重组RA538、反义c-myc腺病毒对正常细胞作用的研究

了解重组ＲＡ５３８、反义ｃ－ｍｙｃ腺病毒载体对正常细胞的影响。方法：采用形态学观察、ＭＴＴ、ＲＴ－ＰＣＲ等方法,对腺病毒介导ＲＡ５３８及反义ｃ－ｍｙｃ基因对正常人胚肺成纤维细胞的影响进行研究。结果以Ａｄ－ＬａｃＺ进行组腺病毒转导效率检测发现腺病毒２ＢＳ细胞具有很高的转导效率,ＡｄＲＡ５３８、Ａｄ－ＡＳｃ－ｍｙｃ对正常人胚肺２ＢＳ细胞无生长抑制及凋亡诱导作用,同时Ａｄ－ＲＳ５３８对２ＢＳ内源性ｃ－ｍ     

N—ras和C—myc反义寡核苷酸与p53和p16基因联合抑制人肝 …

目的：研究反义癌基因与抑癌基因联合抑制肝癌细胞生长的效果。方法：利用基因重组方法构建携带ｐ１６基因、ｐ５３基因的融合表达载体（ｐｃＤＮＡ１６￣５３）,利用基因合成仪体外合成Ｎ－ｒａｓ、Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸、并将Ｎ－ｒａｓ,Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸与ｐｃＤＮＡ１６￣５３融合表达载体转染到人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１细胞中,观察肝癌细胞生长情况及软琼脂集落形成能力。结果：联合治疗组肝癌细胞增殖速度最慢     

反义寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖

目的 证实反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的效应。方法 人工合成正义、反义及错配反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸,转入体外培养的ＶＳＭＣ中,分别于作用后１～５ｄ进行细胞计数和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定。结果加入反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸的ＶＳＭＣ增殖受到抑制,崦正义和错配反义寡核苷酸对ＶＳＭＣ增殖没有明显影响。结论 反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸可有效阻遏     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

为研究硫代磷酸修饰的反义ｃｍｙｃ寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）的增殖、迁移及凋亡的影响。应用脂质体分别介导硫代磷酸修饰的反义ｃｍｙｃＯＤＮ、正义ｃｍｙｃＯＤＮ和错配ｃｍｙｃＯＤＮ进入体外培养的大鼠主动脉ＳＭＣ内，观察其对ＳＭＣ细胞ｃｍｙｃ表达、增殖、迁移和凋亡的影响。结果：①反义ＯＤＮ降低ｃｍｙｃ蛋白的表达。②反义ｃｍｙｃＯＤＮ抑制ＳＭＣ增殖、迁移，并诱导ＳＭＣ凋亡。而正义ＯＤＮ及错配ＯＤＮ则无上述作用。结果提示：应用反义技术抑制ｃｍｙｃ表达在防治经皮腔内冠状动脉成形术（ＰＴＣＡ）术后再狭窄中具有潜在作用。     

腺病毒介导的人p27kipl基因高表达对大鼠血管平滑肌细胞增殖？…

ｐ2 7ｋｉｐ1是近年发现的一个细胞周期负调节物 ,可以抑制细胞周期由Ｇ0 /Ｇ1期向Ｓ期过渡 ,本实验中我们构建了含人ｐ2 7ｋｉｐ1ｃＤＮＡ的重组腺病毒载体并将此在体外转染原代培养的大鼠血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣ) ,以此观察外源性ｐ2 7ｋｉｐ1基因导入对ＶＳＭＣ细胞周期及增殖的抑制作用。一、材料与方法1 主要试剂 :人全长ｐ2 7ｋｉｐ1ｃＤＮＡ由纽约ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒＭａｓｓａｇｕｅ博士惠赠 ;真核表达载体ｐＣＩｃｃ、Ｅ1区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ由日本东京大学Ｓａｉ…     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

反义C—myc寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC—7721的生长抑制

针对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ第二外显子起始妈ＡＵＧ及下游４个密码子设计合成了反义、正义及锚配寡核苷酸（ＯＤＮｓ）、并对合成的ＯＤＮｓ进行 硫代磷酸化修饰。在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１培养体系中，对反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）抑制细胞增殖的作用进行了研究。发现（１）与正义和错配ＯＤＮｓ相比较，反义Ｃ－ｍｙｃＯＤＮ有明显抑制人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１生长的作用；（２）该生长抑制作用随ＡＳＯＤＮ剂量增加而增     

c-myc反义寡核苷酸对低氧内皮细胞条件培养液诱导的肺血管周细胞增殖的影响

应用细胞培养、核酸斑点杂交、~３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（~３Ｈ－ＴｄＲ）掺入、免疫细胞化学、图像分析等技术观察ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对低氧内皮细胞条件培养液（ＨＥＣＣＭ）诱导的大鼠肺血管周细胞ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达及~３Ｈ－ＴｄＲ掺入量的影响。结果表明,ＨＥＣＣＭ显著促进周细胞 ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、ＰＣＮＡ表达（Ｐ＜０．０１）及~３Ｈ－ＴｄＲ掺入量增加（Ｐ＜０．０１）,反义ＯＤＮｓ显著阻抑 ＨＥＣＣＭ诱导的周细胞ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达、ＰＣＮＡ表达（Ｐ＜０．０１）及~３Ｈ－ＴｄＲ掺入量增加（Ｐ＜０．０５）,而同义ＯＤＮｓ无上述作用（Ｐ＞０．０５）。结果提示,ＨＥＣＣＭ可通过上调ｃ－ｍｙｃ基因表达促进肺血管周细胞增殖,反义ＯＤＮｓ通过下凋ｃ－ｍｙｃ基因表达,抑制ＨＥＣＣＭ诱导的肺血管周细胞增殖。     

8—Br—cAMP对肺癌NSCLC—3细胞凋亡相关基因表达的影响

目的：观察８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人肺癌ＮＳＣＬＣ－３细胞凋亡相关基因表达的影响。方法：将体外培育的ＮＳＣＬＣ－３细胞分为实验组和对照组,采用原位杂交方法观察８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对ＮＳＣＬＧ－３细胞ｃ－ｍｙｃ、ｂｃｌ－２基因表达的影响。结果：８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ处理后的实验且较未加８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ的对照组－ｃ－ｍｙｃ,ｂｃｌ－２基因表达降低（Ｐ〈０．０１）。结论：８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ可下调与ＮＳＣＬＣ－３     

C-myc反义寡脱氧核苷酸抑制人乳腺癌细胞系生长的研究

采用胎盼蓝染色法，３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验和流式细胞计数分析技术研究了ｃ－ｍｙｃｍＲ－ＮＡ帽区反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系增殖及其ｃ－ｍｙｃ蛋白表达的影响，结果表明：ｃ－ｍｙｃ反义寡脱氧核苷酸能抑制人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系生长和增殖，这种抑制作用有明显的剂量依赖性，同时也能抑制ＭＣＦ－７细胞ｃ－ｍｙｃ蛋白的表达。此外，本文对ｃ－ｍｙｃ基因调控细胞增殖及反义核苷酸的可能机制进行了探讨。     

携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法　将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果　成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论　构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础     

携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的 构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究.方法 将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70.结果 成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109.HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论 构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础.     

携带表皮生长因子受体反义cDNA的重组腺病毒的构建

目的构建携带参与细胞周期调控的表皮生长因子受体(EGFR)反义cDNA的重组腺病毒载体。方法将1032 bp EGFR反义cDNA片段正向及反向插入腺病毒载体质粒pA dT rack-CM V上,与骨架质粒在大肠杆菌B J5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带EGFR反义cDNA的重组腺病毒A dE asy-GFP-EGFR-sense/an tisense。结果成功地构建了A dE asy-GFP-EGFR-sense/an tisense的重组腺病毒载体系统,经测定腺病毒载体滴度分别2.2×109efu/mL和2.5×109efu/mL。结论构建的重组腺病毒A dE asy-GFP-EGFR-an t-isense可望有效地将EGFR-an tisense cDNA基因导入喉癌细胞株/组织内,为进一步研究喉癌细胞信号转导干预机制和治疗研究提供实验基础。     

重组Lac-Z、反义c-myc腺病毒载体的增殖及鉴定

目的：建立重组反义c-myc腺病毒载体（Ad-AS-c-myc）、LacZ腺病毒（AD-Lac-Z）的增殖的方法。方法：对培养的293细胞转染重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体,使重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体在293细胞内大量复制,及时收集病变细胞,反复冻融以释放293细胞中的病毒载体,过滤除细胞碎片,利用倍比稀释法测定病毒载体滴度。PCR技术对扩增重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体进行鉴定。结果：利用293细胞扩增重组腺病毒载体,获得的Ad-AS-c-myc滴度为：2.3×109pfu/ml;Ad-LacZ滴度为：1.2×1010pfu/ml。在Ad-LacZ可见在800bp出现一特异性PCR扩增条带,为腺病毒特异扩增带。Ad-AS-c-myc在800及608bp处出现两条特异扩增条带,分别为腺病毒及反义c-myc特异扩增条带。结论：对转染的293细胞冻融后收集重组腺病毒载体具有高效、可靠、简便、相对经济实用的优点,有推广价值。     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

重组腺病毒介导的反义c-myc基因对HL-60细胞增殖及细胞周期的影响

目的:观察重组反义c-myc腺病毒(Ad-Asc-myc)对急性早幼粒白血病HL-60细胞周期及增殖的影响,探讨其作用的分子机制.方法:将Ad-Asc-myc与鱼精蛋白硫酸盐(Protamine sulfate)混合后转染HL-60细胞,MTF法观察细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞增殖周期,RT-PCR检测c-myc转录变化,免疫细胞化学检测c-myc及增殖细胞核抗原(PCNA)表达变化.结果:Ad-Asc-myc转染HL-60细胞后,细胞生长受抑,细胞周期呈现G1期延长、S期缩短,增殖指数逐渐下降,出现大量凋亡细胞.c-myc基因转录及表达下降,PCNA表达降低.结论:Ad-Asc-myc可使HL-60细胞的生长减缓,增殖能力降低,凋亡细胞增加.其生物学活性与HL-60细胞c-myc和PCNA表达受抑有关.     

腺病毒介导野生型p53基因对人肺腺癌细胞的抑制效应

目的：p53基因突变是人类肿瘤中常见的遗传学改变。将野生型p53基因导入一些肿瘤细胞中被证明能抑制其细胞增殖，因此做为肺癌基因治疗主要目的基因而备受关注。本研究旨在观察野生型p53基因对人肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制效应，并对其抑癌机制进行分析，为今后肺癌基因治疗的临床试验提供科学依据。方法：采用重组体腺病毒Ad-p53基因转染人肺腺癌细胞系GLC－82；以裸鼠皮下移植瘤治疗试验观察Ad-p53基因的抑瘤效应；用流式细胞计数，DNA片断化及TUNEL分析探讨Ad-p53基因的抑癌机制。结果：导入Ad-p53基因后人肺腺癌GLC－82细胞生长能力显著下降，克隆形成能力受到明显抑制；并显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长；肺癌细胞发生凋亡，并出现明显的G1期阻滞现象。结论：腺病毒介导野生型p53基因（Ad-p53)对人肺腺癌细胞和裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制效应，主要通过诱导癌细胞凋亡和参与细胞周期调控实现，进而提示Ad-p53基因有可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用。     

Gene therapy with antisense c-myc adenovirus for human gastric carcino- ma cell line in vitro and for implanted carcinoma in nude mice

Sufficient infonnation has been accumulated to suggest that achvation and alnplilication of oncogenes and inachvation and fUnchonal failme of tUInor suPPressor genesare responsible for the inihation and deVelopment of human malignant disease lhrough a mulhstep PIDCess['].Gastric careinoma, one Of the most common inalig~t tUmors, can be successop ~ with sopry inthe early stage, but adVanced cases are usually refectoryto chemotherapy or ladiotherapy. COnSeopenily, genetherapy becomes an at…