利用酵母双杂交系统筛选Pak4相互作用蛋白质

目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选信号转导分子Pak4相互作用蛋白.方法 将Pak4激酶域序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒.质粒转化到酵母感受态AH109和Y187中验证蛋白表达.将人胎脑cDNA文库转化酵母Y187,与已转化诱饵质粒的AH109酵母进行交配实验.交配子在SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板上筛选,阳性克隆质粒酶切鉴定.结果 成功构建了pGBKT7-Pak4 KD诱饵质粒,Western blot证实其在酵母菌AH109和Y187中表达,筛选了多个与Pak4相互作用的阳性转化子.结论 利用酵母双杂交系统筛选出Pak4相互作用蛋白质.     

酵母双杂交筛选PA28γ相互作用蛋白

目的通过酵母双杂交筛选与蛋白酶体激活因子3(PA28γ)相互作用的肝细胞蛋白,为研究其在肝癌的发生发展中的作用机制提供新依据。方法通过酵母双杂交技术,构建PGBKT7-PA28γ蛋白酶体激活因子酵母双杂交诱饵载体,以PA28γ为诱饵,在人类肝细胞cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白,并将部分阳性基因构建表达载体后与PA28γ共转染于AGS细胞进行初步验证。结果筛选出32个阳性克隆,其中有5个与肝癌细胞周期及凋亡密切相关,如ZPR9。将PWPI-PA28γ和Pcmv-myc-ZPR9共转染AGS细胞,检测发现PA28γ含量与ZPR9负相关。结论成功筛选到一些与肝癌细胞周期及凋亡相关的蛋白,为研究其机制提供了良好的线索和基础。     

酵母双杂交文库筛选HBX相互作用蛋白*

目的：筛选鉴定新的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B viral X protein,HBX）相互作用蛋白。方法：以HBX为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4 DBD（DNA binding domain）融合表达,将人肝脏cDNA文库编码的蛋白与GAL4的AD区（activation domain）融合表达。通过酵母双杂交筛选鉴定肝脏中与HBX相互作用的蛋白。筛选得到的阳性酵母转化子,经质粒提取和测序后,分析其所包含的序列编码的蛋白,通过再次验证,初步确定该蛋白是否与HBX具有相互作用。结果：筛选得到5个潜在的能与HBX相互作用的蛋白。结论：通过酵母双杂交cDNA文库筛选,得到多个潜在的HBX相互作用蛋白,进一步的验证及功能研究将对揭示HBX促进肝癌发生的机制起到重要的推动作用。     

酵母双杂交系统筛选FOXP3的相互作用蛋白

目的 利用酵母双杂交系统筛选与人FOXP3相互作用的蛋白.方法 应用酵母双杂交系统,将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-FOXP3,与转化了成人肝cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与FOXP3相互作用的蛋白,通过一对一的回复性杂交实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析.结果 经过酵母双杂交共获得最终确认3个阳性克隆,测序后经生物信息分析为肿瘤蛋白D52、分裂因子3b及未知蛋白.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与FOXP3相互作用的3个蛋白,它们可能与Treg细胞的发育分化及其功能有关.     

酵母双杂交筛选TEB4相互作用蛋白

目的 酵母双杂交筛选与TEB4(MARCH-VI)有相互作用的蛋白,构建该蛋白基因序列的重组栽体.方法 以人TEB4为诱饵质粒,利用酵母双杂交技术筛选人淋巴瘤cDNA文库.在SD/-4培养基上共获得150多个阳性克隆,将酵母菌扩增后抽提质粒,转化大肠杆菌,进行序列分析,并经过回复杂交验证,发现了一个与TEB4相互作用的蛋白:ATP synthase F0 subunit 6(ATP-C6).PCR法扩增ATP-C6,亚克隆到质粒pCMV-HA中,获得重组质粒pCMV-HA-ATP-C6,酶切和测序进行鉴定.结果 从人淋巴瘤cDNA文库筛选到一个与TEB4有相互作用的蛋白ATP-C6,并成功构建重组质粒pCMV-HA-ATP-C6. 结论应用酵母双杂交系统从人淋巴瘤cDNA文库中筛选并初步验证了与TEB4有相互作用的蛋白,为TEB4蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

酵母双杂交筛选锥虫早老素蛋白相互作用蛋白

目的 筛选寻找锥虫早老素蛋白相互作用蛋白,以了解锥虫早老素蛋白功能.方法 体外表达锥虫早老素蛋白片段,装入pGBKT7诱饵质粒,与随机肽库系统共转化酵母,筛选阳性克隆并测序,通过与基因库锥虫功能序列比较,推导可能的相互作用蛋白.结果 获得108个阳性克隆,对其中50个进行了序列测定和比较,获得最有可能的4个候选基因,分别为:丝/苏氨酸性磷酸酶2b催化亚基A2;钙激活蛋白,含锚蛋白重复序列蛋白以及一个具有与APP跨膜区结合位点特征序列的功能未知蛋白.结论 成功利用随机肽库酵母双杂交系统筛选锥虫早老素蛋白相互作用基因,其相互作用仍有待进一步确认.     

酵母双杂交RRS筛选系统对已知蛋白间相互作用的验证

目的:通过一对已知蛋白Pak和Chp间的相互作用介绍酵母双杂交RRS筛选系统,以期将此系统更广泛的用于蛋白间相互作用的研究.方法:挑选酵母温度缺陷株cdc25-2的低回复突变单克隆,醋酸锂法制备酵母感受态细胞.重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak 单独转化酵母,排除诱饵蛋白的白激活作用.将两重组质粒Met425-Myc-Ras-Pak和Ura-M-ChpAc共转化酵母,设置不同质粒组合和不同培养基平板作为对照,观察酵母在36℃的生长情况.结果:制备感受态的cdc25-2细胞无回复突变发生.质粒Met425-Myc-Ras-Pak转化酵母后对细胞既无毒性也无自激活作用.只有当能够表达两已知蛋白的重组质粒共转化酵母,并且在适合它们表达的培养基上,cdc25-2细胞才能够在36℃生长.结论:(1)RRS筛选系统正确验证了Pak和Chp间的相互作用,可将其用于其它已知蛋白间相互作用的研究.(2)可以利用某已知蛋白构建诱饵,通过RRS筛选系统去寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白.     

酵母双杂交技术筛选与HCMV-UL146编码产物相互作用蛋白

目的 应用酵母双杂交技术,在人胎脑文库中筛选与人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) UL146基因编码蛋白相互作用蛋白,以探讨HCMV-UL146的生物功能.方法 应用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-UL146诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人胎脑cDNA文库质粒的酵母相互作用,于涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌,提取质粒DNA进行测序分析.结果 pGBKT7-UL146构建成功.经严格筛选,共有200余个阳性克隆,分离测序80个克隆,成功筛选出30个与HCMV-UL146特异性相互作用的蛋白.结论 HCMV-UL146与多种蛋白有相互作用,提示其生物学功能复杂.此结果为进一步研究HCMV-UL146基因功能提供依据.     

酵母双杂交筛选与分化抑制因子Id1′相互作用的蛋白

目的 筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子Id1′相互作用的蛋白。方法 构建重组诱饵质粒pHybLex／Zeo-Id1′，转化入酵母细胞EGY48／pSH18．34，检测重组质粒有无非特异激活报告基因；通过筛选成人肺组织文库，获取真阳性文库质粒，进行测序和同源性比较，获得真阳性克隆。结果 经测序证实，重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1′构建成功；将重组质粒转化入酵母细胞：EGY48／pSH18-34，经检测无非特异激活功能。进一步通过对文库进行筛选，获得一个真阳性克隆，通过测序和同源性比较证实该阳性克隆是酪氨酸蛋白激酶Fyn。结论 分化抑制因子Id1′与Fyn在酵母细胞中存在相互作用。     

应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索.方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109.毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象.将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质.结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用.结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性.     

FXR2酵母双杂交饵载体的构建及酵母菌转化

目的构建FXR2酵母双杂交系统的“饵”质粒，并转化酵母菌，为筛选FXR2P互作蛋白作基础。方法提取pMD18-T—FXR2，酶切后将FXR2基因连接到MATCHMAKER LexA Two—Hybrid System中的plexA质粒上，得到“诱饵”(Bait)-plexA—FXR2，导入大肠杆菌扩增，筛选阳性克隆并提取重组Bait质粒，再转入酵母菌EGY48(p8op—lacZ)。结果通过遗传学方法筛选得到构建成功的plexA—FXR2；通过营养缺陷筛选，证明Bait重组质粒转入酵母菌中。结论成功构建Bait质粒并使酵母菌转化。     

应用酵母双杂交筛选与FAM172A相互作用蛋白的研究

目的 应用酵母双杂交技术（蛋白与蛋白的相互作用）,筛选人胎脑cDNA文库中与FAM172A蛋白相互作用的蛋白,为深入研究新发现的蛋白质FAM172A生物学功能及在疾病中的作用奠定基础.方法 构建pGB-FAM172A诱饵质粒,转化酵母菌株Y190.人胎脑cDNA转化诱饵酵母菌,于营养缺陷型培养基（SD/-Leu/-Trp/-His）上生长,从中筛选到35个单克隆进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验,对蓝色克隆者进行质粒抽提,转入大肠杆菌DH/OB,进行抗性筛选,从中提取质粒,一对一与诱饵质粒pGB-FAM172A共转酵母细胞Y190,进行验证鉴定,提取质粒DNA进行测序并进行BLAST比对分析.结果 成功构建pGB-FAM172A质粒,经严格筛选,共有10个阳性克隆,分别进行测序、序列比对,成功筛选出6个与FAM172A存在相互作用的蛋白：RTCD1、MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2和TOX2.结论 利用酵母双杂交系统筛选出6个可能与FAM172A相互作用的蛋白,为进一步研究FAM172A蛋白的生物学功能提供了线索.     

Screening of FOXP3-interacted proteins by yeast two-hybrid technique

Objective： To screen the proteins interacting with the Treg specification factor forkhead box protein P3 （FOXP3） by yeast two-hybrid system, Methods： Human FOXP3 gene was amplified by nest RT-PCR from peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and inserted into plasmid pGBKT7 to construct the bait vector, then the self-activation and toxicity of the bait vector in host yeast strain AH109 were observed. Thereafter, a human liver cDNA library was screened by the bait vector. The positive clones were selected out by nutrient-deficient culture and back-hybridizing. The sequences from the candidate positive clones were blasted and analyzed by bioinformatics methods. Results： The constructed bait vector encoding FOXP3 was found no self-activation and toxicity in yeast AH109. Three proteins which interacted with FOXP3, including tumor protein D52, splicing factor 3b subunit 1 and hypothetical protein, were identified. Conclusion： Three new candidate proteins interacting with FOXP3 are selected out by this yeast two-hybrid system and library, which may facilitate the further study of FOXP3 in Treg.     

Gene polymorphisms of interleukin-28, p21-activated protein kinases 4, and response to interferon-α based therapy in Chinese patients with chronic hepatitis B

Background  Peg-Interferon-α treatment is expensive and associated with considerable adverse effects, selection of patients with the highest probability of response is essential for clinical practice. The objective of this study was to assess the relationship between the gene polymorphisms of interleukin-28 (IL-28), p21-activated protein kinase 4 (PAK4) and the response to interferon treatment in chronic hepatitis B patients.

Methods  Two hundred and forty interferon-naive treatment HBeAg seropositive chronic hepatitis B patients were enrolled in the present prospective nested case-control study. Peripheral blood samples were collected, including 92 with favorable response and 148 without response to the interferon treatment. Rs8099917, rs12980602, and rs9676717 SNP was genotyped using matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).

Results  IL-28 genotype was not associated with response to interferon treatment (OR for GT/GG vs. TT, 0.881 (95% CI 0.388-2.002); P=0.762; OR for CT/CC vs. TT, 0.902 (95% CI 0.458–1.778); P=0.766). Rs9676717 in PAK4 genotype was independently associated with the response (OR for CT/CC vs. TT, 0.524 (95% CI 0.310–0.888); P=0.016). When adjusting for age, gender, smoking, drinking, levels of hepatitis B virus DNA, and alanine aminotransferase (ALT), rs9676717 genotype TT appeared to be associated with a higher probability of response for interferon treatment (OR, 0.155 (95% CI 0.034-0.700); P=0.015).

Conclusion  Genotype TT for rs9676717 in PAK4 gene and no drinking may be predictive of the interferon-α treatment success.

     

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

目的：构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6 为模板,PCR扩增出 PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达, 采用Western blotting 法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000 bp）和PAK6 1-55(165 bp)、PAK6 56-210(465 bp)、PAK6 211-410（600 bp）及PAK6 385-681（891 bp） 4个片段。Western blotting检测, PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。     

PAK5在肿瘤组织中的研究进展

PAK5为PAKs (p21活化的激酶)家族中新近发现的成员,PAKs在细胞骨架重组、细胞增殖、细胞侵袭转移、基因转录及细胞凋亡等一系列的细胞功能中发挥着重要的调控作用.PAKs是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过与Rac和Cdc42结合而激活发挥作用.PAKs作为小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化.近来研究表明,PAK5在神经源性肿瘤、胃肠癌、骨肉瘤及卵巢上皮癌等过表达.本文就PAK5的结构、表达部位和功能及影响肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和凋亡,影响肿瘤耐药的作用等方面综述.     

野生型和失活型PAK1基因自我抑制域的GST标签真核表达载体的构建及表达

目的：构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1 AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义。方法：以pcDNA3.1HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT)PAK1 AID片段,再以此片段为模板采用大引物法扩增其突变体L107F片段,双酶切克隆至GST融合的真核表达载体pEBG。将质粒转染至工具细胞HEK293中,并经免疫印迹鉴定GST融合蛋白的表达。结果：PCR扩增出约200 bp大小的野生型和失活型PAK1 AID片段,双酶切得到与预期大小相符的载体与PAK1 AID片段,野生型与失活型pEBG-PAK1在工具细胞HEK293中表达,蛋白的相对分子质量均为33 000。结论：成功构建野生型和失活型PAK1基因 AID的GST标签真核表达载体,并表达出不同活性的GST-PAK1 AID的融合蛋白。     

P21活化激酶6在前列腺癌组织中的表达及意义

目的：探讨P21活化激酶6（PAK6）在前列腺癌（PCa）中的表达和意义。方法：应用免疫组织化学的sP法,检测前列腺癌（PCa）组织及前列腺增生（BPH）组织中PAK6的表达,探讨PAK6蛋白表达与PCa的关系。结果：PAK6在BPH组织和PCa组织中均有阳性表达。二者中PAK6阳性表达率差异有统计学意义（P〈0．05）。后者PAK6表达阳性率随分化程度升高。结论：PAK6阳性表达程度与PCa分级有关,捉示它在PCa的发病中可能扮演重要角色,检测PAK6变化对判断PCa生物学行为有参考价值。