载脂蛋白A—I对内皮细胞粘附分子表达的影响

载脂蛋白ＡＩ(ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ)是高密度脂蛋白(ＨＤＬ)中主要的载脂蛋白,它是否与ＨＤＬ一样,具有抑制内皮细胞粘附分子表达的作用。本实验以培养的人脐静脉内皮细胞为材料,研究ａｐｏＡＩ对粘附分子ＶＣＡＭ1、ＩＣＡＭ1、ＥＬＡＭ1表达的影响。一、材料与方法1载脂蛋白ＡＩ(ａｐｏＡＩ)的制备:见参考文献[1]。2人脐静脉内皮细胞的培养:胶原酶消化法分离人脐静脉内皮细胞,加入含质量分数为02的胎牛血清的Ｍ199培养基(美国ＧＩＢＣＯ公司)。取2～3代细胞分别用于流式细胞术和ＲＴＰＣＲ实验。在培养基中加入不…     

树鼩载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的克隆不易感动脉粥样硬化动物树（ｔｒｅｅｓｈｒｅｗ,ＴＳ）载脂蛋白ＡＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＩ,ａｐｏＡＩ）的基因,比较分析其结构特点。方法以提取的肝组织ｍＲＮＡ为模板,反转录构建了ＴＳ肝组织ｃＤＮＡ文库。利用制备的兔抗ＴＳ载脂蛋白ＡＩ多抗血清为探针筛选该文库,对阳性克隆进行测序、序列分析及组织表达实验。结果克隆获得了ＴＳａｐｏＡＩｃＤＮＡ序列,全长序列由９００个核苷酸构成,包括２８ｂｐ组成的５′非翻译区;７９５ｂｐ组成的一个完整开放阅读框架,编码翻译２６５个氨基酸的ＴＳａｐｏＡＩ前体（含１８个氨基酸构成的信号肽、６个氨基酸的原肽片段及２４１肽的成熟蛋白）;两个终止密码ＴＧＡ、ＴＡＡ和随后７２ｂｐ的３′非翻译区。新基因已被ＧｅｎＢａｎｋ接受。对编码蛋白质的亲疏水性分析表明ＴＳａｐｏＡＩ的疏水性强于人的相应蛋白。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ显示ＴＳａｐｏＡＩ基因主要在肝脏和小肠组织表达。结论获得了不易感动脉粥样硬化动物ＴＳａｐｏＡＩ的新基因,编码的蛋白质结合胆固醇及胆固醇酯的能力可能大于人的ａｐｏＡＩ。     

北京鸭载脂蛋白AI cDNA的克隆及其组织表达

目的:克隆不易感动脉粥样硬化动物北京鸭载脂蛋白AI的基因。方法:分离提取北京鸭肝组织mRNA,以此为模板,反转录构建了鸭肝组织cDNA文库。利用制备的兔抗鸭载脂蛋白AI(apoAI)多抗血清为探针筛选该文库,获得10个阳性克隆,测序及序列分析。结果:包括18bp、240bp组成的5’和3’非翻译区,792bp组成的一个完整开放阅读框架,编码264个氨基酸的鸭apoAI前体,含18个氨基酸构成的信号肽、6个氨基酸的原肽片段和240肽的成熟蛋白。推译出的成熟肽与鸭apoAI氨基酸的直接测序结果完全一致。该新基因已被GenBank接受。Northern blot显示鸭apoAI mRNA不仅主要在肝和小肠组织表达;而且不同于人和哺乳类动物,亦可少量在脑、肾、肌肉组织分布。结论:结果为进一步研究不易感动脉粥样硬化动物北京鸭apoAI基因组结构、功能及其抗动脉硬化机制奠定了基础。     

肌注前列腺素提高非繁殖期树Ju的受孕率

为研究前列腺素（PG）对于提高非繁殖期树Ju发情及受孕率的作用，对野外捕获的笼养雌性树Ju肌注PG，并与雄性树Ju交配，结果能明显地提高树Ju的发情和受孕率。这为实验室大规模繁殖树Ju提供了实验依据。     

抗乙肝表面抗原中草药的筛选（体外及树Ju动物试验）

目的：筛选具有抑制乙型肝炎表面抗（HBsAg）活性的中草药，方法：体外试验采用反向间接血凝法，动物实验采用本室自己建立的乙型肝炎树Ju感染模型，结果：通过体外试验，从200种常用中草药中筛选出具有较明显抑制HBsAg活性的5种药物，它们分别是珍珠草（叶下珠）、桑椹子，五倍子，丹参和仙茅，这5种药物可使HBsAg滴度从1：32768降至1：16。进一步在树Ju体内进行抗乙肝病毒抑制试验，仅有珍珠草和五倍子有清除HBsAg的作用。结论：体实验及动物实验均表明珍珠草及五倍子有较强抗HBsAg作用，值得进一步作临床疗效的评价。     

树鼩肝组织cDNA文库的快速构建

目的:为了研究不易感动脉粥样硬化动物树鼩多种载脂蛋白的基因分子结构,我们在国内外首次快速构建了树鼩肝细胞cDNA文库。方法:采用一步法提取树鼩肝细胞总RNA;以寡核胸苷酸为吸附介质,柱层析法进一步纯化mRNA。以此为模板,利用改良的cDNA快速合成方法,反转录合成树鼩肝细胞cDNA第一、二链。对cDNA双链末端修饰,连接含双酶切位点的连接子后重组于噬菌体载体。结果:包装后获得2.1×10~6高滴度的树鼩肝细胞cDNA文库,放射自显影显示合成的cDNA产物大小在400～5000个核苷酸之间,该文库的克隆重组率为98.5％以上,PCR扩增随机提取的白色噬菌斑DNA,电泳鉴定均有cDNA插入片段。以制备的两种多价抗血清为探针,从构建的cDNA文库中筛选克隆出完整的树鼩apoAI和apoCI的cDNA核苷酸序列。结论:与常规方法比较,本法简便、快速,易于操作和掌握。本研究还对应用此方法构建cDNA文库的某些环节进行了探讨。     

树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA和蛋白质序列结构分析

目的克隆获得树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶cDNA序列并进行结构分析。方法以树鼩肝脏mRNA逆转录出的Ⅰ链cDNA为模板,运用SMARTRACEPCR扩增技术,扩增得到树鼩卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)cDNA序列,并推导出LCAT氨基酸序列。利用分子生物学软件DNAMAN对氨基酸序列的一、二级结构及主要结构域进行分析和比较。结果树鼩LCATcDNA序列由1340个核苷酸构成,开放阅读框架1320bp,编码440个氨基酸的LCAT前体(含24个氨基酸构成的信号肽和416个氨基酸组成的成熟蛋白)熏3'非翻译区18bp,终止密码TAA,加尾信号AATAAA和一个25bp的poly(A)尾。树鼩LCATcDNA序列已作为新基因被GenBank接受,登记号AF272861。树鼩与人和狒狒LCATcDNA的同源性分别为90%和89%。结论树鼩LCATcDNA序列与人及其他实验动物高度同源。     

树鼩胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的　获得不易感动脉粥样硬化动物树胆固醇酯转运蛋白 (CETP)的cDNA和蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法　以从树肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板 ,应用SMART RACE技术 ,获得了树CETP的cDNA序列 ,并推导出其蛋白质氨基酸序列 ,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果　获得的树CETPcDNA(在GenBank中的注册号为AF334 0 33)长 16 36bp ,编码 485个氨基酸 ,其成熟蛋白由 477个氨基酸组成 ,比人多一个氨基酸 (Gly318) ,该蛋白与人、家兔的同源性分别为 88%和 82 %。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守 ,但在Asn34 2位的N 糖基化位点缺失 ,可能使其转运胆固醇酯的活性增加 ,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较 ,初步分析了树CETP蛋白与功能相关的结构特点。结论　树CETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一     

树Qu胆固醇酯转运蛋白的cDNA和蛋白质结构分析

目的 获得不易感动脉粥样硬化动物树Qu胆固醇酯转运蛋白（CETP）的cDNA和蛋白质序列,分析其结构特点,寻找其可能的抗动脉粥样硬化分子机制。方法 以从树Qu肝脏mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART－RACE技术,获得了树QuCETP的cDNA序列,并推导出其蛋白质氨基酸序列,应用分子生物学软件对该蛋白的一级、二级结构进行分析和比较。结果 获得的树QuCETP cDNA（在GenBank中的注册号为AF334033）长1636bp,编码485个氨基酸,其成熟蛋白由477个氨基酸组成,比人多一个氨基酸（Gly318),该蛋白与人、家兔的同源性分别为88％和82％。序列中与CETP结合和转运中性脂质功能相关的区域均非常保守,但在Asm342位的N－糖基化位点缺失,可能使其转运胆固醇酯的活性增加,利于外周组织和血浆中的胆固醇及其酯的清除。通过对不同种属蛋白序列的比较,初步分析了树QuCETP蛋白与功能相关的结构特点。结论 树QuCETP糖基化的特点有可能是该动物对动脉粥样硬化具有不易感性的分子机理之一。     

人颗粒溶解素cDNA克隆及在大肠埃希菌中的表达

目的：构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA原核表达载体并进行表达。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得颗粒溶解素cDNA，克隆到pGEM-T载体，测序正确后，再亚克隆到质粒pGEX-4T1中，构建重组表达载体pGEX-4T1-granulysin，并转化大肠埃希菌DH5α，诱导GST-granulysin融合蛋白表达。结果：诱导含重组表达载体pGEX-4T1-granulysin的大肠埃希菌DH5α后，免疫印迹显示出一条相对分子量(Mr)为44000的蛋白条带。结论：获得了颗粒溶解素与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。     

2型糖尿病患者中载脂蛋白M与脂蛋白a、载脂蛋白AI的关系研究

目的研究2型糖尿病患者中载脂蛋白M（apolipoprotein M，apoM）与脂蛋白及其他载脂蛋白的相关关系。方法用dot-blotting法检测73例2型糖尿病患者（36男37女）血浆中apoM的水平，酶法及比浊法检测糖尿病患者血浆中载脂蛋白AI（apoAI）、载脂蛋白B（apoB）、脂蛋白a[Lp（a）]、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）以及空腹血糖（Glu），ELISA法测定血浆中瘦素的含量，对apoM与其它脂蛋白、载脂蛋白、瘦素的关系作相关性分析。结果男性病例中，apoM负相关于甘油三酯（r=-0．3648，P=0．0287），但与年龄成正相关（r=0．3752，P=0．0264）。女性病例中apoM负相关于血浆Lp（a）水平（r=-0．4420，P=0．0070），正相关于apoAI／apoB（r=0．4583，P=0．0043）。男女病例混合分析发现，apoM负相关于Lp（a）（r=-0．3385，P=0．0030），正相关于apoAI（r=0．2321，P=0．0466）、瘦素（r=0．247l，P=0．0326）和年龄（r=0．2420，P=0．0352）。结论apoM负相关于Lp（a），正相关于apoAI、apoAI／apoB，提示了apoM可能是抑制动脉粥样硬化的保护因子。如果体内apoM与apoAI同时升高，可能会降低体内Lp（a）水平。     

树鼩Retn基因的克隆及序列测定

目的 克隆树鼩(Tupaia belangeri)Retn基因,为在树鼩中开展Retn相关研究提供实验资料.方法 在树鼩脂肪组织中抽提总RNA,用RT-PCR进行基因扩增,通过基因克隆、重组质粒的酶切鉴定,对Retn克隆质粒的序列测定和分析.结果 抽提的总RNA完整性较好,RT-PCR产物电泳检测得到了目的条带,重组克隆质粒经Pst I单酶切证明了Retn基因已克隆至质粒载体,测序获得了363个核苷酸序列,1个编码114个氨基酸的开放阅读框,序列提交GenBank,登录号为JF267792;经Blast软件进行序列分析,其核苷酸序列和氨基酸序列与鼠类的同源性分别为95％和99％.结论 成功克隆了树鼩Retn基因及序列测定,为树鼩Retn基础数据的建立和开展相关研究提供了实验资料.     

奥司他韦在树鼩体内的药动及药效学应用研究

目的探讨奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数特征,以及在树鼩体内的抗流感病毒药效作用。方法树鼩经口服磷酸奥司他韦后取血浆用于药代动力学分析,并与人、雪貂、小鼠、大鼠的药代动力学参数比较;树鼩经鼻接种感染人流感病毒A/California/04/2009 H1N1和禽流感病毒H9N2突变株Y280-PB2-E627K,给予奥司他韦治疗,观察鼻腔症状,收集感染后第1,3和5天鼻灌洗液及沉淀分别行病毒TCID50检测和细胞分类计数,检测感染后21 d血清中和抗体滴度。结果奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数为:Cmax:1. 34μg/m L,Tmax:0. 75h,T1/2:2. 03 h,AUC0-12:1. 76 mg·h/liter。奥司他韦对感染A/California/04/2009 H1N1病毒的树鼩鼻腔排毒抑制作用不明显,但高剂量组奥司他韦可明显抑制感染H9N2 Y280-PB2-E627K病毒树鼩第1天的鼻腔排毒,减少第3天鼻灌洗液中细胞总数。感染A/California/04/2009 H1N1病毒后产生的抗体效价明显高于H9N2 Y280-PB2-E627K禽流感病毒的抗体效价,奥司他韦抗病毒治疗对感染同一病毒各组间血清抗体效价无影响。结论奥司他韦在树鼩体内的药代动力学参数不同于人或雪貂等模型动物,但其药物血浆清除半衰期和达峰时间与小鼠相近;药效学方面奥司他韦可有效抑制感染H9N2 Y280-PB2-E627K流感病毒树鼩的鼻腔病毒排毒和炎症反应。