HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

克隆乙型肝炎病毒DNA在肝与肾细胞中复制与表达的研究

对比研究在外细胞培养系统中乙型肝炎病毒在肝,紧名的复制与表达。方法髟克隆ＨＢＶＤＮＡ分别转染ＨｅｐＧ２与２９３细胞系;ｐ１７７ｔｎ与ｐ３．８Ⅱ还转染了原代人胚肾细胞。培养后收集转染细胞培养上清液,用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ;提取转染细胞的ＤＮＡ与ＲＮＡ,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ与Ｎｏｒｈｅｒｎ印迹杂交检测细胞内ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＲＮＡ。结果转染ＨｅｐＧ２细胞,ＨＢｓＡｇ与ＨＢｅＡｇ均有     

溶血对乙型肝炎五项血清标志物测定的影响

溶血对乙型肝炎五项血清标志物测定的影响田万林余道军胡守峰为探讨溶血对酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）一步法、二步法测定乙型肝炎五项血清标志物（ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅ、抗ＨＢｃ）结果的影响，笔者对２６４例受检者溶血血清，分别用酶联免疫...     

乙型肝炎两对半在判断乙型肝炎病毒感染状态中的意义

乙型肝炎两对半在判断乙型肝炎病毒感染状态中的意义李银光崔继业＊周玲梅蒙黎（内蒙古自治区医院０１００１７＊内蒙古老年卫生科技工作者协会惠普医院）乙型肝炎“两对半”是指乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和乙型肝炎表面抗体（抗—ＨＢｓ或ＨＢｓＡｂ）为第一对；乙...     

ELISA法检测血清HBV－m的质量保证

ＥＬＩＳＡ法检测血清ＨＢＶ－ｍ的质量保证江苏省丹阳市人民医院凌蓉（丹阳２１２３００）乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）是导致乙型肝炎的病原体，且与肝炎的慢性化、肝硬化、肝癌的发生关系密切。因此，血清ＨＢＶ－ｍ（ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｅＡｇ、抗Ｈ...     

广州某机关工作人员乙型肝炎病毒感染情况调查

广州某机关工作人员乙型肝炎病毒感染情况调查某机关驻穗市区，工作人员乡长期居住在广州市属各区，每年均有少数人因患乙型肝炎住院治疗。调查８５６人，均采用固相放射免疫法（ＳＰＲＩＡ）检测ＨＢｓＡｇ、抗─ＨＢｓ和抗─ＨＢｃ。ＨＢｓＡｇ的Ｓ／Ｎ值＞５．０为阳性...     

288例胎盘血清乙型肝炎病毒标志物检测报告与分析

２８８例胎盘血清乙型肝炎病毒标志物检测报告与分析中国医科大学第二临床学院检验科（１１０００３）李韶英门永继为探讨胎盘血乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）推带情况，采用ＥＬＩＳＡ方法检测２８８例剖腹产胎盘血清中的ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢｅ、抗－...     

PCR法检测HBVDNA及其与乙肝病毒标志物关系探讨

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法检测２５６例乙型肝炎患者血清中乙肝病毒ＤＮＡ （ＨＢ－ＶＤＮＡ），同时用ＥＬＩＳＡ法检测乙肝病毒标志物，即ＨＢｓＡｇ，抗－ＨＢｓ，ＨＢｅＡｇ，抗－ＨＢｅ，结果表明ＨＢＶＤＮＡ的检出率与肝病临床类型无明显关系，而与乙肝病毒标志物的存在状态有关。乙肝五项病毒标志物不同组合状态，血清ＨＢＶＤＮＡ检出率不同，以ＨＢｓＡｇ（＋），抗－ＨＢｃ（＋），ＨＢｅＡｇ（＋）的组合形式检出率     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的免疫效果

用已构建的不同载体乙型肝炎。基因疫苗（ＰＣＲ３．１－Ｓ，ｐｃＤＮＡ３－Ｓ）和乙型肝炎Ｃ基因疫苗（ＰＣＲ３．１－Ｃ０分别给Ｂａｌｂ／ｃ小鼠多点肌肉注射，２周后追加免疫一次，用ＥＬＩＳＡ法及ＭＴＴＩ地分别检测小鼠血清抗－ＨＢｓ、抗－ＨＢＣ抗体及地ＨＢｓＡｇ或ＨＢｃＡｇ的特异性增殖反应。结果：免疫接种２周后小鼠血清抗－ＨＢＳ及抗－ＨＢＣ抗体ＯＤ值分别为０．８３７３和０．７９６１均明显高于对照组（０．１２     

HBV感染者血中大颗粒淋巴细胞的测定

分５组测定了乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染者血中大颗粒淋巴细胞（ＬＧＬ）的含量，每组各３０例。其中（１）组：乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）和核心抗体（ＨＢｃＡｂ）均为阳性；（２）组：为ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ阳性者；（３）组：为ＨＢｓＡｇ阳性、抗－ＨＢｅ和抗－ＨＢｃ阳性者；（４）组：为抗－ＨＢｓ阳性者；（５）组：为抗－ＨＢｓ和抗－ＨＢｅ阳性者。并且与对照组进行比较。结果表明，（１＿     

突变低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达

目的构建人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α的两种突变体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564A1a和pcDNA3.1^＋-HIF-1α-564A1a-803Ala，并检测它们在人肺微血管内皮细胞（HMVECs）中的表达。方法用定点突变的方法将pcDNA3．1^＋-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸（Pro）密码子CCC突变为丙氨酸（Ala）密码子GCC，构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上，仍然用定点突变的方法将pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺（Asn）密码子ATT突变为丙氨酸（Ala）密码子GCT，构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala-803Ala。将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs．以RT-PCR、免疫荧光法和Western blotting法分别对转染细胞进行表达分析。结果测序证实，定点突变成功，构建成重组真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1^＋-HIF-1α-564Ala-803Ala；3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA。但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加。结论成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体。     

突变低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1⁺-HIF-1α的两种突变体pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala-803Ala,并检测它们在人肺微血管内皮细胞(HMVECs)中的表达。方法 用定点突变的方法将pcDNA3.1⁺-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC,构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上,仍然用定点突变的方法将pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺(Asn)密码子ATT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT,构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala-803Ala。将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs,以RT-PCR、免疫荧光法和Westernblotting法分别对转染细胞进行表达分析。结果 测序证实,定点突变成功,构建成重组真核表达载体pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1⁺-HIF-1α-564Ala-803Ala;3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA,但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加。结论 成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体。     

超氧化物歧化酶(Val16Ala)基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的获得锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因并进行Val16Ala(GTT→GCT)位点的定点突变,构建MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因的真核表达载体。方法采用RT-PCR法从人乳腺癌细胞MCF-7中扩增MnSOD(Val)基因;PCR引物延伸法对Val16Ala进行定点突变以获得MnSOD(Ala)基因;通过EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切PCR产物与相应质粒pEGFP-N1连接构建两基因的真核表达载体pEGFP-N1-MnSOD(Val)和pEGFP-N1-MnSOD(Ala)。结果突变位点经测序证明正确,重组质粒经双酶切及测序鉴定证明正确。结论本实验成功获得了MnSOD(Val)及MnSOD(Ala)基因并成功构建了两基因的真核表达载体。     

鼻咽癌相关新基因NPCEDRG突变型重组表达载体的构建及生物信息学分析

目的 构建带His标签的突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体.方法 以pcDNA3.1-NPCEDRG重组质粒为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增NPCEDRG基因编码区,利用PCR过程中的碱基错配,随机突变产生NPCEDRG的突变体,分别将野生型及突变型NPCEDRG基因编码区cDNA插入pcDNATM3.1/myc-HisB真核表达载体,双酶切鉴定,测序验证,生物信息学方法进行蛋白质结构预测.结果 双酶切突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,均产生519 bp长度的目的 片断.测序结果证实,突变型NPCEDRG基因有两个点发生了突变,分别是T260-C260和T287-C287,但没有移码突变,在线生物信息学分析结果示其相应氨基酸序列改变为V73-A73和M82-T82;野生型NPCEDRG基因序列与Genebank已知序列一致.两个重组载体插入片段大小均为513 bp,插入方向及位置正确,能表达预期所要的融合蛋白.结论 成功构建了带His标签的突变型及野生型pcDNATM3.1/myc-HisB/NPCEDRG重组表达载体,为深入研究NPCEDRG基因功能和揭示鼻咽癌发病分子机制提供实验手段.     

蜂毒肽与变构hIL－2融合基因原核表达载体的构建

目的构建蜂毒肽与人变构白细胞介素－2原核表达载体,为进一步研究该融合基因而奠定基础。方法以本室构建质粒pGEX－4T-2／Melittin－IL－2（^88Arg）为模板,设计引物,用PCR定点突变的方法将IL-2部分的^125Cys突变为Ala,PCR产物与pMD18-T连接,转化大肠杆菌,小提质粒,DNA测序后再将目的片段连接于pET-15b,最后酶切鉴定。结果PCR产物542bp,构建质粒双酶切、DNA测序鉴定如预期。结论成功构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体。     

E Sequence Analysis of Persistently Infected Mutant Japanese Encephalitis Virus Strains

Persistent infection is liable to occur after most RNA viruses infect the host. This phenomenon may be related to the geno-variation of the structural proteins or non-structural proteins the viruses contain, which helps the viruses to escape the killing function of the host im- mune protective system[1]. Japanese encephalitis virus (JEV) is a single-stranded, positive-sense RNA virus, which belongs to flaviviruses family. The mortality of epidemic B encephalitis is as high as 30 %, and 50 …     

Association of β3 Adrenergic Receptor and Peroxisome Proliferator-activated Receptor Gamma 2 Polymorphisms With Insulin Sensitivity： A Twin Study

Objective To study the effect of β3 adrenergic receptor(β3AR) Trp64Arg and peroxisome proliferator activated receptor gamma 2(PPARγ2) Pro12Ala polymorphisms on insulin resistance. Methods One hundred and eight dizygotic twin pairs were enrolled in this study. Microsatellite polymorphism was used to diagnose zygosity of twins. Insulin sensitivity was estimated with logarithm transformed homeostasis model assessment(HOMA). PCR-RFLP analysis was performed to detect the variants. As a supplement to the sib-pair method,identity by state(IBS) was used to analyze the association of polymorphisms with insulin sensitivity. Results The genotype frequencies of Trp64Trg,Trp64Arg,and Arg64Arg were 72.3%,23.8%,and 3.9%,respectively,while the genotype frequencies of Pro12Pro,Pro12Ala,and Ala12Ala were 89.9%,9.6%,and 0.5%,respectively. For β3AR Trp64Arg the interclass co-twin correlations of Waist-to-hip ratio(WHR),blood glucose(GLU),and insulin(INS),homeostasis model assessment insulin resistance index(HOMA-IR) of the twin pairs sharing 2 alleles of IBS were greater than those sharing 0-1 allele of IBS,and HOMA-IR had statistic significance. For PPARγ2 Pro12Ala most traits of twin pairs sharing 2 alleles of IBS had greater correlations and statistic significance in body mass index(BMI),WHR,percent of body fat(PBF) and GLU,but there were low correlations of either insulin or HOMA-IR of twin pairs sharing 1 or 2 alleles of IBS. The combined effects of the two variations showed less squared significant twin-pair differences of INS and HOMA-IR among twins sharing 4 alleles of IBS. Conclusions β3AR Trp64Arg and PPARγ2 Pro12Ala polymorphisms might be associated with insulin resistance and obesity,and there might be slight synergistic effects between this two gene loci,and further studies are necessary to confirm this finding.     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和抗体反应

以构建的柯萨奇病毒Ｂ 组３ 型（ＣＶＢ３）ＶＰ１ 基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ 作为候选的基因疫苗,评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ,用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体,并能中和ＣＶＢ３ 毒力,起到基因疫苗的预防作用。     

1pcDNA3.1-Ercc6l真核表达载体的构建及在P19细胞内的表达

目的构建Ercc6l的正、反义真核表达载体,并在P19胚胎癌细胞内瞬时表达,在细胞学水平对基因功能进行初步研究。方法KpnⅠ/XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ercc6l获得目的基因Ercc6l,将其克隆到同样经过双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)Myc His6,重组质粒pcDNA3.1(+/-)-Ercc6l经菌落PCR和双酶切鉴定;脂质体介导法体外瞬时转染正义载体至P19细胞,RT-PCR检测基因在细胞内的表达活性情况。结果重组质粒经菌落PCR和KpnⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定,表明真核表达载体构建正确;脂质体介导法瞬时转染正义载体至P19细胞后,检测表明转染细胞能够表达Ercc6l。结论成功构建了Ercc6l正、反义真核表达载体,其正义载体转染真核细胞后能在其中表达。     

高亲和力抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体制备及检测变异HBsAg方法的建立

目的制备抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体,建立检测变异HBsAg的方法。方法用血源HB-sAg免疫BALB/c小鼠,制备可以识别变异HBsAg的抗-HBs单抗。筛选出可以较好识别变异HBsAg的单抗mAb1,优化该抗体ELISA检测HBsAg的方法,与2种HBsAg检测试剂比较检测变异HBsAg的能力。对6份临床样品进行检测及序列分析,以证实方法的可靠性。结果经过筛选,得到1种可以较好识别包括G145R在内的大多数变异HB-sAg的单抗。检测变异HBsAg的能力优于市售HBsAg诊断试剂。结论制备的单抗可以用于ELISA检测变异HB-sAg,减少HBsAg变异株的漏检率。