树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

以PAC和BAC克隆为探针筛选cDNA文库

目的 建立噬菌体Ｐ１衍生的人工染色体（ＰＡＣ）和细菌人工染色体（ＢＡＣ）筛选人正常肝ｃＤＮＡ文库的方法,并期望分离到与肝癌相关的新基因。方法 用位于１７ｐ１３．３肝癌杂合性缺失区内的ＰＡＣ５７９和ＢＡＣ１５２９克隆为探针,以噬菌斑杂交筛选人正常肝ｃＤＮＡ文库,并对分离出的ｃＤＮＡ阳性克隆进行部分测序和计算机序列比较及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,进一步确定可能与肝癌相关的新基因。结果 以ＰＡＣ５７９为     

饰胶蛋白（Decorin）基因的cDNA克隆与表达

目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因ｃＤＮＡ克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用ＰＣＲ技术从Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库获得饰胶蛋白全长基因ｃＤＮＡ片段。并克隆到ｐＵＣ１９载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列,将测序正确的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－１表达载体中,经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后１．２％凝胶电泳鉴定,ＩＰＴＧ诱导表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果 克隆的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中ＡＦ１３８３００记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值（６５．６ＫＤ）也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了ＧＳＴ－Ｄｅｃｏｒｉｎ融合蛋白。     

血清脂质和脂质过氧化物及超氧化物歧化酶水平与冠状动脉…

作者测定了５０例冠心病（ＣＡＤ）患者及６０例下深的血清总胆固醇（ＴＣ），甘油三酯（ＴＧ）６高密度脂蛋白胆固醇（ＨＤＬ－Ｃ），载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ），ａｐｏＢ，以及脂质过氧化物（ＬＰＯ）红细胞超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的含量，结果表明，ＣＡＤ患者与正常人相比，ａｐｏＢ及ＬＰＯ水平明显增高（Ｐ均〈０．０１），ＨＤＬ－及ａｐｏＡＩ水平明显降低（Ｐ均〈０．０１）；ａｐｏＡＩ，ａｐｏＢ，ＨＤＬ－Ｃ及ＬＰＯ     

动脉粥样硬化患者血脂水平观察及临床意义──附100例临床分析

对１００例动脉粥样硬化（ＡＳ）患者（其中冠心病６０例，脑卒中４０例）测定血清脂蛋白（ａ）（Ｌｐ（ａ）），载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ），载脂蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）及其他血脂，并与对照组１００例健康体检者作比较。结果表明：ＡＳ组Ｌｐ（ａ）水平较对照组有显著差异（Ｐ＜０．０１）；ＡＳ组高Ｌｐ（ａ）检测率较对照组亦有显著差异（Ｐ＜０．０１）；ＡＳ组Ｌｐ（ａ）升高与ａｐｏＡＩ呈负相关；与胆固醇（Ｃｈ）、甘油三酯（ＴＧ）、ａｐｏＢ均无相关性。提示Ｌｐ（ａ）是诊断ＡＳ的敏感指标，亦是ＡＳ的独立危险因素，人群中检测Ｌｐ（ａ）对预测心脑血管疾病有重要意义。     

人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2基因的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶－２（ＭＡＳＰ－２）编码区基因。方法采用 ＲＴ－巢式 ＰＣＲ技术从 人胎肝组织总ＲＮＡ扩增目的cＤＮＡ片段,克隆人ｐＧＥＭ－Ｔ载体,酶切图谱分析和测序鉴定。结果获得了编码合信号 顺序的ＭＡＳＰ－２肽链全长cＤＮＡ,将其与pＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－２的重组克隆。酶切图 谱与微机分析结果无异;序列分析表明,与报道的人 ＭＡＳＰ－２ｃＤＮＡ序列一致。结论成功克隆了人 ＭＡＳＰ－２基因,为深 入研究补体凝集素途径的激活机制和甘露聚糖结合凝集素基因突变引起免疫缺损的发病机制奠定了基础。     

Dnmt3b cDNA及其在小鼠胚胎组织中选择剪接异构体的克隆

目的 克隆与小鼠胚胎发育相关的新的新的全长ｃＤＮＡ。方法 从小鼠胚胎ｃＤＮＡ文库中筛选出一个新的ＥＳＴ,以８～９ｄ齿小鼠胚胎组织ｍＲＮＡ为模板进行ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）,结合ＰＣＲ筛选ｃＤＮＡ文库,获得共全长ｃＤＮＡ序列后进行序列同源检索、结构分析和功能预测。整合后的ｃＤＮＡ两上物进行ＲＴ－ＰＣＲ,克隆ＰＣＲ产物,并对产物进行全序列测定,验证整     

人类白细胞介素2基因重组子cDNA功能片段的碱基序列分析

应用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法，对本室构建的人类白细胞介素２基因重组子ｐＲＥＴ－９０的４４０ｂｐｃＤＮＡ功能片段（ＮｃｏＩ克隆点的ＨｇｉＡＩ－ＤｒａＩ片段）进行ＤＮＡ碱基序列分析。结果表明：白细胞介素２ｃＤＮＡ功能片段按照正确的方向和翻译顺序连接在载体ｐＥＴ３ｄ的ＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ切点之间。     

转基因小鼠人载脂蛋白AI基因表达对血浆高密度脂蛋白的影响

目的研究载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏＡＩ）基因表达调控对血浆高密度脂蛋白（ＨＤＬ）代谢的影响。方法采用已建立的含小鼠金属硫蛋白Ｉ（ＭＴ－Ｉ）启动子的人ａｐｏＡＩ转基因Ｃ５７ＢＬ／６小鼠系,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测锌诱导前后人ａｐｏＡＩ基因整合和表达的情况。结果转基因小鼠整合４～１５拷贝的人ａｐｏＡＩ基因。人ａｐｏＡＩ基因主要在肝和肾中表达,经重金属锌诱导后,人ａｐｏＡＩ基因可在肝、小肠及肾中高效表达。转基因鼠血浆总ａｐｏＡＩ水平比对照组明显增高,其中人ａｐｏＡＩ水平经锌诱导后增高约４６％。与对照组相比,血浆ＨＤＬ水平在锌诱导前后分别增高约４７％和１０３％。转基因鼠ＨＤＬ和人ａｐｏＡＩ水平间呈显著正相关（ｒ＝０．８５,Ｐ＜０．０１）。结论ＡｐｏＡＩ对血浆ＨＤＬ水平升高有重要的调节作用,该转基因鼠是进一步研究ａｐｏＡＩ在高脂血症时对脂质代谢的影响和抗动脉粥样硬化（ＡＳ）作用机制的理想动物模型     

高血压病患者胰岛素抵抗对脂质代谢的影响及其临床意义

本文对５９例高血压病（ＥＨ）病人及２３名正常对照者进行血清胰岛素（ＩＳ）水平、血糖（ＳＧ）、总胆固醇（ＴＣ）、甘油三酯（ＴＧ）、载脂蛋白Ａ_１（ａｐｏＡ_１）、载脂蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）及心电图的检测，使用一个新引进的胰岛素敏感性指数（ＩＡＩ）即：空腹血浆ＩＳ与ＳＧ乘积的倒数观察其胰岛素敏感性。结果显示：ＥＨ病人普遍存在胰岛素抵抗（ＩＳＲ）、高胰岛素血症（ＨＩＳ）和脂质代谢紊乱，而且伴有心电图缺血改变的ＥＨ者较心电图正常的ＥＨ者上述改变更严重。提示ＩＳＲ引起的脂质代谢紊乱对动脉粥样硬化（ＡＳ）及冠心病（ＣＨＤ）的发病具有重要的临床意义。     

北京鸭载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的:克隆不易感动脉粥样硬化动物北京鸭载脂蛋白AI的基因。方法:分离提取北京鸭肝组织mRNA,以此为模板,反转录构建了鸭肝组织cDNA文库。利用制备的兔抗鸭载脂蛋白AI(apoAI)多抗血清为探针筛选该文库,获得10个阳性克隆,测序及序列分析。结果:包括18bp、240bp组成的5’和3’非翻译区,792bp组成的一个完整开放阅读框架,编码264个氨基酸的鸭apoAI前体,含18个氨基酸构成的信号肽、6个氨基酸的原肽片段和240肽的成熟蛋白。推译出的成熟肽与鸭apoAI氨基酸的直接测序结果完全一致。该新基因已被GenBank接受。Northern blot显示鸭apoAI mRNA不仅主要在肝和小肠组织表达;而且不同于人和哺乳类动物,亦可少量在脑、肾、肌肉组织分布。结论:结果为进一步研究不易感动脉粥样硬化动物北京鸭apoAI基因组结构、功能及其抗动脉硬化机制奠定了基础。     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

THE TREE SHREW APOLIPOPROTEIN C-I cDNA：SEQUENCE AND ITS EXPRESSION

A rabbit anti-serum to tree shrew apolipoprotein C-I (apo C-I) was used to screen an expression cDNA li-brary constructed by us from tree shrew (TS) liver tissue. Two apo C-I cDNA clones were obtained. The longerone consists of 380 nuclcotides, including 21 bp and 95 bp at the 5‘‘ and 3‘‘ and of the non-translated regions respectively, and a 264-bp fragment in an open reading frame encoding 88 amino acids prepropeptide which conrains 26 amino acids of signal peptide and a mature protein (62 amino acids). Comparing the amino-acid sequence deduced from this cDNA with those of the published mammalian apo C-Is reveals that it shared some struc-tural similarity with rat, mouse and dog ape C-I, but it had 5 more amino acids than that of human and baboon.The expression of ape C-I mRNA in 8 different tissues were also assayed with Northern blot. The results demonstrated that liver had the highest expression, intestine had much less expression and no expression in other tissues,which is much different from human and other species. This study has laid down a good foundation for further studying on the function and the stucture of tree shrew apo C-I gene.     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

阴道毛滴虫衰老相关基因Tv-Sir2-like克隆与序列分析

目的：克隆单细胞模式生物阴道毛滴虫(Tv)Sir2基因，以便探讨其功能。方法：构建Tv cDNA表达文库，筛选出Tv-Sir2-like基因，并对该基因进行序列分析。结果：成功克隆Tv-Sir2-1ike基因。测序及序列分析显示，Tv-Sir2-1ike如基因开放读码框长1116bp，编码371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与SIR2的同源性最高，并具有SIR2 3个特征性的高度保守结构域。结论：推测Tv-Sir2-like是Sir2的同源基因，其表达产物可能参与Tv转录沉默，并调节Tv的细胞周期。