高转移人肝癌细胞系转移相关因子的表达活性(摘要)

目的　观察分析新建立的人肝癌转移细胞系 (ＭＨＣＣ97)转移相关因子ｍＲＮＡ和蛋白表达水平 ,以探讨其转移的可能机制。方法　利用裸鼠人肝癌转移模型 (ＬＣＩ Ｄ2 0 )的瘤组织 ,通过体外培养获得首株高转移人肝癌细胞系 ,除对其基本生物学特性进行观察外 ,还采用逆转录 聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)和免疫组织化学技术 (ＡＢＣ法 )观察转移相关因子在ＭＨＣＣ97细胞及其裸鼠肝内移植瘤和肺转移灶中的表达水平。结果　该细胞异种动物接种成瘤率和原位接种 (肝接种 )肺转移率为 10 0 % ;ＭＨＣＣ97细胞的整合蛋白α5、β1亚基、尿激酶型纤溶…     

裸鼠人肝癌原位移植转移模型的生长特性及转移潜能

为了研究癌转移的机理和筛选抗转移治疗因子，用原位移植方法建立了裸鼠人肝癌高转移模型ＬＣＩ－Ｄ２０。对该模型的体内生长与转移规律、缩主血清甲胎蛋白（ＡＦＰ）水平，不同植入环境对转移能力的影响进行了观察，并检测了其细胞形态学、染色体核型和ＤＮＡ含理。结果表明：由原位移植方法建立的裸鼠人肝癌转移模型，能在人体外模拟人肝癌转移的自然过程，是一株可供研究人肝癌转移问题的较为理想的模型。     

nm23/NDPK基因、整合蛋白、Ⅳ型胶原酶及尿激酶的表达与鼠肺癌转移的关系

观察肺癌ｎｍ２３／ＮＤＰＫ、整合蛋白、Ⅳ型胶原酶、尿激酶（ｕＰＡ）的表达与肺癌转移的相关性。方法以ＡＢＣ免疫组织化学染色，对不同转移力（由低到高依次为ＰＬＡ－８０１Ｃ、Ａｎｉｐ９７３、ＰＬＡ－８０１Ｄ及ＰＬＡ－８０１ＤＬ）４株人肺癌裸鼠移植瘤及８７例人肺癌临床标本作上述４种分子表达的观察，并在裸鼠体内观察整合蛋白β１抗体及其配体ＲＧＤ多肽对移植瘤生长及转移的影响。结果（１）人肺癌移植瘤与临床标本均呈ｎｍ２３／ＮＤＰＫ高表达，且与淋巴结转移无显著相关。（２）４株移植瘤总体上呈β１亚族整合蛋白低表达，且与淋巴结转移无显著相关。β１抗体及ＲＧＤ多肽对ＰＬＡ－８０１ＤＬ移植瘤的转移无明显影响。（３）人肺癌移植瘤及临床标本中Ⅳ型胶原酶的表达与其转移力呈显著正相关。（４）Ａ－ｎｉｐ９７３及ＰＬＡ－８０１ＤｕＰＡ阳性，而ＰＬＡ－８０１ＤＬ及ＰＬＡ－８０１Ｃ则ｕＰＡ阴性。结论肺癌中Ⅳ型胶原酶的表达与其转移力呈显著正相关；ｎｍ２３呈高表达，整合蛋白呈低表达，ｕＰＡ在不同瘤株的表达不一，但均与其转移无显著相关。     

不同转移特性人肺癌裸鼠移植瘤整合蛋白表达及其对移植瘤转移的影响

目的：观察人肺癌裸鼠移植瘤整合蛋白表达与其转移的相关性。方法：以ＡＢＣ免疫组化染色，对转移力由低到高依次为ＰＬＡ－８０１Ｃ、Ａｎｉｐ９７３、ＰＬＡ－８０１Ｄ、ＰＬＡ－８０１ＤＬ四株人肺癌裸鼠移植瘤作整合蛋白亚单位表达的观察，并在裸鼠体内观察整合蛋白β１抗体及其配体ＲＧＤ多肽对移植瘤生长及转移的影响。结果：四株移植瘤均呈α２、α５、α６Ｂ阴性。β１的表达除Ａｎｉｐ９７３呈强阳性、ＰＬＡ－８０１ＤＬ呈弱阳性外，也均呈阴性。但四株移植瘤除ＰＬＡ－８０１Ｃ外，其余３株均呈α６Ａ强阳性。β１抗体及ＲＧＤ多肽对ＰＬＡ－８０１ＤＬ移植瘤的转移不见明显影响。结论：４株人肺癌移植瘤总体上呈β１亚族整合蛋白低表达，表达水平与其转移无显著相关。     

不同转移特性人肺癌裸鼠移植瘤及临床标本Ⅳ型胶原酶的表达

目的：观察人肺癌移植瘤及临床标本中Ⅳ型胶原酶表达与其转移的相关性。方法：以ＡＢＣ免疫组化染色对四株不同转移特性人肺癌裸鼠移植瘤及８７例有或无淋巴的人示本进行Ⅳ型胶原酶表达的观察。四株移植瘤的淋巴结移率由低到高依次为ＰＬＡ－８０１Ｃ、Ａｎｉｐ９７３、ＰＬＡ－８０１Ｄ、ＰＬＡ－８０１ＤＬ。结果：Ａｎｉｐ９７３、ＰＬＡ－８０１Ｄ、ＰＬＡ－８０１Ｄｌ裸鼠移植瘤呈阳性反应，而ＰＬＡ－８０１Ｃ则呈阴性反应；人     

不同转移特性人肺癌裸鼠移植瘤整合蛋白表达及其对移植瘤转 …

目的；观察人肺癌裸鼠转移植瘤整合蛋白表达与其转移的相关性。方法：以ＡＢＣ免疫组化染色，对转移力由低到高依次为ＰＬＡ－８０１Ｃ，Ａｎｉｐ９７３，ＰＬＡ－８０１Ｄ，ＰＬＡ－８０１ＤＬ，四株人肺癌裸鼠移植瘤作整合蛋白亚单位表达的观察，并在裸鼠体内观察整合蛋白β１抗体及其配体ＲＧＤ多肽对移植瘤生长及转移的影响，结果：四株移植瘤均呈α２，α５，α６Ｂ阴性，β１的表达除Ａｎｉｐ９７３呈强阳性，ＰＬＡ－８０１Ｄ     

CD44v6,E—Cadherin表达与CNE—2Z—F1裸鼠移植瘤转移的关系

目的 探讨ＣＤ４４ｖ６，Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ表达与人鼻咽癌裸鼠移植瘤转移的关系。方法 分别将人鼻咽癌细胞克隆株Ｆ１在体外与鼠肺块共同孵育及胸内移植，然后将带瘤细胞肺块（Ⅰ组）和胸内瘤组织块（Ⅱ组）各行裸鼠皮下移植，并与瘤细胞悬液皮下移植瘤（Ⅲ组）比较，观察各组移植瘤转移特点。采用免疫组织化学技术检测各组移植瘤回复培养细胞ＣＤ４４ｖ６和Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ表达。结果 Ⅰ组和Ⅱ组皮下移植瘤的总转移率和     

癌基因H－ras、P53、C－erbB－2蛋白产物在克隆化肝癌裸鼠模型的表达

在建立不同克隆化肝癌裸鼠移植瘤株模型的基础上，用ＡＢＣ免疫酶标记法研究了癌基因Ｈ－ｒａｓ、Ｐ５３、Ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白在不同克隆化肝癌裸鼠移植模型瘤组织中的表达，同时也检测了ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＨＢｓＡｇ等的表达。结果表明：具有较强侵袭力和转移力的ＣＳ克隆株肝癌裸鼠移植瘤组织对Ｈ－ｒａｓ，Ｃ－ｅｒｂＢ－２癌基因蛋白产物呈阳性反应，对ＡＦＰ、Ｐ５３呈弱阳性反应；而侵袭力弱的ＣＢ克隆株肝癌裸鼠移植瘤组织仅对Ｃ－ｅｒｂＢ－２呈弱阳性反应；其母系肝癌细胞株对上述癌基因蛋白产物呈弱阳性表达。提示Ｈ－ｒａｓ和突变型Ｐ５３基因的异常表达确实与肿瘤转移有一定相关性。     

不同转移特性人肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及复制

以人肺巨细胞癌细胞纱ＰＬＡ－８０１的两个细胞克隆Ｃ株及Ｄ株，建立了ＰＬＡ－８０１Ｃ及ＰＬＡ－８０１Ｄ裸鼠皮下移植瘤模型，以人肺腺癌腺鼠植移瘤培养细胞Ａｎｉｐ９７３，复制了Ａｍｉｐ９７３裸鼠皮下移植瘤及腹水瘤模型，对其生物学特性进行了研究，这４株移植瘤模型的淋巴结及肺转移率由低高依次为ＰＬＡ－８０１Ｃ皮下瘤（０％，０％），Ａｎｉｐ９７３皮下瘤（８．６％，４．３％）Ａｎｉｐ９７３腹水瘤（１００％，１２     

白细胞介素4对几种肿瘤细胞系的生物调节作用

采用人重组白细胞介素４（ＩＬ－４）观察了对瘤细胞系的生物调节作用，包括对细胞增殖、分化、表面标志表达及细胞因子分泌的影响。９株不同类型的瘤细胞系对ＩＬ－４的增殖反应不同，即４／９抑制，３／９促进，２／９无影响。ＩＬ－４抑制Ｕ９３７的增殖与其促进细胞分化作用有关。对某些细胞系，ＩＬ－４能增强ＭＨＣＩ类、Ⅱ类及肿瘤相关抗原的表达。ＩＬ－４尚能抑制ＭＬＡ１４４的ＩＬ－２分泌。初步结果表明，ＩＬ－４对瘤细胞有多种生物功能，其调节作用因瘤细胞类型及功能状态的不同而异。     

SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株的表达

目的研究SATB1在不同侵袭潜能的人肝癌细胞株表达状况。方法分别用荧光定量PCR,RT-PCR,Western blotting及免
疫荧光方法,检测人永生化肝细胞株HL-7702及肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3 中SATB1
的表达。结果相对于HL-7702,SATB1 mRNA在其余5 种肝癌细胞株中都有较高程度的表达,其中高侵袭性HCCLM3、
MHCC97H 表达最高,MHCC97L 次之,SMMC-7721、HepG2 最低（P<0.001）;Western blotting 分析HepG2、SMMC-7721、
MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3肝癌细胞株的蛋白相对表达量分别为0.271±0.002;0.351±0.023;0.621±0.026;0.878±0.026;
1.236±0.006,高侵袭性HCCLM3相当于HepG2的4.6倍（P<0.001）;免疫荧光显示SATB1在5种肝癌细胞株的胞浆和胞核内均
有分布,高侵袭性细胞株HCCLM3、MHCC97H表现强阳性染色。结论SATB1在不同侵袭潜能肝癌细胞株中的表达有差异,
与肝癌转移密切相关。     

体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系

目的　从人肝癌裸鼠肺转移灶中建立人肝癌细胞系 ,为探索肝癌转移的分子机制提供模型。方法　用高转移性人肝癌克隆细胞株MHCC97 H接种裸鼠 ,进行 3次肺转移筛选 ,取肺转移瘤建成皮下接种后自发性肺转移的细胞系。检测下列指标 :形态学、生长曲线、克隆形成率、运动速度、核型分析、流式细胞分析、免疫细胞化学检查、HBVDNA、成瘤性和转移性。结果　从裸鼠肺转移灶中培养出人肝癌细胞系HCCLM3,为多边形上皮性癌细胞 ,亚三倍体核型 ,染色体众数范围 5 5～ 5 8条 ;细胞倍增时间 34 9h ;克隆形成率 32 4 %± 3 2 % ;细胞运动速度 (2 0± 2 ) μm/h ;免疫细胞化学显示甲胎蛋白、白蛋白、细胞角质蛋白 8、P16阳性 ,P5 3、nm2 3、HBsAg阴性 ;细胞基因组中有HBVDNA整合。裸鼠皮下接种成瘤率 10 0 % ,5周后自发性肺转移率为 10 0 % ,肺转移灶中位数 12 1个 /裸鼠。瘤组织原位接种于裸鼠肝脏 ,5周后腹壁转移 10 0 %、腹腔内转移 80 %、肝内转移 10 0 %、膈肌转移 70 %、肺转移10 0 % ,肺转移灶中位数 2 6 8个 /裸鼠。结论　建成一个皮下和原位接种均出现自发性高转移的人肝癌细胞系 ,为研究肝癌转移提供了新的实验模型     

奥曲肽抑制人肝癌细胞血管内皮生长因子的表达与合成

目的探讨生长抑素类似物奥曲肽对人肝癌细胞株MHCC97-L中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达及VEGF合成与分泌的影响.方法利用酶联免疫吸附法、流式细胞仪、逆转录-聚合酶链反应检测不同剂量的奥曲肽对人肝癌细胞株MHCC97-L的VEGF合成与分泌及VEGF mRNA表达的影响.结果奥曲肽(10-5～10-10 mol/L)可以抑制人肝癌细胞株 MHCC97-L中VEGF mRNA表达及VEGF合成与分泌,呈剂量依赖性,可见饱和现象.结论奥曲肽能够抑制人肝癌细胞株MHCC97-L中VEGF的表达、合成和分泌,可能是奥曲肽抗血管新生的作用机制之一.     

雷帕霉素抑制肝癌细胞生长及转移的实验研究

目的探讨具有抗肿瘤特性的新型免疫抑制剂雷帕霉素(RPM)对肝癌细胞生长及转移的作用。方法应用流式细胞仪检测RPM(10 ng/m l)、环孢素(CsA)(100 ng/m l)、以及两者合用对人肝癌高转移细胞株MHCC97H细胞凋亡及细胞周期的影响;应用MTT法检测上述药物对细胞增殖的影响。用实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测RPM处理后血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA、缺氧诱导因子-1α(H IF-1α)mRNA、转化生长因子b(TGFb)的表达。ELISA法检测MHCC97H培养液上清VEGF蛋白水平的变化。28只原位种植高转移性人肝癌模型LC I-D20裸鼠,随机分为CsA(25 mg/kg)组、RPM(2 mg/kg)组、CsA+RPM组及对照组(生理盐水),每组7只;探讨免疫抑制剂对肿瘤生长及自发肺转移的影响。结果体外实验中,RPM抑制了MHCC97H细胞的增殖,并使细胞停滞于G0/G1期,但未促进细胞凋亡。RPM下调了H IF-1α和VEGF的基因表达及MHCC97H培养液上清VEGF蛋白的表达(890.3 pg/m l±25.1 pg/m lvs 1583.7 pg/m l±17.3 pg/m l,P=0.000)。CsA对细胞周期及增殖无影响。体内实验中,RPM及CsA+RPM抑制了LC I-D20模型移植瘤的生长(0.76 g±0.38 g vs 2.09 g±0.75 g,P=0.001;0.40 g±0.22 g vs 2.09 g±0.75 g,P=0.000)及肺部转移的发生(均为2/7 vs 7/7,P=0.021)。CsA组肺部自发转移灶的数目多于对照组(6±2 vs 4±1,P=0.046)。结论RPM能明显抑制肝癌细胞的生长及转移,以RPM为基础的免疫抑制方案在肝癌肝移植中可能有临床应用前景。     

JWA抑制人肝癌细胞的黏附和迁移侵袭潜能

探讨JWA蛋白在人肝癌细胞黏附和迁移侵袭过程中的作用?方法:应用小干扰RNA下调低转移潜能人肝癌细胞株MHCC97L中JWA蛋白表达水平,MTT法检测MHCC97L增殖;应用细胞小室检测MHCC97L在JWA不同蛋白水平时的迁移及侵袭潜能变化;黏附试验检测MHCC97L细胞黏附能力变化?结果:研究发现人肝癌细胞株MHCC97L中的JWA表达水平下降后,肝癌细胞迁移及侵袭能力明显增强,细胞对细胞外基质纤维连接蛋白的黏附力增加?结论:RNA干扰JWA引起肝癌细胞的JWA蛋白表达水平下降,导致肝癌细胞的黏附?迁移及侵袭能力增强,结果提示JWA可能抑制人肝癌细胞侵袭和转移?     

C×CR7／CXCLl2轴对人肝癌细胞增殖能力的影响

目的观察不同恶性程度的肝癌细胞株中趋化因子受体CXCR7的表达情况,探讨CXCLl2／CXCR7生物学轴对人肝癌细胞增殖能力的影响。方法以肝癌成瘤高转移细胞株MHCC97-H及成瘤低转移细胞株PLC／PRF／5为研究对象。采用RT-PCR、Westernblot免疫印迹法检测两株肝癌细胞的CXCR7mRNA与蛋白表达情况,应用CXCR7激动剂（重组人CXCLl2）和特异拮抗剂（CCX771）分别刺激和阻断CXCR7功能,应用Alamarblue法检测细胞的增殖能力。结果MHCC97-H细胞株CXCR7的mRNA与蛋白表达明显高于PLC／PRF／5细胞株,CXCLl2能明显增强MHCC97-H细胞增殖能力（P〈0．01）,CXCR7阻断剂CCX771作用后,MHCC97一H细胞增殖能力明显下降（P〈0．01）;CXCLl2对PLC／PRF／5细胞增殖能力无明显影响（P〉0．05）。结论CxCLl2／CXCR7生物学轴与肝癌细胞株增殖能力有一定的关系,CXCR7拮抗剂CCX771可明显抑制肝癌细胞的增殖能力。     

肝癌细胞系MHCC97亚群中甲胎蛋白的表达差异

目的：探讨甲胎蛋白（AFP）在不同肝癌细胞亚群中的表达差异．方法：应用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞分成边缘群（SP）及非边缘群（Non—SP）2个细胞亚群,采用免疫细胞化学方法观察AFP在2个不同肝癌亚群中的表达变化及含量．结果：SP细胞仅占细胞总体的1．8％,SP细胞AFP表达明显高于Non—SP细胞（P〈0．01）．结论：AFP在肝癌细胞中表达有差异,强阳性多数分布在SP细胞亚群中,进一步证实了肿瘤的异质性．     

趋化因子受体CXCR7在人肝癌细胞株中的表达及意义

目的探讨趋化因子受体(Chemokine receptor,CXCR7)在不同肝癌细胞株中的相对表达强度及意义。方法采用RT-PCR、Western blot法,检测8株不同转移潜能肝癌细胞中趋化因子受体CXCR7在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果 CXCR7在8株肝癌细胞中的表达水平差异存在统计学意义,无论是mRNA水平还是蛋白水平,高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3)CXCR7的表达明显高于普通转移潜能肝癌细胞株(HepG2、PLC/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B),P<0.01。结论 CXCR7与肝癌的发生、发展及预后有一定的相关性。     

靶向干扰CXCR7基因表达对肝癌(HCC)细胞增殖及凋亡的影响

 目的  探讨CXCR7基因在不同肝癌细胞系及肝癌组织中的表达情况,并研究靶向抑制CXCR7基因表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法  应用Western blot检测不同肝癌细胞系及10例肝癌组织中CXCR7蛋白的表达水平。采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默HCCLM3与MHCC97L细胞中CXCR7基因的表达,分别采用Western Blot和qRT PCR检测shRNA的靶向沉默效果。通过CCK-8增殖实验与Annexin V-FITC/PI细胞双染色研究CXCR7抑制对HCCLM3与MHCC97L增殖及凋亡的影响。结果  CXCR7表达水平与肝癌细胞的恶性程度呈正相关,肝癌组织中CXCR7表达水平较癌旁显著升高。实验成功构建了9个慢病毒表达载体,其中CXCR7 shRNA 566序列干扰效率最高。增殖实验显示干扰表达组细胞生长速度受到明显抑制(P<0.05);流式细胞仪分析显示干扰CXCR7表达可诱导细胞凋亡的发生。结论  CXCR7表达水平与肝癌恶性程度呈正相关,靶向干扰CXCR7表达可抑制细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡。     

生长抑素类似物对人肝癌细胞株MHCC97-H的影响

目的:探讨生长抑素类似物奥曲肽对人高转移潜能肝癌细胞株MHCC97-H的影响及可能机制.方法:MHCC97-H肿瘤组织种植于裸鼠肝脏建立肝癌动物模型27只,随机分为3组:阴性对照组和小、大剂量干预组,同等条件下饲养35d,记录动物模型生存期,死亡时质量;观察肝脏,肺脏病理改变;免疫组化方法检测肝脏肿瘤组织基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达变化.结果:奥曲肽干预组动物模型较阴性对照组动物模型死亡时平均体重增加,肝癌转移率下降(P＜0.05);干预组间对比未见统计学差异(P＞0.05);免疫组化显示干预组肝脏肿瘤细胞MMP-2表达较阴性对照组下调(P＜0.05);干预组组间比较未见统计学差异(P＞0.05).结论:奥曲肽可改善荷MHCC97-H细胞裸鼠肝癌模型生存质量,抑制MHCC97-H细胞肺转移,下调肿瘤组织MMP-2的表达是奥曲肽抑制MHCC97-H细胞侵袭转移的可能机制之一.