逆转录病毒介导的HyTK基因转移及杀伤恶性黑色素瘤细胞的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶｔｋ）基因导人恶性肿瘤细胞，随后应用药物丙氧鸟苷（ＧＣＶ）可选择性地杀死肿瘤细胞．本研究中我们将ＨｙＴＫ基因克隆到逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中，并切除其中的ＳＶ４０早期启动子，构建成重组逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫ／Ｎ，并用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞，经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中，且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞，４８ｈ后，在光镜下观察细胞形态及进行活细胞计数．结果表明，ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

携带HSV—tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体。切除逆转录病毒病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ＰＭＮＭ；从真核表达载体ＰＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ＰＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮＰ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ＰＧＥＭ，７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ＰＭＮＰ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建     

应用免疫磁珠法分离脐血CD^＋34造血细胞

分离脐血ＣＤ＾＋３４细胞，以了解其造血增殖活性。方法：应用免疫磁珠法分离脐血ＣＤ＾＋３４细胞，并对其实验方法进行了改进。结果：常规方法ＣＤ＾＋３４纯度较低，经过改进，脐血ＣＤ＾＋３４细胞由分离前的（１．３９±０．７６）％增加至（５９．４６±１７．３５）％，ＣＤ＾＋３４细胞富集倍数为（６２．３１±５５．１９）倍，分离后组分ＣＦＵ－ＧＭ，ＢＦＵ－Ｅ，ＣＦＵ－Ｍｉｘ较分离前分别增加（４１．０５±１５．７     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

CD基因对大肠癌杀伤作用的实验研究

目的：探讨ＣＤ基因对大肠癌靶向治疗的作用。方法：构建以ＣＥＡ基因顺式转录调控序列（ＴＲＳ）驱动ＣＤ基因的组织特异性重组逆转录病毒载体Ｇ１ＣＥＡＣＤＮa,脂质体裹 法将重组组织特异性载体pＣＤ２在逆转录病毒包装细胞ＰＡ３１７细胞中进行包装,收获病毒上清后分别转染入高分泌ＣＥＡ的大肠癌细胞ＬoＶo中,经Ｇ４１８筛选阳性克隆扩增后进行体外前药敏感实验及观察旁观者交应,然后再将转基因ＬoＶo细胞接种对裸鼠皮下成     

硫酸葡聚糖预处理方案在脐血移植中应用的初步研究

目的：进一步了解脐血造血细胞回巢潜能及硫酸葡聚糖（ＤＳ）的动员作用机制。方法：重症联合免疫缺陷小鼠经亚致死剂量γ射线照射或ＤＳ预处理后,进行经冻存后的人脐血移植,利用人粒－单系祖细胞培养及流式细胞术。检测植入小鼠骨髓、脾脏等器官中的人源性细胞。结果：与末预处理组相比,ＤＳ或照射预处理组移植受体鼠内人源ＣＤ４５＾＋,ＣＤ３４＾＋及ＣＤ１９＾＋细胞植入水平明显提高,ＤＳ预处理组植入水平虽较照射预处理组     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨ＨＳＶ－ＴＫ基因介导的ＧＣＶ系统对人视网膜母细胞瘤（ＲＢ）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＴＫ导入包装细胞ＰＡ３１７,筛选出逆转录病毒产生细胞ＰＡ３１７／ＴＫ,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染ＲＢ细胞,筛选出含ＴＫ基因的ＲＢ细胞（ＲＢ／ＴＫ）,用ＧＣＶ分别处理ＲＢ,ＲＢ／ＴＫ及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人ＲＢ裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再     

体外培养与扩增对脐血CD34^＋细胞及HLA抗原表达的影响

采用免疫组织化学方法,观察脐血细胞体外培养与扩增前后ＣＤ３４＾＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达。结果表明：脐血ＣＤ３４＾＋细胞的百分比以及ＨＬＡ抗原的表达于达体外培养前后无显著性变化（Ｐ〉０．０５）,而在细胞因子的联合作用下,经一定时间的扩增后,ＣＤ３４＾＋细胞百分比下降（Ｐ〈０．０１）,ＨＬＡ抗原的表达有一定程度的提高。提示：体外扩增对脐血ＣＤ３４＾＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达有一定的影响,     

脐血免疫活性和造血干细胞活性体外研究

目的 探讨造血生长因子不同组合方式对脐血有核细胞的扩增作用。方法 ①用流式细胞术检测脐血中ＣＤ３４＾＋、ＣＤ３８＾－、Ｔｈ（ＣＤ４＾＋、ＣＤ８＾－、ＣＤ３＾＋）细胞和Ｔｓ（ＣＤ４＾－、ＣＤ８＾＋、ＣＤ３＾＋）细胞;②用液体培养及半固体琼脂培养方法检测不同刺激因子的组合ＣＤ３４＾＋、ＣＤ３８＾－、Ｔｈ、Ｔｓ扩增后的变化。结果 在各种造血因子的协同作用下脐血中有核细胞数、ＣＤ３４＾＋、ＣＤ３８＾－分别     

供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒的制备

目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子Ａ链（ＰＤＧＦ－Ａ）基因的重组逆转录病毒,为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人ＰＤＧＦ－ＡｃＤＮＡ片段插入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子序列的逆转录病毒ＧＩＮａ载体的多克隆位点中,将构建的重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中,经Ｇ４１８筛选并扩增,以病毒液感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,测病毒滴度,选择出抗性克隆,进行免疫组织化学检测,表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为１．４×１０５ＣＦＵ／ｍｌ;免疫荧光染色法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实ＰＤＧＦ－ＡＡ的表达;抗性细胞条件培养基的细胞活性高达５１．２Ｕ／（１０６·ｄ）。结论供转导ＰＤＧＦ－Ａ基因的高滴度逆转录病毒得以制备,该基因获得有效表达,表达产物具有明显的致丝裂活性。     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

血管内皮抑素基因转染人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究

目的：探讨人血管内皮抑素(内抑素)基因转染人脐带血CD34^ 造血干细胞的方法及检测。方法：用逆转录病毒载体pLNCX，将人内抑素基因导人人脐带血CD34^ 造血干细胞。应用PCR及Western bolt方法检测人内抑素基因的转染和表达。结果：PCR证实，转染内抑素基因的人脐带血CD34^ 造血干细胞基因组中有550bp人内抑素特异性片段，Western bolt分析示人内抑素基因在转染细胞中获得稳定表达和分泌。结论：人内抑素基因可转染到人脐带血造血干细胞中并稳定表达。     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

转hLIF基因逆转录病毒载体饲养层细胞的建立及其对脐血CD34＋造血干/祖细胞的扩增作用

目的建立转人白血病抑制因子（hLIF）基因逆转录病毒载体的饲养层细胞,并观察其对CD34＋造血干/祖细胞（HSPC）的扩增作用。方法建立转hLIF基因逆转录病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34＋HSPC,流式细胞术检测其纯度;将CD34＋HSPC与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果。结果建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实均有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34＋HSPC纯度可达（95.6±2.58）%,与饲养层细胞共培养后CD34＋HSPC可扩增8.74倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高。结论建立的转hLIF基因饲养层细胞对CD34＋HSPC有一定的扩增作用,且延缓其分化。     

双功能逆转录病毒载体介导耐药基因转染人脐血CD34+细胞能增强联合化疗抗性

目的　为探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH1)和多药耐药基因 (MDR1)的人脐血CD34 细胞能否同吮增强对活性环磷酰胺 ( 4 HC)和P gp转运泵靶药的抗性。方法　构建了同时含ALDH1和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH1 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染GP E86和PA317包装细胞 ,采用含长春新碱 (VCR)和 4 HC的培养基克隆选择后 ,收集重组病毒上清于单向型与双嗜型包装细胞行乒乓交互感染 ,获得PA317重组病毒生产细胞 (最高滴度达 5 6× 10 5CFU ml) ,将含ALDH1和MDR1耐药基因重组病毒上清在细胞生长因子刺激下重复感染人脐血CD34 细胞。结果　经PCR ,RT PCR ,Southernblot,Northernblot,FACS和MTT方法检测显示外源ALDH1与MDR1基因已经整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达 ,同时传递不同的耐药表型。经耐药基因修饰的脐血CD34 细胞对 4 HC和P gp转运泵靶药同时产生抗性 ,其IC50值分别比未转染细胞高 4倍 ( 4 HC) ,5 5倍 (柔红霉素 DNR)和 7 2倍 (VCR)。结论　双功能逆转录病毒载体介导两种不同耐药基因转染人脐血CD34 细胞能增强联合化疗抗性 ,本基因转移系统的建立为开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础。     

逆转录病毒介导的人卵巢癌 p53基因治疗体外及小鼠体内实验研究

目的 :评价人卵巢癌的 p5 3基因治疗效果。 方法 :用携带人野生型 p5 3的逆转录病毒转导 p5 3蛋白表达缺如的人卵巢癌细胞系SK OV 3,通过体外及小鼠体内实验研究转基因的表达及对肿瘤的抑制作用。结果 :逆转录病毒介导的 p5 3基因能够在体外及小鼠体内人卵巢癌细胞SK OV 3中表达 ,并对人卵巢癌生长有抑制作用。体外抑制率为 5 7%～ 88% ;对体内肿瘤抑制率为 40 %。结论 :逆转录病毒介导的外源野生型p5 3能够抑制人卵巢癌生长 ,增加病毒滴度将进一步提高体内治疗效果     

Egr—1启动子库列调控造血生长因子表达的实验研究

目的 探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法 该实验将携带Ｅｇｒ－１调控序列启动的ＦＬＴ３配基（ＦＬ）和ＧＭ－ＣＳＦ双顺反子载体（Ｅｇｒ－ＦＧ）导入骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ（称为ＨＦＧＬ／ＥＦＧ）。采用ＲＴ－ＰＣ、ＥＬＩＳＡ及细胞半殖法观察ＦＬ和ＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ在转染细胞中的表达及保护造血作用。结果 构建了Ｅｇｒ－１调控序列启动的双顺子反子基因表达载体（Ｅｇｒ     

Anti-tumor effect of human endostatin mediated by retroviral gene transfer in nude mice

目的　探讨逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因 (endostatin)对人肝癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒载体pLncx构建含有人endostatin基因及信号肽的重组逆转录病毒质粒 ,并将其导入PA317细胞制备重组病毒。用重组病毒感染人肝癌细胞SMMC772 1获得稳定转人endostatin基因细胞株 (SMMC endo)。同样用空白病毒质粒制备对照细胞株SMMC pLncx。免疫组化及Westernblot检测人endostatin基因在转染细胞株中的表达和分泌。应用血管内皮细胞生长抑制试验验证转染细胞株表达的人endostatin的生物学活性。同时对转染细胞株在体内外的生长情况进行观察。结果　免疫组化及Westernblot印迹分析证实转染人endostatin基因的肝癌细胞能表达并分泌人endostatin。与转染空白对照组 (SMMC pLncx)相比 ,表达人endostatin的SMMC772 1浓缩上清可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞生长 ,抑制率达 4 8% ,明显高于对照组 10 2 % (P <0 0 1)。体外生长实验显示 ,SMMC endo细胞与对照细胞SMMC pLncx体外生长速率无明显差别。而在转染细胞接种裸鼠 2 2d后 ,转染人endostatin基因的肿瘤细胞生长明显受到抑制 ,仅在部分裸鼠 (3/ 5只 )体内长出肿瘤 ,并且产生的腹侧肿瘤体积较对照组肿瘤缩小 94 5 % (P <0 0 0 1)。结论　逆转     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。