急性白血病PTEN mRNA表达和Akt磷酸化水平的相关性研究

目的了解急性白血病（AL）PTENmRNA表达和Akt磷酸化（p-Akt）水平的关系，以期探讨急性白血病发生发展的机制。方法采用逆转录（1it）-PCR法检测白血病细胞系K562、Jurkat、HL-60及21名健康对照者和68例AL患者PTENmRNA表达情况。同时用流式细胞术检测K562、Jurkat、HL-60细胞和AL患者p-Akt水平。结果（1）21名健康对照者PTENmRNA阳性18名，占85．70％。K562细胞PTENmRNA阳性，Jurkat、HL-60细胞阴性。68例AL中PTENmRNA阳性18例，占26．47％，与健康对照者比较差异有统计学意义（Х^2=23．38，P〈0．01）；31例AL缓解患者PTENmRNA阳性21例，与AL初诊组比较差异有统计学意义（Х^2=15．19，P均〈0．01）。AL各亚型PTEN阳性率比较差异无统计学意义。（2）21名健康对照者p-Akt中位数1．57％。K562、Jurkat细胞p-Akt高表达，HL-60细胞低表达。68例AL患者p-Akt中位数25．47％，与健康对照者比较差异有统计学意义（P〈0．01）。（3）AL患者FYENmRNA表达缺失率与p-Akt阳性率呈显著正相关（Х^2=0．73，P〈0．01）。结论AL患者PTENmRNA表达缺失是导致p-Akt高表达的关键因素之一，可能和急性白血病的发生发展有关。     

shRNA沉默RYBP基因表达对HL-60细胞增殖和凋亡的影响

Ring和YY1结合蛋白(RYBP)是生物进化过程中高度保守的转录抑制因子,目前认为是多梳(Polycomb group,PcG)蛋白家族成员,与白血病、淋巴瘤、宫颈癌等肿瘤的发生、发展和预后密切相关[1-3].我们在前期实验中发现白血病患者骨髓单个核细胞(MNC)和白血病细胞系HL-60、SHI-1和K562细胞明显地高表达RYBP,且慢性髓性白血病(CML)患者治疗达到完全缓解时骨髓MNC RYBP表达量明显下降,复发时再升高[4].说明RYBP基因的表达异常与白血病的发生、预后等有关.我们试图通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默HL-60细胞RYBP表达,观察HL-60细胞增殖与凋亡,进一步探讨RYBP在白血病发生发展中的作用.     

组蛋白去甲基化酶赖氨酸特异性去甲基化酶1在急性白血病的表达及其临床意义

本研究探讨组蛋白去甲基化酶赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)在急性白血病的表达及其临床意义。采用Western blot方法半定量检测LSD1在HL-60和SHI-1白血病细胞株、不同病情(初诊、完全缓解、复发)急性白血病(acute leukemia,AL)患者及非恶性血液病对照者骨髓单个核细胞的表达水平。随访收集AL患者的临床资料,分析LSD1表达与临床预后的关系。结果表明,HL-60细胞和SHI-1细胞LSD1均呈阳性高表达,LSD1相对含量(LSD1/β-actin灰度比)分别为4.647±3.840和1.628±0.185(n=4);72例AL患者LSD1表达程度差异较大,阳性率为56.9%(41/72),LSD1相对含量平均为1.053±1.976;17例非恶性血液病对照组LSD1阳性率为0%,LSD1相对含量为0.004±0.012。LSD1阳性率在急性髓系白血病(AML)或急性淋巴细胞白血病(ALL)患者初诊组(90.4%,77.8%)与难治/复发组(100%,100%)均高于完全缓解(CR)组(4.7%,0%)(p=0.000);LSD1相对含量在AML与ALL患者初诊组之间(1.177±1.646,1.275±1.845)、难治/复发组之间(2.050±2.470,4.107±3.676)或CR组之间(0.029±0.033,0.019±0.024)差异无统计学意义(p>0.05);AL患者LSD1阳性率在初诊组(84.6%)与难治/复发组(100%)均高于CR组(3.8%),LSD1相对含量在初诊组(1.274±1.760)、难治/复发组(3.359±3.319)及CR组(0.027±0.031)均高于对照组(p<0.01),其中难治/复发组高于初诊组与CR组(p<0.01),初诊组高于CR组(p<0.01)。结论:LSD1过高表达与AL难治/复发有关,其表达水平能反映AL患者的病情,可成为对AL预后有提示作用的生物学标志。     

抑癌基因PTEN mRNA在白血病细胞中的表达及意义

目的了解白血病细胞中PTEN基因的表达情况及其与临床的关系。方法采用RT-PCR法检测5个白血病细胞系,31例慢性粒细胞白血病(CML),87例初诊急性白血病(AL)[包括59例急性髓系白血病(AML),26例急性淋巴细胞白血病(ALL),2例急性混合细胞白血病],21例完全缓解期急性白血病(AL-CR)患者骨髓标本中PTEN mRNA表达情况,并分析了与临床指标的相关性。结果PTEN基因在K562细胞中有表达,而在Kasum i-1、HL-60、U937、Nalm-1细胞中均无表达。CML组阳性率(61.29%)与正常对照组(78.57%)相比,差异无统计学意义(P>0.05),AL组和AL-CR组阳性率(分别为18.29%和42.86%)均低于正常水平(P<0.01和P<0.05),AL组阳性率又低于AL-CR组(P<0.05)。PTEN基因的阴性表达与外周血高白细胞计数(≥20×109/L)、染色体异常呈显著的正相关。结论AL患者存在PTEN基因的表达缺失,PTEN基因在AL的发病中可能起一定作用。     

骨髓增生异常综合征PTEN基因表达和Akt磷酸化水平的相关性研究

目的 了解骨髓增生异常综合征（MDS）PTEN基因表达和Akt磷酸化（p-Akt）水平之间的关系，探讨MDS演进、高风险转归为急性髓系白血病的机制。方法 采用RT-PCR检测白血病细胞株K562、Jurkat，65例MDS患者骨髓细胞PTENmRNA表达情况。同时用流式细胞术检测Jurkat、HL-60细胞和30例MDS患者骨髓细胞p-Akt水平。并以21份正常人骨髓标本为健康对照。结果 ①PTEN基因阳性对照K562细胞呈阳性表达，阴性对照Jurkat细胞无表达。65例MDS患者中有27例表达阳性，阳性率41．5％，与健康对照组（85．7％）比较差异有统计学意义（P〈0．01）。RAEB（39．1％）、RAEB—t（27．8％）和MDS—AML（12．5％）PTEN阳性率均低于RA／RARS（75．O％）组，各亚型组之间比较差异有统计学意义（P〈0．01）。②阳性对照Jurkat细胞高表达p-Akt（86．9％），阴性对照HL-60细胞p-Akt阴性。30例MDS患者p-Akt水平升高（1．35％～58．23％），与健康组（0．54％～2．34％）比较差异有统计学意义（P〈0．01），且随着原始细胞比例增高p-Akt水平升高。MDS患者PTEN基因表达缺失率与p-Akt阳性率呈显著正相关（r=0．93，P〈0．01）。结论 MDS患者PTEN基因表达缺失是导致p-Akt高表达的关键因素之一，并且可能加速MDS病程进展及转化为急性髓系白血病。     

下调miR-125b逆转白血病细胞对多柔比星的耐药作用

目的:探讨下调miR-125b是否能逆转人白血病多柔比星耐药细胞株的耐药性,为白血病耐药患者寻找新的治疗方法。方法:应用实时荧光定量PCR方法检测白血病非耐药细胞株HL-60和K562及对应多柔比星耐药细胞株HL-60/DOX和K562/DOX中miR-125b的表达情况;采用电穿孔转染法上调或者抑制HL-60/DOX细胞中miR-125b的表达水平,随后采用CCK-8法检测不同浓度多柔比星处理后细胞的存活情况,绘制细胞增殖抑制率曲线并计算半数抑制浓度(IC50)。结果:与非耐药细胞株HL-60和K562相比,耐药细胞株HL-60/DOX和K562/DOX中miR-125b的表达水平明显升高。miR-125b在HL-60/DOX细胞中的表达水平比HL-60细胞中高15倍,其在K562/DOX细胞中的表达水平比K562细胞中高5倍。在耐药细胞系HL-60/DOX中过表达或抑制miR-125b的表达发现,转染miR-125b模拟物的细胞较对照组细胞的增殖抑制率显著降低(P 0. 01),而转染miR-125b抑制剂的细胞较对照组细胞的增殖抑制率显著升高(P 0. 01)。结论:miR-125b在白血病多柔比星耐药细胞株HL-60/DOX和K562/DOX中高表达。下调miR-125b的表达可逆转HL-60/DOX细胞对多柔比星的耐药性。     

基质细胞衍生因子-1受体CXCR7在急性白血病细胞的表达及意义

目的研究基质细胞衍生因子-1(SDF-1)受体CXCR7在急性白血病(AL)细胞株和AL患者骨髓细胞中的表达及意义。方法使用RPMI-1640培养基培养人单核细胞白血病细胞株(THP-1细胞)、人原髓细胞白血病细胞株(HL-60细胞)和人T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat细胞),分离急性髓系白血病(AML)患者和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者和正常人骨髓单个核细胞,抽取新鲜骨髓2 ml/(人)份,分为ALL组、AML组和正常组,用流式细胞仪和Western blot法观察各组CXCR7蛋白的表达情况。结果 1)CXCR7表达水平:THP-1细胞为(69.05±3.04)%,HL-60细胞为(20.17±1.53)%,Jurkat细胞为(3.41±2.46)%,THP-1细胞表达高于HL-60细胞(P0.01),而HL-60细胞表达又明显高于Jurkat细胞(P0.01)。2)CXCR7表达水平:AML组为(19.03±3.84)%,ALL组为(3.34±1.71)%,正常组为(2.40±1.27)%,AML组与正常组、ALL组相比,CXCR7表达水平明显增加(P0.01),ALL组与正常组对比,差异无统计学意义(P0.05)。结论 AML患者和HL-60细胞的CXCR7表达均明显增高,提示其在AML的发生、发展中可能具有有重要作用,并可能成为1种新的血液肿瘤诊断及治疗的思路和靶点。     

CYP3A5参与急性白血病耐药机制的研究

目的探讨细胞色素P4503A亚家族多肽5(CYP3A5)在急性白血病(AL)耐药机制中的作用。方法RT-PCR、免疫组化、MTT法检测白血病细胞株、AL患原代细胞CYP3A5转录表达与细胞株对化疗药物敏感性、患化疗疗效及预后的相关性，检测化疗药物对CYP3A5的转录调控；构建CYP3A5重组质粒稳定转染HI，60细胞，观察细胞对化疗药物的敏感性是否改变。结果转录CYP3A5的K562、U937细胞与不转录CYP3A5的NB4、HL-60细胞相比，对柔红霉素明显耐受(耐药倍数均为2．1倍)；原发耐药组患初治时CYP3A5阳性率(17．2％)显高于持续完全缓解(CCR)组(0．4％)与继发耐药组初治时(5．4％)，早期复发组第1次完全缓解(CR1)时阳性率(23．9％)显高于CCR组CR时(1．3％)；柔红霉素可诱导K562／A02、HL-60／ADR细胞CYP3A5转录；HL-60细胞稳定转染CYP3A5重组质粒后明显耐受柔红霉素、长春新碱(耐药倍数分别为3．0，4．0倍)。结论白血病细胞表达CYP3A5可能使其原位代谢多种化疗药物，是直接导致AL耐药的机制之一。     

曲古菌素A诱导急性髓系白血病细胞表达共刺激分子CD80和CD86的研究(英文)

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)诱导急性髓系白血病细胞表达共刺激分子CD80和CD86。方法:应用流式细胞仪检测TSA诱导急性髓系白血病患者单核细胞、HL-60细胞和K562细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;应用RT-PCR分析CD80和CD86 mRNA表达情况;在75 Gy照射TSA诱导的HL-60细胞和K562细胞后,应用CCK-8检测共刺激分子表达提高后HL-60细胞和K562细胞对健康人单核细胞的增殖作用。结果:TSA上调HL-60细胞表达CD86,也可上调急性髓系白血病患者单核细胞表达CD86,但TSA不能上调K562细胞表达CD86,TSA诱导HL-60细胞和K562细胞后,提高表达CD86的HL-60细胞对健康人单核细胞有增殖作用,而K562细胞无此作用。结论:TSA诱导HL-60细胞和急性髓系白血病患者单核细胞表达共刺激分子CD86,促进健康人单核细胞的增殖作用。     

RYBP基因沉默对HL-60细胞对化疗药物敏感性的影响

目的:用RNA干扰技术探讨白血病HL-60细胞株RYBP基因沉默后对化疗药物敏感性的影响。方法:构建针对RYBP基因的shRNA干扰质粒并建立稳定沉默RYBP基因的白血病HL-60细胞株,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测确认RYBP基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果。然后用DNA ladder及Annexin V标记的流式细胞术检测各组HL-60细胞凋亡的情况,用CCK-8法检测各组HL-60细胞对化疗药物阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性。结果:成功构建的RYBP shRNA慢病毒载体能够有效沉默HL-60中RYBP基因的表达。在没有加入化疗药物时RYBP shRNA组凋亡率低于空载体对照组(NC组)(P0.05);用阿糖胞苷处理时RYBP shRNA组凋亡率和抑制率均低于NC组(P0.05);用柔红霉素处理时RYBP shRNA组凋亡率虽然低于NC组,但是抑制率差异不明显。结论:HL-60细胞RYBP基因沉默能抑制细胞的凋亡,明显降低对阿糖胞苷的敏感性,但是对柔红霉素敏感性的改变不明显。     

白血病患者WT1基因表达的研究

目的：探讨WT1基因与白血病发病的关系和临床意义。方法：采用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－巢式PCR）方法检测了K562和HL－60两个白血病细胞系、49例急性白血病（AL）患者、33例慢性髓系白血病（CML）患者和25例正常对照的WT1基因表达。结果：K562和HL－60两个白血病细胞系、29例初治或复发AL患者中有21例、20例完全缓解（CR）期AL中有1例、18例CML急变期中有15例、5例CML加速期中有1例、10例CML慢性期患者中有1例表达WT1基因。WT1基因表达见于所有AL亚型，其相对水平与急性白血病的CR率有相关性。≥1．0的患者CR率低及生存期短。在CML中WT1基因表达表现出明显的阶段性，与慢性粒细胞白血病临床阶段及病情进展有关。结论：WT1基因表达与白血病发生有关，WT1基因高表达的患者CR率低、无病生存期短，可作为判断急性白血病预后和监测微量残留病的一项指标，也可作为CML急变的一项诊断指标。     

肿瘤相关基因fgfr3mRNA在白血病细胞中的表达及其临床意义

本研究旨在了解白血病细胞中fgfr3基因的表达水平及其和临床的关系。应用RT—PCR法检测4个白血病细胞系及96例白血病患者和14例对照者骨髓样本中fgfr3mRNA的表达，并分析了其与临床指标及染色体异常的相关性。96例白血病患者包括36例AML，29例ALL和31例CML。结果表明：fgfr3基因在K562和U937细胞中有表达，而在HL-60和SHI-1细胞中无表达。AL组和CML组fgfr3基因的阳性率（分别为46．15％和51．61％）与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。AML组和ALL组fgfr3基因的阳性率（分别为44．44％和48．28％）均高于对照水平，差异有统计学意义（p〈0．05）。fgfr3基因的阳性表达与外周血高白细胞计数（≥20×10^9／L）呈显著性正相关（P〈0．05）。ALL患者中fgfr3基因的表达与bcr／abl融合基因的异常呈显著正相关（r=0．151，P〈0．05）。而AL患者fgfr3基因的阳性表达与染色体预后分组无显著相关性。结论：AL和CML患者均存在fgfr3基因的过表达，提示fgfr3基因可能参与了AL和CML的发病。     

Wt1反义寡核苷酸阻断白血病微小残留病wt1基因表达的体外研究

本研究通过wt1反义寡核苷酸(ASO)抑制wt1基因的表达,观察微小残留病模型及患者基因表达的变化。取56例复诊急性白血病完全缓解(CR)患者骨髓,用RT-PCR方法筛选出wt1基因表达阳性的骨髓标本。白血病细胞系微小残留病(MRD)模型及筛选出的wt1阳性急性白血病CR患者骨髓标本进行了细胞培养并用wt1ASO处理细胞,观察wt1基因表达的变化。结果表明:wt1基因的敏感性是10-3-10-4;56例急性白血病CR患者骨髓wt1基因的表达阳性率为16%。用wt1ASO处理wt1表达阳性的K562、HL-60细胞系MRD模型以及9例存在MRD的急性白血病CR患者骨髓,发现wt1ASO组有效的阻断了wt1基因的表达,而正义寡核苷酸组和对照组wt1基因的表达仍为阳性。结论:wt1ASO体外能够阻断白血病MRD中残留白血病细胞wt1基因的表达。     

白血病细胞TGFβ1及其受体基因表达与白血病患者血清TGFβ …

目的：研究转化生长因子β（ＴＧＦβ１）对白血病细胞增殖抑制作用的机制及急性白血病患者血清ＴＧＦβ１变化及意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应方法检测白血病细胞的细胞因子及其受体基因表达；应用白血病细胞集落试验测定ＴＧＦβ１对ＨＬ－６０、ＤＡＭＩ、Ｋ５６２细胞增殖作用；应用ＥＬＩＳＡ方法测定３３例急性白血病患者血清ＴＧＦβ１水平。结果：ＴＧＦβ１对ＨＬ－６０、Ｋ５６２、ＤＡＭＩ细胞增殖具有明显的抑制     

急性髓系白血病Kindlins和血管生成素表达研究

本研究旨在探讨不同白血病细胞系、成人急性髓系白血病Ang-1、Ang-2、Tie-2、Kindlin-2、Kindlin-3的表达情况及其意义。采用RQ-PCR方法检测88例AML患者、9例非肿瘤患者(对照组)以及K562、KG-1a、U937、HL-60、Jurkat细胞株中Ang-1、Ang-2、Tie-2、Kindlin-2、Kindlin-3表达水平,分析阳性率及表达水平在AML患者与对照组间的差异,探讨上述5种基因之间及其与AML分型、预后的关系。结果表明,Ang-1,Ang-2,Kindlin-3在K562、KG-1a、HL-60、U937、Jurkat细胞系中均有表达,Tie-2仅表达于KG-1a、HL-60细胞系中,Kindlin-2表达于K562、KG-1a、HL-60中。5种基因均表达于AML患者及对照组中。Ang-1、Ang-2在起病时白细胞计数较高组的表达水平较高(P<0.001,P=0.001),在伴有t(8;21)和t(15;17)的AML患者中表达均较低(P<0.001,P=0.005)。Ang-1在NCCN预后良好组表达较低(P=0.020);Ang-1低表达组完全缓解率(CR)较高(P=0.027)。Kindlin-2在AML患者中表达水平较低(P=0.010),起病时白细胞计数较高组的表达水平较低(P=0.020),伴有t(8;21)和t(15;17)AML的表达均较高(P=0.016),治疗缓解后Kindlin-2及Kindlin-3表达明显升高(P<0.001,P=0.004)。结论:Ang-1与AML不良预后因素相关;Kindlin-2在AML中低表达,与AML良好预后因素相关,可能是一个预后较好的标志。     

造血系统肿瘤WT1基因启动子区域DNA甲基化及其调控的研究

目的 应用聚合酶链反应（PCR）的实验方法研究白血病细胞系中WT1基因启动了区域的DNA甲基化水平，及其与WT1基因表达的关系。方法 ①采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR（Methylation-spectific PCR，MSP）技术检测8226、HL-60、Jurkat、KG-1及Raji等血液系统肿瘤细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态；②以5-杂氮脱氧胞嘧啶（5-aza-CdR）对U937细胞系进行去甲基化处理，并观察WT1基因表达水平的改变。结果 ①HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1表达水平高，而8226、Jurkat、Raji、U266和U937细胞系WT1表达水平则极低，同时检测到在8226、Jurkat、Raji、U266和U937这5个细胞系存和WT1基因启动子区域DNA高甲基化；②经去甲基化处理后，U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者上升，同时伴随着WT1启动子区域DNA甲基化水平的下降和未甲基化水平的升高。结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一。     

人急性单核细胞白血病细胞系SHI-1在裸鼠体内的高致瘤性及其机制的初步研究

本研究确定人急性单核细胞白血病细胞系SHI-1在裸鼠体内的高致瘤性,并对其成瘤机制进行初步探讨。将SHI-1细胞接种至裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况;取肿瘤组织行病理检测、R显带核型分析;RT-PCR检测MLL-AF6融合基因和VEGF基因的转录;明胶酶谱法检测培养上清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和MMP-2的表达;体外穿膜实验观察迁移能力。结果表明：注射SHI-1细胞的16只裸小鼠均于皮下出现肿块;瘤体由白血病细胞组成;注射的裸鼠中有MLL/AF6融合基因和VEGF基因的转录;在无血清培养上清中MMP-9和MMP-2的表达明显高于对照细胞;SHI-1细胞有较强的迁移能力,MMP-2的阻断抗体可显著抑制其体外迁移能力。结论：SHI-1在裸鼠体内有极高的成瘤率,其机制可能与p53基因的异常、高水平VEGF基因的转录、金属蛋白酶的高表达和较强的体内浸润能力有关。