段经测序后采用Vector NTI Suite8.0及chromaslite201分析其耐药突变位点;采用x2检验比较rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率. 结果以RCA产物为模板用跨缺口引物成功扩增并获得肝组织cccDNA RT区片段,阴性对照组及HBV载量为108拷贝/ml血清rcDNA组均无扩增产物;巢式PCR.直接扩增获得同一患者血清中HBV rcDNART区片段.序列测定结果显示,本组试验中10例有抗病毒史的慢性乙型肝炎患者发生rcDNA RT区耐药者有6例,突变率为60%,1例发生cccDNA RT区突变,突变率为10%,两者比较,P=0.019,差异有统计学意义.10例无抗病毒史的慢性乙型肝炎患者有2例发生rcDNA耐药,耐药突变率为20%,1例发生cccDNA耐药突变,突变率为10%,两者比较,P=0.531,差异无统计学意义.产生耐药突变的患者其cccDNA与rcDNA RT区耐药突变位点均不相同.结论 RCA可用于HBV cccDNA RT区耐药突变位点检测;有抗病毒史的患者的rcDNA与cccDNA RT区耐药突变不同步.在辅助临床治疗中,对HBV cccDNA进行耐药监测比对HBV rcDNA耐药监测更有意义.     

焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒多个基因型耐药突变方法的建立及初步评价

目的建立焦磷酸测序(Pyrosequencing,PyroS)法检测HBV反转录酶基因区(rt区)与核苷(酸)类似物(NAs)耐药相关基因突变的检测方法。方法针对HBVDNArt区10个已知常见耐药突变位点的12种突变形式,分别构建野生型和突变型质粒作为标准品;设计通用PCR扩增引物和针对不同突变位点的焦磷酸测序引物,建立基于PyroS技术的HBV耐药突变检测方法。分别采用传统的双脱氧测序法和我们构建的PyroS法对接受/未接受NAs治疗的慢性乙型肝炎患者95份血清标本进行检测比较,并采用克隆测序法进行结果验证。结果 1.构建了HBVrt区常见耐药突变的野生株和变异株标准质粒,并建立了能对12种常见NAs耐药突变同时进行检测的PyroS方法;证实当标准质粒浓度≥1000拷贝/mL时,PyroS法对耐药突变位点的检出率、特异性和重复率均可达100%;2.对95份临床血清标本共检测了950个耐药相关氨基酸置换位点,PyroS法检测结果与直接测序法相符位点939个(符合率98.84%),PyroS法较直接测序法多检出8份标本中共11个变异位点,克隆测序法证实了焦磷酸测序法结果。结论成功建立了能同时定量检测10个已知NAs相关耐药基因突变的PyroS技术,可用于临床抗病毒疗效的监测、及早发现基因型耐药突变,并指导治疗方案的及时调整。     

免疫接种后HBV感染者PreS2基因变异的情况

目的:本课题应用PCR和基因测序等技术,观察免疫接种后慢性乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,H B V)感染者的PreS2基因变异情况,进而初步探讨乙型肝炎疫苗免疫失败与P r e S2基因变异之间的相互关系;为进一步探索新的HBV抗病毒基因治疗靶点提供理论基础.方法:收集昆明市延安医院和昆明市第三人民医院免疫接种后慢性HBV感染者的血液标本共47例,从血清标本中提取HBV DNA;用PCR法扩增Pre S2基因片段;扩增后的基因片段进行DNA序列分析.扩增出PCR产物的有35例,上海生工测序最终完成测序的有32例,其中男18例,女14例,年龄19-56岁,平均年龄32.75岁±10.22岁.32份样本的HBV Pre S2基因片段测序后,以Gen Bank数据库中登录号为NC_003977.1的HBV DNA全基因序列为参照,用Chromas软件分析测序图及BLASTN对测序结果进行比对分析后,采用SPSS11.5统计软件进行统计分析.结果:32例标本中Pre S2基因全部出现点突变(100%),其中2例出现缺失突变(6.3%),提示可能存在Ile、Tyr、Phe、Gly、Arg等氨基酸的缺失,32例标本均未发现Pre S2起始密码子ATG的变异,点突变共发生517次,Pre S2基因碱基突变有11种类型:G-A、A-G、T-C、A-T、G-T、C-T、G-C、A-C、C-G、C-A、T-A.11种不同类型的点突变在突变例数率及突变次数率方面均不全相同,其中A-T的突变例数较多,G-A的突变次数较多,差异有统计学意义(P0.05).Pre S2基因不同部位点突变比较结果显示Pre S2基因前端、中段、末端点突变率不全相同,其中中段(nt45-99),即Pre S2基因的56-110位点突变率较高,前端突变率较低,差异有统计学意义(P0.05).结论:Pre S2基因变异与免疫失败可能存在相关关系,这将为今后深入研究乙型肝炎疫苗免疫失败的发生机制并用于指导临床实践提供理论基础.同时,进一步确定Pre S2基因变异位点,并针对这些靶点设计相应的基因治疗方法,也可能成为今后乙型肝炎疫苗免疫研究的新方向.     

A～D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区PCR方法的建立及应用

目的 建立适用于扩增我国常见的乙型肝炎病毒(HBV)A～D基因型全长逆转录酶(RT)区(包含全长HBsAg编码区)的聚合酶链反应(PCR)法,并确定其在分析临床标本中的应用价值.方法 建立我国HBV基因序列库,设计适用于扩增A～D基因型HBV全长RT区引物,以A～D基因型HBV重组质粒为模板建立半巢式PCR(snPCR)法,并确定该法灵敏度.用所建立的snPCR对44份HBV DNA定量阳性(>5.0×102 拷贝/ml)慢性乙型肝炎患者血清标本进行扩增及PCR产物直接测序.结果 琼脂糖凝胶电泳及测序证实,snPCR可扩增A～D基因型HBV全长RT区,对A、B、C和D基因型HBV质粒扩增的灵敏度分别为1.2×103、7.0×102、6.0×102和6.0×102 拷贝/ml.snPCR检测HBV DNA >5×102 拷贝/ml血清标本的阳性率为88.64% (39/44),扩增阴性血清标本HBV DNA滴度均处于103 拷贝/ml水平.扩增目的 产物经直接测序确证无误.生物信息学分析显示,样品中B和C基因型分别占35.90%(14/39)和64.10%(25/39);其中15.38%(6/39)发生RT区变异,包括4例为已知耐药变异;7例(17.95%)存在HBsAg编码区变异,其中2例为已知免疫逃逸变异;6例(15.38%)发生RT区和HBsAg编码区"镜像改变".结论 建立了一种新的扩增全长RT区(涵盖全长HBsAg编码区)的snPCR.该法结合直接测序法,可同时分析我国HBV A～D基因型已知和潜在的耐药变异位点.     

CCR5Δ32等位基因多态性与贵州特殊人群HBV感染的相关性

目的: 探讨CCR5Δ32等位基因在贵州世居少数民族(彝、瑶)与汉族人群的分布, 并分析CCR5位点突变与HBV的关系.方法: 采用PCR技术分别扩增贵州92份黔西彝族、101份威宁彝族、138份荔波瑶族以及165份毕节汉族CCR5编码区片段, 通过琼脂糖凝胶电泳对CCR5Δ32多态性进行分析, 最后抽取样本并进行DNA测序验证.结果: 经过PCR特异性扩增, 琼脂糖凝胶电泳后, 496份样本均未发现CCR5Δ32突变型和杂合子. DNA测序验证所有样本CCR5基因未发生32碱基缺失的突变.结论: CCR5Δ32的分布有较明显的地域和种族差异, 该位点与HBV感染的相关性有待于进一步深入研究.     

无血清免疫学标志的乙型肝炎病毒株分子生物学某些特性的初步探讨

目的：了解无血清免疫学标志的HBV株分子生物学的改变。方法：收集104例不明原因性肝炎患者的血清，套式PCR扩增HBVS、X、C基因，HBVS、X区扩增产物测序和变异位点分析。结果：检测出隐匿性HBV感染13例。S基因区未发现有义突变，X基因区及重叠核心启动子区、增强子Ⅱ区发现多位点变异。结论：X基因区及重叠核心启动子区、增强子Ⅱ区多位点变异可能是无血清免疫学标志HBV株的分子基础。为深人研究隐匿性HBV感染的临床检测及防治奠定基础。     

乙型肝炎病毒X区基因变异与原发性肝癌的关系研究

目的初步研究乙型肝炎病毒(HBV)X区基因变异与原发性肝癌的关系。方法收集39例HBV感染患者的肝(癌)石蜡组织标本,其中慢性乙型肝炎(CHB)14例、肝细胞癌(HCC)25例。采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增组织中HBV X区基因,并对PCR产物进行DNA测序,分析常见变异位点的变异情况。结果 1.HCC组与CHB组相比,在X区发生插入/缺失变异,联合变异的位点及例数增多,并且A1762T与G1764A常发生双突变。2.HBV X区变异频率较高位点依次是C1655T/G、A1605C/G、A1762T、G1764A、A1772B、A1645C、C1687A、G1776T。结论 HBV X区存在点突变、插入/缺失变异及联合变异,可能在HCC的发生和发展过程中起重要作用。     

解脲支原体对喹诺酮类耐药基因的突变研究

目的分析解脲支原体(UU)对喹诺酮类耐药基因突变位点及突变类型,为临床筛选新的耐药基因,寻找作用于UU新靶点的抗生素提供理论依据。方法收集临床耐喹诺酮UU标本,提取DNA,用设计的喹诺酮耐药决定区中GyrA、GyrB、ParC,ParE基因特异性引物PCR扩增目的序列并进行测序分析,寻找与耐药相关的突变位点。结果 PCR扩增目的基因序列后测序分析,ParC基因是UU喹诺酮耐药的主要突变位点,出现了6个点突变,造成3个位点的氨基酸序列改变;GryA、GryB和Par E基因出现的都是无义突变,氨基酸序列并未改变。结论 ParC基因是UU喹诺酮耐药的主要突变位点。临床上应重点针对Par C基因的突变进行相关研究,以降低UU耐药基因突变引起的耐药率上升。     

乙肝病毒核苷类似物耐药位点分析

目的:建立巢式PCR结合测序检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药位点的方法,确定患者的HBV基因型和耐药突变情况。方法:采用特异性引物进行巢式PCR扩增HBV DNA,产物测序后,利用MEGA 3.1对测序结果进行分析判断有无耐药突变的产生。结果:100例乙肝病毒载量阳性患者共检出48例有耐药突变,其中概率最高的是rt204位点的YVDD 15例、YIDD 13例;拉米夫定组的耐药概率明显高于对照组;耐药组的ALT和HBV DNA水平明显高于非耐药组。结论:传统的核苷类似物如拉米夫定会产生耐药,耐药一旦发生肝功能和HBV DNA会明显升高,巢式PCR结合测序法可对患者体内的HBV耐药突变位点进行有效检测,有利于指导临床用药。     

应用PCR—SSCP银染技术检测HBV基因点突变

目的：为了对乙型肝炎患者HBV基因突变进行大大面积筛检,建立简便 可靠的检测HBV基因突变的方法。方法：采用单链构象多态性（SSCP）银染技术,检测HBV Pre-C基因突变。结果：在10份HBeAg阳性标本中,有8份PCR阳性,SSCP显示有2份标本有HBV Pre-C基因突变,直接测序证实为非终止密码突变。48份抗－HBe阳性标本中,有12份为PCR阳性,有8份SSCP显示PCR产物单链泳运动状态异常,其中4份标本经直接测序证实在1898位发生了G→A变异,出现了TAG终止密码突变。结论：PCR－SSCP银染技术检测HBV Pre-C基因点突变有很高的特异性和敏感性,该方法稳定、简便、快速,能基本满足临床大面积大样本筛检的需要。     

慢性重型乙型肝炎患者HBVDNA前C／BCP区突变基因分析

目的分析慢性重型乙型肝炎（慢重乙肝）患者HBVDNA前C区和基本核心启动子（前C／BCP）区突变特点与意义。方法收集87例慢重乙肝和196例慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者血清，提取HBVDNA，用巢式PCR扩增HBVDNA前C／BCP区基因，PCR产物进行DNA测序，用NBI软件比对结果，重点分析G1896、G1862、G1899、A1762、G1764、T17536个位点突变。结果慢重乙肝组和慢乙肝组6个位点突变全阴率分别为3．4％和28．1％（P〈0．01）；慢重乙肝组在其中5个位点上的突变检出率显著高于慢乙肝组。此外，慢重乙肝组和慢乙肝组≥三联突变检出率分别为56．3％和35．2％（P〈0．01），≥四联突变检出率分别为25.3％和8．7％（P〈0．01），插入／缺失突变检出率分别为10．3％和1．0％（P〈0．01）。结论HBVDNA前c／BcP区基因突变发生频率的增加与慢乙肝发生重症化相关，结合临床资料分析突变的意义将有助于认识慢乙肝重症化的发生机制。     

抗病毒治疗后CHB患者HBV多聚酶基因P区突变检测及分析

目的观察慢性乙型肝炎（CHB）患者多聚酶基因逆转录保守区（P区）突变情况,分析其相关因素。方法选择220例行核苷（酸）类似物抗病毒治疗的CHB患者,采用套式PCR方法扩增HBV多聚酶基因P区特异性片段,焦磷酸测序法检测相关位点突变情况,并分析性别、年龄与突变率的关系及联合位点突变情况。结果HBV基因P区突变位点包括173、180、181、184、202、204、236和250,其突变率依次为1．81％、22．72％、13．63％、5．90％、0．45％、34．09％、5．00％、1．36％;204位点突变率在男性显著高于女性（P〈0．01）,180、181、236位点突变率无显著性别差异;180位点突变率在不同年龄组之间比较均有显著差异,204位点突变率在〈30岁者与41—50岁、51—60岁者间比较有显著差异（P〈0．05或0．01）;204位点联合180位点突变率为66．67％,181位点联合236位点突变率为36．67％。结论抗病毒治疗后CHB患者的HBV多聚酶基因P区突变主要集中在204、180位点,对抗病毒治疗耐药的HBV患者进行相关位点突变检测有利于指导临床治疗。     

单项抗-HBe阳性患者中的隐匿性乙型肝炎病毒感染

目的 研究抗-HBe单项阳性患者中隐匿性HBV的感染情况及发生的可能原因.方法 收集HBV血清学标志物检测结果中抗HBe单项强阳性[吸光度(A)值≤0.1]的新鲜血清标本61份,采用实时定量PCR进行HBV DNA含量检测.对于HBV DNA定量阳性的标本,采用雅培试剂复测HBV血清学标志物,采用PCR扩增,并进行克隆测序.结果 61份标本中,2份HBVDNA定量阳性,HBsAg血清学漏检率为3.3％.其中l份标本经雅培试剂复测为抗-HBc单项阳性,其前S区缺失突变和前S2区起始密码子突变,并存在不同突变株混合感染;另1份标本经雅培试剂复测发现,除抗HBe强阳性外,HBsAg和抗- HBc为极弱阳性,未发现前S/S区突变.结论 抗HBe单项阳性患者中存在隐匿性HBV感染和HBsAg血清学漏检情况,后者不仅与前S/S区突变有关,而且与外周血中HBsAg低水平也有一定关系.     

皮肤病理性瘢痕及瘢痕癌组织中Smad mRNA和蛋白检测及基因突变

目的分析皮肤病理性瘢痕及瘢痕癌组织中Smad蛋白和基因的表达变化及其基因的突变情况。方法将20份病理性瘢痕组织标本设为观察A组、20份瘢痕癌组织标本设为观察B组,20份正常皮肤组织设为对照组,分别使用免疫组织化学染色和实时荧光PCR(Real time PCR)观察三组标本Smad蛋白和基因的变化情况,同时应用基因测序技术扩增观察A组和观察B组标本的DNA序列,观察Smad基因的突变情况。结果(1)观察B组Smad蛋白和基因的表达水平高于观察A组和对照组(P<0.05),观察A组和对照组之间Smad蛋白和基因的表达水平无统计学差异(P>0.05)。(2)两组观察组标本经过PCR基因扩增后呈现6条目的条带,其中病理性瘢痕及瘢痕癌各3例,致病性与非致病性突变位点未在测序时发现。结论 Smad表达升高可能与瘢痕癌相关,下调Smads基因表达和抑制Smad蛋白活性将可能成为治疗瘢痕癌的药物靶方向。     

青岛地区乙型肝炎病毒基本核心启动子区基因突变与乙型肝炎病毒所致原发性肝癌的相关性

目的通过分析山东省青岛地区HBV核心启动子基因序列的突变特征,探讨其与乙型肝炎相关原发性肝癌的相关性。方法收取慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎相关原发性肝癌患者的血清标本各60例,然后从中提取HBV DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增、纯化、克隆后测序,根据S基因区的编码序列确定患者的基因型和血清型;分别将HBV核心启动子区的各序列结果与GeneBank中的HBV标准株做对比,用DNAMAN软件对基因序列进行突变分析。采用SPSS17.0软件进行统计学分析。结果 120例标本,HBV株均为B或C基因型,以C基因型为主,其中,HBV组的C基因型所占比率为83.33%,HCC组为90.00%(χ2=0.65,P=0.42);血清型均为adw2或adrq+。HBV基因组核心启动子区常见的点突变为C1653T、T1753V、C1754T及A1762T/G1764A,发生率分别为42.73%、86.36%、71.82%、38.18%。与慢性乙型肝炎患者相比,肝癌患者中发生率比较高的突变位点为C1653T(78.85%,χ2=52.58,P<0.001)及A1762T/G1764A(73.08%,χ2=50.88,P<0.001)。结论山东青岛地区HBV基因组常见为B、C基因型,其中以C型为主;核心启动子区突变发生率高,其中,T1753V与HCC发生无关,C1653T、A1762T和G1764A位点无论单独或是联合突变均与HCC发生密切相关。     

唐山地区乙肝患者HBsAg滴度、HBV DNA水平与乙肝基因突变位点的关系研究

目的:研究唐山地区乙型肝炎(乙肝)患者乙肝表面抗原(HBsAg)滴度、乙肝病毒基因(HBV DNA)水平与乙肝基因突变位点的关系.方法:选择2018年1月-2020年12月唐山地区150例乙肝患者作为研究对象,测定HBsAg滴度和血清HBV DNA水平,通过基因测序分析突变情况,并据此分为突变组与未突变组,比较不同基因...