80株解脲脲原体的药敏及耐药机制分析

目的　分析解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticm ,Uu)的耐药情况,并探讨Uu可能的耐药机制。方法　对80株临床上分离到的Uu进行了药敏分析、PCR生物分群、tetM基因的检测和PCR扩增喹诺酮类药物耐药区(QRDR ,gyrA、gyrB、parC及parE)基因并分析其核苷酸序列。结果　80株临床分离的Uu有6 6份为生物1群,占82 .5 % ;对所测的9种药物全敏感的Uu比例仅为10 % (8 80 ) ;7株耐四环素Uu中有3株出现了tetM基因阳性条带;对6株临床分离Uu的QRDR(gyrA、gyrB、parC及parE)进行了突变分析,未发现环丙沙星、氧氟沙星均敏感Uu株有gyrA、gyrB、parC及parE突变,但耐喹诺酮Uu株有gyrA、parC和parE基因的点突变,并导致其编码的氨基酸改变。在这些QRDR的改变中,gyrA 137C→A和parC基因10 0C→T的误义突变导致其编码的相应氨基酸的改变,但parC基因的2 2 5G→A和parE基因4 0G→A ,4 1T→C的误义突变导致其编码的相应氨基酸的改变。对Uu耐药率及生物群分型结果进行分析发现,虽然两群Uu的耐药率不完全一样,但差异无统计学意义(P均>0 .0 5 )。结论　UuQRDR的改变是导致耐喹诺酮类药物的原因,单独parE基因突变引起其酶蛋白的氨基酸改变也可导致Uu耐喹诺酮类药物。     

解脲脲原体生物被膜形成与耐药性的相关性研究

目的 研究解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)标准株及临床分离株体外形成生物被膜的能力及游离状态与形成生物被膜后药物敏感性的差异.方法 对Uu标准株3、8血清型(Uu3、Uu8)及从女性患者宫颈中分离鉴定的21株Uu临床株进行体外培养后,扫描电镜、激光共聚焦显微镜鉴定生物被膜形成,并在生物被膜形成前后进行约敏测定(四环素、红霉素、环丙沙星).配对秩和检验及x2检验分别比较Uu游离状态及形成生物被膜后最低抑菌浓度间及耐药率间的差异.结果 Uu3、Uu8及21株Uu临床株均具有体外形成生物被膜的能力.Uu形成牛物被膜后对四环素、红霉素及环丙沙星的最低抑菌浓度较游离状态明显增高(P<0.001).Uu形成生物被膜后对红霉素及环丙沙星的耐药率增高具有统计学意义(P值分别为<0.001及0.035),但对四环素的耐药率增高无统计学意义(P=0.293).结论 Uu标准株及临床株均具有体外形成生物被膜的能力,Uu形成生物被膜后对抗菌素的抵抗力增加,出现了多重耐药现象.     

解脲脲原体Parvo和T960生物群msr基因的检测

目的 检测解脲脲原体(Uu)是否携带介导对红霉素耐药的msr基因,并分析其在Uu两生物群间分布的差异.方法 采用微量肉汤稀释法测定72株Uu临床株对红霉素的体外耐性,PCR检测msrA、msrB、msrG、msrD基因,并对Uu进行PCR分群.结果 72株Uu的最低抑菌浓度(MIC)范围是≤0.125 μg/ml≥128 μg/ml,MIC_(50)为32 μg/ml,MIC_(90)≥128μg/ml.分群结果示Parvo生物群51株,占70.83%,T960生物群21株,占29.17%.共检测到msrD基因的Uu24株,msrB基因12株,msrA基因1株,没有发现Uu菌株携带msrC基因.5株Uu同时检测到msrB和msrD基因,1株Uu同时检测到msrA、msrB和msrD基因.以MIC≥8μg/ml为耐药判定值时,两生物群对红霉素耐药性无显著差异,msrB基因主要分布在T960生物群.结论 Uu临床菌株携带对大环内酯类耐药的msr基因(包括msrA、msrB、msrP),msrB基因主要分布在T960生物群.     

解脲脲原体生物被膜形成与耐药性的相关性研究

目的 研究解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)标准株及临床分离株体外形成生物被膜的能力及游离状态与形成生物被膜后药物敏感性的差异.方法 对Uu标准株3、8血清型(Uu3、Uu8)及从女性患者宫颈中分离鉴定的21株Uu临床株进行体外培养后,扫描电镜、激光共聚焦显微镜鉴定生物被膜形成,并在生物被膜形成前后进行约敏测定(四环素、红霉素、环丙沙星).配对秩和检验及x2检验分别比较Uu游离状态及形成生物被膜后最低抑菌浓度间及耐药率间的差异.结果 Uu3、Uu8及21株Uu临床株均具有体外形成生物被膜的能力.Uu形成牛物被膜后对四环素、红霉素及环丙沙星的最低抑菌浓度较游离状态明显增高(P<0.001).Uu形成生物被膜后对红霉素及环丙沙星的耐药率增高具有统计学意义(P值分别为<0.001及0.035),但对四环素的耐药率增高无统计学意义(P=0.293).结论 Uu标准株及临床株均具有体外形成生物被膜的能力,Uu形成生物被膜后对抗菌素的抵抗力增加,出现了多重耐药现象.     

解脲脲原体生物被膜形成与耐药性的相关性研究

目的 研究解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)标准株及临床分离株体外形成生物被膜的能力及游离状态与形成生物被膜后药物敏感性的差异.方法 对Uu标准株3、8血清型(Uu3、Uu8)及从女性患者宫颈中分离鉴定的21株Uu临床株进行体外培养后,扫描电镜、激光共聚焦显微镜鉴定生物被膜形成,并在生物被膜形成前后进行约敏测定(四环素、红霉素、环丙沙星).配对秩和检验及x2检验分别比较Uu游离状态及形成生物被膜后最低抑菌浓度间及耐药率间的差异.结果 Uu3、Uu8及21株Uu临床株均具有体外形成生物被膜的能力.Uu形成牛物被膜后对四环素、红霉素及环丙沙星的最低抑菌浓度较游离状态明显增高(P<0.001).Uu形成生物被膜后对红霉素及环丙沙星的耐药率增高具有统计学意义(P值分别为<0.001及0.035),但对四环素的耐药率增高无统计学意义(P=0.293).结论 Uu标准株及临床株均具有体外形成生物被膜的能力,Uu形成生物被膜后对抗菌素的抵抗力增加,出现了多重耐药现象.

Abstract：

Objective To study the ability of standard strain and clinical isolates of Ureaplasma spp. to form biofilms in vitro and to compare the antibiotic susceptibility of sessile cells and their planktonic counterparts. Methods A total of 21 Ureaplasma wealyticum(Uu) isolates recovered from female patients diagnosed with cervicitis and Uu serovar 3 and Uu serovar 8( Uu3, Uu8) were included. Scanning electron microscope and confocal scanning laser microscopy were used to identify biofilm formation. Conventional antibiotic susceptibility tests and biofilm susceptibility assays for tetracycline, erythromycin and ciprofloxacin were carried out. The paired rank sum test and was applied to analyze the statistical differences between the MIC and the minimal biofilm inhibitory concentration. The x2 test was applied to analyze the statistical differences of global resistance percentages between planktonic cells and sessile cells. Results Uu3, Uu8 and 21 Uu isolates all can form biofilms in vitro. Minimal inhibitory concentration of sessile cells compared with planktonic cells were obviously higher for tetracycline, erythromycin and ciprofloxacin (P <0.001). Global resistance percentages between planktonic cells and sessile cells were different for erythromycin (9.52% vs 61.90% , P < 0. 001), ciprofloxacin ( 80. 95% vs 100% , P = 0. 035 ) and tetracycline (4. 76% vs 14.29% , P =0.293). Conclusion Uu isolates and Uu1, Uu8 all can form biofilms in vitro, and biofilm formation can strengthen resistance of Uu to antibiotics, even multidrug resistance was observed.     

解脲脲原体对红霉素体外耐药性与ermB基因相关性研究

目的 探讨解脲脲原体(Uu)临床株对红霉素体外耐药性与ermB耐药基因之间的关系.方法 采用微量肉汤稀释法体外测定143株临床分离的Uu对红霉素的最低抑菌浓度(MIC),以MIC≥8μg/ml为耐药判读标准;设计引物扩增ermB基因,并以多条带抗原基因为靶位设计引物对Uu进行生物学分群.结果 Uu对红霉素MIC范围为≤0.125μg/至≥128μg/ml,MIC50为16 μg/ml,MIC90≥128 μg/ml,耐药率为64.38%.ermB基凶总的阳性率为27.97%,主要分布在MIC≥8 μg/ml的菌株.两生物群之间不存在红霉素耐药性及ermB基因阳性率的差异.结论 ermB基因可能是介导Uu对红霉素耐药的基因,两生物群在对红霉素耐药性机制的差异需进一步研究.     

parC检测在解脲支原体基因分型中的临床应用

目的 根据parC基因序列差异建立一种解脲支原体基因分型方法,以实现其两个生物型Uu(Ureaplasma urealyticum)和Up(Ureaplasma parvum)的快速鉴定,便于临床常规应用.方法 依据解脲支原体14个血清型标准株parC基因序列,设计可区分Uu和Up的特异性引物与和探针;通过检测serovarl和serovat4标准株、50份解脲支原体临床分离株(Uu 12株,Up38株),7种阴道常见分离菌以鉴定该方法的特异性;留取70例性病门诊非淋球菌性泌尿生殖道炎症患者和71例妇科正常体检者的标本,分别进行解脲支原体培养和基因分型鉴定,以比较两种方法的敏感性,并应用统计学分析Uu、Up在性病和正常人群中分布的差异.结果 应用parC基因分型法成功将serovar1标准株、serovat4标准株、Uu和Up临床分离株鉴别,Uu、Up两生物群之间以及7种阴道常见菌均未出现非特异性扩增;基因分型方法的敏感性显著高于培养法(P＜0.05);在70例性病门诊患者中,Uu和Up的检出率分别为8.57％和61.40％,两者混合感染为24.30％;在71例妇科体检人群中Uu和Up检出率分别为7.04％和67.60％,两者混合感染为8.45％,性病门诊病人中解脲支原体感染率显著高于体检人群(P＜0.05),Uu和Up单纯感染在两群体中的分布差异无统计学意义(P＞0.05),而混合感染在性病门诊病人中显著增加(P＜0.05).结论 解脲支原体在性病患者中的感染率显著高于健康体检者,且混合感染在性病患者中明显增加,而Uu和Up单纯感染在两人群中分布差异无统计学意义,因此解脲支原体的致病可能与其不同基因型的混合感染有关.     

解脲脲原体分群、tetM四环素耐药基因、intTn916接合型转座子遗传标记研究

目的了解解脲脲原体(U.urealyticum,UU)生物分群、tetM四环素耐药基因、intTn916接合型转座子遗传标记状况。方法对54株UU菌进行了分群、tetM四环素耐药基因、intTn916接合型转座子遗传标记检测。结果54株UU中检出Ⅰ群47株(87.0%)、Ⅱ群6株(10.5%)、Ⅰ群 Ⅱ群1株(1.8%);tetM耐药基因检出36株(63.2%);intTn916接合型转座子遗传标记检出42株(73.7%)。结论本组UU以Ⅰ群为主,tetM基因、intTn916接合型转座子遗传标记携带率高。     

解脲脲原体生物膜胞外多糖的检测

目的 研究解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)4个型别标准株在体外形成的生物膜之胞外多糖的分布及结构成分.方法 将Uu标准株Parvo群中4、8血清型和T960群中3、14血清型进行体外生物膜培养后,扫描电镜下观察生物膜组成及结构,并在FITC-ConA/PI及ECA/PI双荧光染色后进行激光共聚焦显微镜观察及测定平均荧光强度.秩和检验及t检验分别比较两种荧光标记物、两生物群的总体平均荧光强度的差异.结果 4个型别Uu标准株均可在体外形成生物膜,生物膜结构主要呈网格状,胞外物质占大部分比例.在激光共聚焦显微镜下,Uu生物膜胞外多糖均可被FITC-ConA和ECA染色,FTTC-ConA呈网格状分布,ECA小片状聚集分布.FITC-ConA的总体平均荧光强度较ECA高,差异有统计学意义(P＜0.001).结论 Uu体外培养生物膜主要呈网格状结构,胞外多糖中含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡聚糖残基,并以葡萄糖、甘露糖残基为主.     

解脲脲原体感染的检测与体外耐药性分析

目的探讨本地区解脲脲原体(Uu)感染及耐药情况,指导临床合理用药。方法对临床送检的531份标本进行Uu培养、计数、鉴定和药敏试验;对775份标本进行荧光定量PCR(FQ-PCR)法和培养法检测Uu。结果FQ-PCR法检出Uu阳性339例,阳性率43.74%。培养法检出Uu206例,阳性率38.79%。Uu对9种抗菌药物的耐药率最高为环丙沙星(CIP)80.10%,最低为交沙霉素(JOS)0.00%,敏感率最高为原始霉素(PRI)98.54%。结论Uu用两种方法检测均可有效检出。培养法能提供药敏结果,更有利于临床治疗。药敏结果提示本地区Uu感染经验用药可选择交沙霉素和强力霉素。     

STD者人型支原体培养阳性的分子鉴定及四环素耐药的分子检测

目的　为评价人型支原体 (Mh)培养的正确性和Mh对四环素敏感状况。方法　收集 48例经法国梅里厄公司MycoplasmaID支原体鉴定培养基培养判别为Mh阳性的培养物进行Mh套式PCR检测以作分子鉴定 ,并对Mh套式PCR阳性的培养物作四环素耐药决定基因TetM基因PCR检测。结果　 48例MycoplasmaID支原体鉴定培养基培养判别为Mh阳性的培养物 45例经Mh套式PCR检测为阳性 ;该 45例TetM基因PCR检测均为阴性。结论　Mh培养至少存在假阳性。四环素类仍是Mh治疗的敏感药物     

gyrA和parE基因检测在脲原体基因分型中的应用

目的 研究gyrA和parE基因检测在脲原体基因分型中的作用.方法 脲原体培养与药敏分析用Mycoplasma IST检测试剂盒;在脲原体培养阳性者中选取对喹诺酬耐药标本60份,PCR扩增gyrA和parE基因,扩增产物经测序分析后与基因库中的脲原体各血清型进行比对.结果 gyrA扩增片段在血清型1、3、6、14之间核苷酸序列相似性为100%,在血清型2,4、5、7～13之间核苷酸序列相似性100%,两组之间核苷酸序列相似性91%.parE扩增片段在血清型1、3、6、14之间的核苷酸序列相似性为98%～99%;pare扩增片段在血清犁2、5、7、8、11之间核苷酸序列相似性100%,在血清型4、12、13之间核苷酸序列相似性100%,两组之间核苷酸序列相似性为90%.60份标本中微小脲原体(Ureaplasma parvum,Up)占68.3%(41/60),解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)占21.7%(13/60),两型混合感染占10%(6/60).在Up中,血清型3占48.8%(20/41).结论 gyrA检测可把脲原体分为微小脲原体和解脲脲原体两个基因型,parE检测可把微小脲原体分为4个亚型,分别与血清型1、3、6、14完全一致,其中血清型3感染最常见.     

抗解脲脲原体单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗解脲脲原体(Uu)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用灭活的Uu免疫BALB/c小鼠,采用常规的细胞融合技术制备抗Uu的mAb。以ELISA和免疫组织化学染色法对mAb的亚类、效价及特异性进行鉴定。结果:获得3株抗Uu的mAb,均为IgG2b亚类。3株mAb的腹水ELISA效价为10-4~10-5。有2株只与Uu产生反应而不与肺炎支原体、淋球菌(gonococcus/GC)及豚鼠气单胞菌(A.cariae)等病原体发生交叉反应。免疫组化结果表明,mAb能和解脲脲原体特异性结合。结论:制备了3株具有较高的特异性和效价的抗UumAb,为Uu的免疫学检测及相关研究提供重要的制剂。     

淋病奈瑟菌临床菌株PⅠ基因型及PⅠB基因点突变分析

目的分析浙江地区淋病奈瑟菌株外膜孔蛋白PⅠ基因序列及其点突变与耐药性关系，了解本地区淋病奈瑟菌株PⅠA与PⅠB基因分布及其优势基因型。方法采用高保真PCR扩增34株淋病奈瑟菌全长PⅠ基因序列，T-A克隆后测序。根据测序结果，建立多重PCR同时检测113株淋病奈瑟菌PⅠA和PⅠB基因。分析测序菌株PⅠB基因中与耐药性密切相关的G120和A121变异情况，采用二倍琼脂稀释法确定PⅠB菌株的耐药性。结果11株PⅠA^＋淋病奈瑟菌均为ⅠA6血清型。23株PⅠB^＋淋病奈瑟菌中，6株（26．1％）为ⅠB3血清型、5株（21．7％）为ⅠB3／6血清型、2株（8．7％）为ⅠB4血清型、9株（39．1％）为ⅠB3／6-ⅠB2嵌合血清型、1株（4．3％）为ⅠB2-ⅠB4嵌合血清型。所建立的多重PCR可特异和准确地对PⅠA和PⅠB基因分型，检测灵敏度为10雌DNA模板。113株淋病奈瑟菌中，26株（23．0％）和87株（77．0％）分别携带PⅠA和PⅠB基因。经测序的23株PⅠB^＋淋病奈瑟菌中，1株（4．3％）G120和A121均未突变，3株（13．0％）G120或A121突变，2株、8．7％）G120突变但A121缺失，17株（73．9％）双位点突变。22株G120和／或A121突变的PⅠB^＋菌株均对青霉素和四环素耐药。结论所建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌PⅠA和PⅠB基因的分型检测。本地区流行的淋病奈瑟菌主要携带PⅠB基因。ⅠA6为PⅠA菌株优势血清型。PⅠB菌株以ⅠB3／6-ⅠB2嵌合、ⅠB3和ⅠB3／6血清型常见，但主要为耐药性G120和／或A121突变株。     

生殖支原体及解脲脲原体对妊娠的影响研究

目的：进一步探讨生殖支原体（Mg)及解脲脲原体（Uu)对妊娠的影响。方法：应用灵敏、特异的套式PCR（nPCR）技术对219例胎盘组织进行Mg、Uu检测,并对Mg、Uu nPCR阳性产物各1例进行了DNA序列测定以验证。结果：早产、胎膜早破者的Mg、Uu,胎儿窘迫者的Mg之阳性检出率均明显高于正常妊娠者（P均小于0．01）;另外,上胎流产、死胎者和本次妊娠3．00以上,呈强关联。结论：Mg与Uu一样,围产期感染可致不良妊娠结局。     

22株肠球菌耐药性及8种耐药基因研究

我们收集了2003年12月至2004年5月分离自解放军98医院(湖州)的22株肠球菌，对其进行了耐药性和8内酰胺类耐药相关基因(TEM)、氨基糖苷类耐药相关基因[aac(6′／aph(2″)，aph(3′)Ⅲ，ant(6Ⅰ)]、四环素耐药相关基因(terM)、红霉素耐药相关基因(ermB)、万古霉素耐药相关基因(vanA、vanB)检测。     

418例不孕妇女宫颈解脲脲原体和沙眼衣原体检测分析

目的了解解脲脲原体(Uu)与沙眼衣原体(CT)在不孕妇女中的感染率,探讨Uu、CT感染与不孕症的关系.方法对418例不孕妇女及52例正常早期妊娠妇女的宫颈分泌物进行Uu、CT的检测.结果不孕组Uu、CT阳性率为46.4%、17 7%,均显著高于对照组(P＜0.01).继发不孕组Uu阳性率为59.2%,显著高于原发不孕组(P＜0.01);继发不孕组CT阳性率为19.7%,高于原发不孕组,但无显著性意义(P＞0.05).225例Uu或/和CT感染患者经抗感染治疗后3个月内自然妊娠42例(18.7%).结论Uu、CT感染是导致不孕症的重要因素,把Uu、CT列为不孕妇女的常规检测项目,有利于不孕症的诊治.     

溶脲型脲原体感染与自然流产关系研究

本文应用聚合酶链反应（PCR）检测自然流产患者组织中溶脲型脲原体（Ureaplasmaurealytlicum，UU），所用引物是按UU尿素酶基因序列设计的，扩增片段为283bp。66例自然流产患者和30例正常人工流产患者作了UU－DNA检测，其阳性率分别为45．5％和13．3％，两者比较P＜0．005。关于流产次数与UU感染的关系，自然流产1、2、3、4次患者UU阳性率分别为30．2％、66．7％、83．3％和100％，与对照组比较，自然流产2次以上，P＜0．005。结果表明UU感染是引起自然流产的重要因素，并且与流产次数密切相关。     

肺炎链球菌耐药基因ermB、mefA、tetM与转座子整合酶基因intTn的检测

目的 研究耐药基因ermB、mefA、tetM与转座子整合酶基因intTn在携带肺炎链球菌的北京儿童中分布特点。方法对185株呼吸道感染患儿鼻咽部分离的肺炎链球菌进行以下检测：E-test、琼脂稀释或纸片扩散法测定对大环内酯类、四环素、β-内酰胺类及头孢类等15种抗生素的药物敏感性。PCR检测大环内酯类耐药基因ermB和mef/A，四环素耐药基因tetM以及转座子Tn1545的整合酶基因intTn。结果185株肺炎链球菌的药敏结果显示，对红霉素、克林霉素、四环素和复方磺胺甲基异嗯唑的耐药率较高，分别为78．9％、76．2％、86．0％和78．7％，对阿莫西林，克拉维酸、头孢克洛、头孢曲松和头孢呋辛耐药率较低，分别为2．2％、15．5％、2．8％和14．1％。所有红霉素耐药株均检出ermB和／或mefA，其中79．5％为ermB阳性，17．8％为ermB和mefA同时阳性，2．7％为mefA阳性。tetM基因在分离株中的阳性率是87％，四环素耐药组的tetM基因携带率是96．9％，高于敏感组（26．9％）。四环素耐药株的红霉素耐药率（90．0％）亦高于敏感株组（11．5％）。87．6％的肺炎链球菌存在intTn基因，intTn基因阳性组的红霉素、四环素、氯霉素、复方磺胺甲基异嗯唑和环丙沙星的耐药率较intTn基因阴性组高。分离株最常见的基因组合是intTn＋terM＋ermB，占58．4％。结论北京地区呼吸道感染儿童鼻咽部肺炎链球菌耐大环内酯类抗生素的主要原因是ermB编码的23S rRNA甲基化酶致靶位改变。tetM基因编码蛋白质的核糖体保护作用，是肺炎链球菌四环素耐药的重要机制。接合性转座子Tn1545的存在与菌株的红霉素和四环素耐药关系密切，可能是肺炎链球菌多重耐药的重要机制之一。     

鲍曼不动杆菌临床株多重药物外排泵AdeABC的研究

目的 研究鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)临床株外排泵AdeABC的表达与耐药的关系及表达调控.方法 微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌临床株对抗菌药物的敏感性及泵抑制剂作用,RT-PCR检测泵基因adeB的mRNA表达水平,PCR扩增泵调控基因adeRS并测序分析.结果 30株多重耐药的鲍曼不动杆菌临床株及5株敏感株均存在泵结构基因片段adeB和调控基因adeRS,随机选取15株多重耐药株中均检测到adeB的mRNA表达,而在5株敏感株中无表达.测定2株多重耐药株调控基因adeRS序列均出现基因突变,发生氨基酸替代及缺失.结论 鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC的表达可能与耐药性有关,在多重耐药株中存在着调控基因adeRS的基因序列变化.