炭疽芽孢杆菌的研究进展

2001年美国“9．11”事件后,发生了许多炭疽恐怖事件,引起美国人民的极大恐慌,也使世界各国政府和研究人员认识到了炭疽杆菌检验、预防、治疗研究的重要性。这种细菌目前在临床检验室很少见到,现将检索到的资料做一简要介绍。     

结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的：构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT－6的重组卡介苗，方法：分别以卡介苗（BCG）和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原（α－Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列，将esat-6基因与大肠杆菌－卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组，得到重组质粒pME,再将BCGα－Ag信号肽序列克隆至pME中，得到重组质粒pSME。结果：质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实，克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261，结论：重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT－6，该质粒的构建成功为改造卡介苗，发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

利用无缝克隆方法构建埃及伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A双向启动子苏云金芽孢杆菌穿梭载体

目的 构建表达dsRNA的双向启动子以及靶基因AaCPR100A的大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315-AaCPR100A。方法 以苏云金芽孢杆菌pSVP27A质粒为模板通过PCR扩增苏云金芽孢杆菌Cry3A正向启动子Pro-1（+）;以埃及伊蚊RNA反转为cDNA为模板,扩增靶基因AaCPR100A;将大肠-苏云金穿梭载体pHT315质粒经HindⅢ和SalⅠ双酶切线性化;按照转录方向将正向启动子与靶基因通过无缝克隆插入穿梭载体pHT315中;以生物合成的含有Cry3A反向启动子序列的质粒为模版,经PCR克隆扩增Pro-1（-）反向启动子;将含有正向启动子与靶基因的中间载体通过Eco RⅠ限制性酶切酶线性化,按转录方向在靶基因下游通过无缝克隆插入反向启动子。结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,正向启动子、靶基因AaCPR100A和反向启动子PCR产物条带清晰,质量良好,可用于无缝克隆实验;经无缝克隆连接双向启动子以及靶基因片段后,对含有重组载体pHT315-AaCPR100A的重组质粒进行PCR验证,在重组载体中成功扩增正向启动子、靶基因片段以及反向启动子,经核苷酸测序验证双向启动子...     

炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的 快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法 根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物，扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子，从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定，生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物，可以扩增出长2205bp的保护性抗原基因，经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段，对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论 利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

GFP为外源报告基因在地衣芽孢杆菌20386中表达的研究

目的 探讨外源基因在野生型地衣芽孢杆菌20386中表达的可行性。方法 利用大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭表达载体在大肠杆菌DF5α中构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒，通过电转化将重组质粒转入到野生型地衣芽孢杆菌20386中表达，通过检测绿色荧光蛋白的存在，考察该野生型菌株表达外源基因的可能性和表达能力。结果 在紫外光激发下，在固体LB平板上生长的菌落能显示绿色荧光，而在液体LB培养基中培养的菌体和培养上清中未能检测到绿色荧光蛋白的存在。结论 外源基因在野生型地衣芽孢杆菌20386中能够表达，但在液体LB中培养时，可能会被该菌自身分泌的蛋白酶分解；亦可能被稀释而无法测到荧光，还需进一步研究。     

人生长激素的酵母/哺乳动物穿梭载体的构建

目的酿酒酵母已被证实可作为载体应用于口服基因治疗及免疫中。为研究人生长激素(HGH)以酿酒酵母作为运送载体的口服基因药物,需要构建一种能够在酵母中复制而在哺乳动物细胞表达的HGH穿梭载体。方法利用ECHO克隆系统先构建出HGH的哺乳动物表达载体,使HGH处于CMV启动子的调控下;然后设计引物扩增CMV-HGH片段,连接到酿酒酵母表达载体pESC-URA中,构建HGH的酵母/哺乳动物穿梭载体。结果经EcoRI单酶切、EcoRI/SpeI双酶切、菌落PCR以及序列测定鉴定,确认所构建的确为酵母/哺乳动物穿梭载体pESC-CMV-HGH。结论成功构建的穿梭载体可在酿酒酵母中复制,在哺乳动物中受CMV启动子的调控进行表达,为HGH的口服基因药物研制打下了基础。     

鼠源轮状病毒抗原基因的表达载体构建及农杆菌转化研究

目的 构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp4的植物载体及农杆菌转化。方法 抗原基因vp4经PCR扩增后直接克隆到pUC-T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果 成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中。结论 pUC-T载体可直接进行PCR扩增产物克隆，便于测序：电转化方式可以有效、快速地将大分子量质粒（＞10kb）转入农杆菌中。     

炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针的制备

目的快速制备炭疽杆菌保护性抗原基因芯片探针。方法根据PubMed上公布的炭疽杆菌保护性抗原的DNA序列设计引物,扩增保护性抗原基因。利用酶切、AT克隆方法快速分析筛选出保护性抗原基因片段的重组子,从而制备成芯片探针。DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定,生物信息学软件对其基因序列进行分析。结果根据炭疽杆菌保护性抗原设计的引物,可以扩增出长2 205 bp的保护性抗原基因,经酶切、AT克隆方法筛选出约7个长度不一的片段,对其片段进行序列测定并进行Blast序列比对得知这些片段均属于炭疽杆菌保护性抗原基因。结论利用PCR扩增产物并结合酶切、AT克隆方法可以快速、简便地制备基因芯片探针。     

炭疽芽孢DNA适配子结构与长度对亲和力的影响

目的 研究炭疽芽孢适配子结构与长度变化对其与芽孢之间亲和力的影响。方法 人工合成f77-1适配子序列，并构建在其7条突变体序列，将这些寡核苷酸序列分别与炭疽芽孢结合，利用TMB显色系统判断读取吸光度A值，确定各序列与芽孢间亲和力大小；同时通过核酸序列分析软件包模拟各序列的二级结构，推断适配子的结构与亲和力之间的关系。结果 适配子f77-1与突变体中的f77-3与芽孢亲和力较好，约是突变体中f77-4亲和力的11倍，二级结构显示：f77-1,f77-3都具有茎环或发卡结构，且3'端都有连续3个G。结论 适配子5'端的茎环结构和发卡结构是这些寡核苷酸序列与芽孢结合的结构基础，3'端的连续3个G可能对提高亲和力起着重要的作用。     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带有Survivin启动子的重组腺病毒载体,检测其在人膀胱癌细胞株BIU87和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1中的表达。方法用PCR扩增Survivin基因的启动子片段,构建分别携带Survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pSurp-EGFP和pCMV-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Adeno-SP-EGFP和Adeno-CMV-EGFP,分别转染BIU87及SV-HUC-1,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功克隆440 bp的Survivin基因启动子,并构建了携带有Survivin基因启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP,其转染BIU87及SV-HUC-1后,在荧光显微镜下可以观察到BIU87细胞呈现出较强绿色荧光,而SV-HUC-1细胞中仅有散在少量绿色荧光。结论成功制备的携带有Survivin启动子的重组腺病毒Adeno-SP-EGFP在BIU87细胞中表现出较高的肿瘤特异性活性,为下一步进行肿瘤特异性的基因治疗研究奠定了基础。     

survivin基因启动子驱动的肿瘤特异性腺病毒载体的构建

目的:构建肿瘤特异性启动子驱动的腺病毒载体,检测survivin基因启动子在喉癌细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,构建分别携带survivin启动子和CMV启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP,体外连接法制备重组腺病毒Ad-SP-EGFP和Ad-CMV-EGFP,后转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP表达。结果:成功构建survivin基因启动子的腺病毒载体;Ad-SP-EGFP转染后荧光镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞无表达。结论:成功制备肿瘤特异性survivin启动子驱动的腺病毒,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

Kringle 5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建

目的：构建含有目的基因kring5的真核植物细胞穿酸表达载体。方法：应用RT－PCR方法，从正常人肝脏组织中获得kringle5基因，测序后，再通过DNA重组技术，将kringle5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI121和pCAMBIA3301上。结果：得到的kringle5基因序列测定结果与文献相符，重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确，含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论：重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制，而且可以在植物细胞中表达。     

贵州省1起人间疑似炭疽疫情的病原学诊断与分析

目的从病原学角度判定1起人间疑似炭疽疫情,为疫情的处置提供科学依据。方法采用革兰氏染色、串珠试验、噬菌体实验、生化试验对病人水疱液标本和采集的土壤标本进行炭疽芽孢杆菌培养分离和鉴定,应用Real-time PCR检测致病性基因PA和capA。结果从土壤标本中分离到1株疑似炭疽芽孢杆菌,细菌学方法鉴定为炭疽芽孢杆菌,Real-time PCR检测致病性基因PA和capA均为阳性。结论该起疫情为炭疽芽孢杆菌引起,患者感染为接触炭疽杆菌污染的土壤所致。     

Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。     

表达人生长激素的逆转录病毒载体的构建

目的：建立一个表达人生长激素（hGH)的重组逆转录病毒载体转移系统，为下一步研究做准备工作。方法:通过重组DNA技术，用Eco R I酶切载有人生长激素的质粒pNMG3，获得约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子（mMT-1)和人生长激素（hGH)基因片段，将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN中。对阳性重组子LXSNhGH进行酶切和PCR鉴定。利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的Bam H I酶切位点双酶切，正向重组子pLXSNhGH^ 应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段；同时，应用巢式PCR鉴定目的片段，扩增片段大小约1.119kb，与预期结果相符。结果：表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功。结论：人生长激素逆转录病毒表达载体的构建成功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础。     

谷胱甘肽S转移酶-血管生成抑制素融合蛋白表达载体的构建

目的　构建谷胱甘肽S转移酶 -血管生成抑制素 (GST -Angiostatin)融合蛋白表达载体。方法　把血管生成抑制素 (Angiostatin)基因插入融合基因表达载体pGEX - 2T的多克隆位点上 ,转化大肠杆菌DH5α ,提取质粒DNA ,限制性内切酶消化DNA ,琼脂糖凝胶电泳。结果　经限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ酶切质粒DNA ,电泳结果证明Angiostatin基因已插入到pGEX - 2T中。结论　成功构建GST -Angiostatin融合蛋白表达载体 ,为获得较大量的基因工程Angiostatin产品 ,为肿瘤治疗研究作必要准备。     

N-甲基-D天冬氨酸受体2B亚基重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的：构建携带N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体2B亚基（NR2B）基因的腺病毒5型（Ad5）穿梭载体，为NR2B重组腺病毒镇痛疫苗的包装做准备。方法：以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3．1-NR2B获得目的基因NR2B；将NR2B定向克隆入腺病毒穿梭载体pDC515，并行酶切及DNA测序鉴定。在脂质体介导下将pDC515-NR2B转染293细胞，并以RT-PCR及Western blot分别从转录水平和翻译水平检测目的基因NR2B的表达。结果：经酶切和DNA测序证实目的基因NR2B被成功克隆入载体pDC515-NR2B中，RT-PCR及Western blot检测NR2B可在293细胞表达。结论：成功构建NR2B重组Ad5穿梭载体pDC515-NR2B，该载体可用于NR2B重组Ad5载体镇痛疫苗的包装。