应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRIα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5.3细胞,获得大量的含抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱,分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果分离纯化的单克隆抗体纯度高,活性强。结论应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRIα的单克隆抗体。     

大鼠羊水与RBL-2H3肥大细胞共培养后脱颗粒的检测

[目的]探讨大鼠羊水与 RBL-2H3肥大细胞共培养后是否有脱颗粒现象发生。[方法]取大鼠不同稀释度的羊水与大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞系共培养,用酶联免疫法测定不同时间样品上清的组胺、自发释放的组胺和总组胺,计算组胺释放率。对细胞用阿利新蓝染色,计算脱颗粒指数。用流式细胞仪测定RBL-2H3细胞Annexin Ⅴ标记后的阳性细胞率。[结果]与不同稀释度的羊水共培养后,细胞的组胺释放率有显著差异,组胺的释放和羊水浓度正相关。阿利新蓝染色后计算的脱颗粒指数与组胺释放率测定结果一致。细胞Annexin Ⅴ标记后的阳性率在羊水刺激后明显上升,进一步证明了脱颗粒的发生。[结论]羊水中的物质可以通过直接作用导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,为羊水栓塞时肥大细胞脱颗粒机制的研究提供了一定的实验依据。     

白鲜皮提取物抗过敏反应研究

目的:探讨白鲜皮提取物的抗过敏作用,分析其作用机制。方法:采用C48/80处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,释放组胺及β-氨基己糖苷酶,模拟人类过敏反应。用不同浓度的白鲜皮提取物处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,观察白鲜皮提取物对大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒释放组织胺及β-氨基己糖苷酶的影响;采用伊文思兰染色的方法,观察白鲜皮提取物对组织胺引起的毛细血管通透性的影响。结果:发现白鲜皮提取物能够剂量依赖性的抑制C48/80诱导的大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒,减少组织胺及β-氨基己糖苷酶的释放,并能够降低小鼠毛细血管通透性。结论:白鲜皮提取物能够缓解过敏反应引起的炎症而用于过敏反应,其作用机制可能是通过抑制肥大细胞功能而降低毛细血管通透性。     

IgE高亲和力受体蛋白的制备及其生物功能的鉴定

目的 通过基因工程技术制备人IgE抗体结合其高亲和力受体α段(FcεRIα)蛋白并对其生物学功能进行鉴定,为探讨FcεRIα在过敏性疾病中的作用奠定研究基础.方法 应用基于PCR的精确合成法(PAS)方法获得人FcεRIα基因,构建原核表达载体pET-FcεRIα,低温诱导表达FcεRIα并采用 His标签纯化重组蛋白;通过ELISA法鉴定重组人FcεRIα蛋白的生物功能.结果 扩增出大小约为560 bp的人FcεRIα基因;pET-FcεRIα质粒经双酶切及测序鉴定正确;诱导表达并纯化出相对分子质量大小约为22000的人FcεRIα;重组人FcεRIα能有效检测人血清中的抗FcεRIα自身抗体水平,并且能够与人血清中IgE抗体高效结合.结论 成功制备人FcεRIα蛋白,并初步具备检测人血清中抗FcεRIα自身抗体及IgE抗体的能力,为后续研究提供了有利的实践基础.     

白鲜皮提取物抗过敏反应研究

目的:探讨白鲜皮提取物的抗过敏作用,分析其作用机制。方法:采用C48/80处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,刺激RBL-2H3细胞脱颗粒,释放组胺及β-氨基己糖苷酶,模拟人类过敏反应。用不同浓度的白鲜皮提取物处理大鼠肥大细胞RBL-2H3,观察白鲜皮提取物对大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒释放组织胺及β-氨基己糖苷酶的影响;采用伊文思兰染色的方法,观察白鲜皮提取物对组织胺引起的毛细血管通透性的影响。结果:发现白鲜皮提取物能够剂量依赖性的抑制C48/80诱导的大鼠肥大细胞RBL-2H3脱颗粒,减少组织胺及β-氨基己糖苷酶的释放,并能够降低小鼠毛细血管通透性。结论:白鲜皮提取物能够缓解过敏反应引起的炎症而用于过敏反应,其作用机制可能是通过抑制肥大细胞功能而降低毛细血管通透性。     

应用A蛋白分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体

目的 分离纯化鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα(高亲和力的IgE的Fc段受体)的单克隆抗体。方法 先培养ER-E5．3细胞，获得大量的含抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体的培养上清。然后应用A蛋白-Sphrose CL-4B制备亲和层析柱，分离纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。结果 分离纯化的单克隆抗体纯度高，活性强。结论 应用A蛋白可以很好分离纯化细胞培养上清中的鼠源性抗肥大细胞FcεRⅠα的单克隆抗体。     

大鼠羊水与RBL—2H3肥大细胞共培养后脱颗粒的检测

[目的]探讨大鼠羊水与RBL-2H3肥大细胞共培养后是否有脱颗粒现象发生。[方法]取大鼠不同稀释度的羊水与大鼠来源的RBL-2H3肥大细胞系共培养，用酶联免疫法测定不同时间样品上清的组胺。自发释放的组胺和总组胺，计算组胺释放率。对细胞用阿利新蓝染色。计算脱颗粒指数，用流式细胞仪测定RBL-2H3细胞AnnexinV标记后的阳性细胞率。[结果]与不同稀释度的羊水共培养后，细胞的组胺释放率有显差异。组胺的释放和羊水浓度正相关。阿利新蓝染色后计算的脱颗粒指数与组胺释放率测定结果一致。细胞AnexinV标记后的阳性率在羊水刺激后明显上升，进一步证明了脱颗粒的发生。[结论]羊水中的物质可以通过直接作用导致RBL-2H3肥大细胞脱颗粒，为羊水栓塞时肥大细胞脱颗粒机制的研究提供了一定的实验依据。     

血塞通致RBL-2H3细胞与原代肥大细胞脱颗粒特性的比较

【目的】通过比较血塞通注射液等在类过敏试验中致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔原代肥大细胞脱颗粒特性的异同,以评价2种细胞在中药注射液类过敏试验中的意义。【方法】选用已经明确能引起类过敏反应的3种供试品即血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80,分别与RBL-2H3细胞和大鼠腹腔肥大细胞共同孵育1 h,通过β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率、释放量等的检测,分析比较脱颗粒特性的异同,同时观察了不同浓度血塞通注射液对脱颗粒程度的影响。【结果】2种细胞在血塞通注射液、Compound 48/80和吐温80的直接刺激下均出现脱颗粒现象,脱颗粒程度与血塞通注射液呈剂量依赖性;原代肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放率、组胺释放量和释放率均显著高于RBL-2H3细胞,2种细胞比较差异有统计学意义(P<0.01)。【结论】在类过敏反应脱颗粒试验中,RBL-2H3细胞和原代大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒具有相同趋势,均可用于中药注射液类过敏评价,RBL-2H3细胞应用方便,而肥大细胞更加敏感。     

生脉注射剂致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒研究

【目的】通过分析生脉注射液致RBL-2H3细胞与大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒及其对2种细胞的细胞毒作用,评价生脉注射剂的致类过敏情况。【方法】分离大鼠腹腔肥大细胞,加入不同浓度的生脉注射剂共孵育,采用荧光法检测组胺并计算释放率。RBL-2H3细胞与不同浓度的生脉注射剂共孵育,采用显色法检测β-氨基己糖苷酶释放率。分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法与流式细胞术检测生脉注射剂对2种细胞的细胞毒作用。【结果】生脉注射剂在终浓度为12.5~100μL/mL时可引起肥大细胞组胺释放率增加,25~100μL/mL时可引起RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶释放率增加(均P0.05或P0.01),上述剂量范围内对2种细胞均未表现细胞毒作用。【结论】生脉注射剂在未表现细胞毒作用的剂量下可引起大鼠腹腔肥大细胞和RBL-2H3细胞脱颗粒,提示生脉注射剂具有致类过敏的可能。     

体外检测RBL-2H3细胞脱颗粒方法的研究进展

<正>嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3细胞)属于大鼠嗜碱粒细胞肿瘤株的一个亚系,1978年美国国立研究所从Wistar大鼠嗜碱性白血病细胞株反复克隆获得的[1-2]。RBL-2H3细胞具有肥大细胞的生物学特性,能模拟肥大细胞的多种功能,是体外研究与肥大细胞相关的各种药物作用机制的重要模型。笔者阐述了RBL-2H3细胞作为体外模型用于检测脱颗粒的不同检测方法。1 RBL-2H3细胞的特征     

大鼠IgECH2-3-FasL融合蛋白真核表达质粒的构建

在人类哮喘及其他过敏反应性疾病中 ,肥大细胞始终处于重要地位。IgE的Fc段与肥大细胞上高亲和力受体FcεRⅠ相连接触发过敏反应。单独的Fc段能封闭其高亲和力受体 ,阻断过敏反应 ,且将关键结合位点定位于Fc段的CH3[1 3 ] 。国外研究发现 ,肥大细胞表面表达Fas,抗Fas抗体能够诱     

自身免疫性慢性荨麻疹的现代观点

自身免疫性慢性荨麻疹(AICU)是一种近年来正在逐步被人们所认识的疾病,与遗传因素,尤其是与HLA-Ⅱ类抗原及自身免疫诱发组胺释放的自身抗体关系密切,患者血清中可以存在着IgG-抗FcεRIα自身抗体和(或)抗IgE自身抗体,现就本病的有关问题综述如下.     

人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgE Cε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用,并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a(+)构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western-blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致;IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgE C...     

分泌抗组胺单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立(简报)

本研究用1,4-对苯醌(Bq)做交联剂,制备组胺-Bq-牛血清白蛋白结合物(组胺-Bq-BSA)并免疫BALB/C小鼠,用Sp2/0.Ag14骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合。应用ELISA间接法检测抗体,包被抗原为组胺-Bq-卵清蛋白结合物(组胺-Bq-OA).筛选出两株抗组胺单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株.即Z255B3和Z253E2。经三次克隆后分别注入同系小鼠腹腔内,所产生的腹水经ELISA间接法测定Z255B3     

清开灵注射液对RBL-2H3肥大细胞脱颗粒的影响

目的:清开灵注射液对RBL-2H3细胞脱颗粒和组胺释放影响。方法:取不同浓度的清开灵注射液与RBL-2H3肥大细胞系共培养,在放大镜下观察比较细胞脱颗粒情况;检测肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶活性A值,并计算β-氨基己糖苷酶释放百分率。结果:与不同浓度的清开灵共培养后,细胞的脱颗粒有明显的差异,以1/8原浓度稀释后细胞脱颗粒明显,清开灵注射液使肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶活性(A值)为0.828±0.004,β-氨基己糖苷酶活性为8.5%。结论:清开灵注射液能通过直接作用使RBL-2H3肥大细胞脱颗粒,为鉴定中药注射剂的过敏机制和临床前研究提供了一定的实验依据。     

抗IgE单克隆抗体在过敏性哮喘治疗中的研究进展

哮喘是一种由遗传因素和环境因素共同作用的异质性疾病,过敏性哮喘是哮喘最常见的表型,其患者血清IgE水平通常高于非过敏性哮喘患者.抗IgE单克隆抗体是哮喘领域的第一类靶向治疗药,可以阻断血清游离IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的Fc?RI结合;还可以减少肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面Fc?RI表达,从而减少由体内外过敏原诱...     

慢性特发性荨麻疹患者血清抗Fcε RI抗体的临床意义

目的了解慢性特发性荨麻疹(CIU)患者血清抗FcεRI抗体水平及其临床意义。方法采用酶联免疫吸附试验法((ELISA)检测50例CIU患者血清抗FcεRI抗体水平,并与20名正常人对照;分析抗FcεRI抗体水平与CIU临床表现的关系。结果CIU患者血清抗FcεRI抗体水平为2.73(0.60～14.45)U/L,正常对照为1.42(0.60～2.30)U/L,两组差异有统计学意义(P0.05);抗FcεRI抗体水平与CIU病程、瘙痒程度、风团数量和风团大小无相关性(P0.05)。结论血清抗FcεRI抗体水平增高可作为CIU的辅助诊断指标,但不能用来评价CIU的病情严重程度。     

IL-4抑制骨髓细胞分化产生嗜碱性粒细胞的机制研究

目的 探究细胞因子IL-4抑制骨髓细胞分化产生嗜碱性粒细胞的能力及机制.方法 采用IL-3诱导培养小鼠骨髓细胞,流式细胞术检测FcεRIα+ckit-CD49b+嗜碱性粒细胞以及FcεRIα+ckit-CD49b-新发现的单阳细胞群,并用Ki67检测其增殖状态.流式细胞术分选单阳细胞群后继续用IL-3诱导培养,以确定其...     

哮喘中IgE依赖性和非IgE依赖性肥大细胞激活的研究

目的：研究哮喘中IgE依赖性和非IgE依赖性肥大细胞的激活。方法：取29例轻度哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中的细胞，经冲洗后，加入含抗IgE抗体、离子载体钙(CI)、腺苷、腺苷衍生物(NECA)或Hanks平衡盐溶液(HBSS)的LP4试管中进行激发试验。检测BALF中肥大细胞分泌的组胺和类胰蛋白酶水平。结果：抗IgE抗体浓度低至0．01％时仍可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放21．1％的组胺，抗IgE抗体0．33％可促进肥大细胞分泌类胰蛋白酶；CI0．3μmol/L即可促进肥大细胞分泌组胺和类胰蛋白酶；腺苷浓度仅在浓度高达1000μmol/L时方可诱导哮喘患者BALF中肥大细胞释放约16．6％的组胺，NECA的作用与腺苷相似；腺苷浓度在10μmol/L以上、NECA浓度从0．1μmol/L至1000μmol/L均可明显促进哮喘患者BALF中肥大细胞释放类胰蛋白酶。结论：抗IgE抗体、CI、腺苷及NECA均可引起IgE依赖性或非IgE依赖性肥大细胞的激活，但不同的途径激活，肥大细胞脱颗粒的成分有一定的选择性。     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.