白藜芦醇对大鼠脊髓损伤早期Bcl-2和Bax表达的影响

目的：探讨脊髓损伤后使用白藜芦醇对脊髓损伤早期Bcl-2和Box表达的影响。方法：2004～06／09在武汉大学人民医院动物实验中心将62只SD健康成年雄性大鼠随机分成5组，据Allen’s法制成中度脊髓损伤模型，术后立即腹腔注射白藜芦醇100mg／kg或甲基强的松龙(MPSS)100mg／kg；通过免疫组织化学染色观察脊髓损伤8，24及72h后白藜芦醇组脊髓Bcl-2和Box表达的变化，并与MPSS组进行疗效对比。结果：与损伤组比较，Bcl-2表达在损伤后8h差异无显著性意义(P&;gt;0．05)，显示白藜芦醇对损伤后的脊髓无干预作用，而24及72h后差异有显著性意义(P&;lt;0．01)，表明白藜芦醇能够增强Bcl-2表达，对损伤后脊髓有明显作用；Bax表达在损伤后8及72h差异有显著性意义(P&;lt;0．05)，其中24h时最为显著(P&;lt;0．01)，表明白藜芦醇可抑制Bax表达，对损伤后的脊髓有干预作用；白藜芦醇与MPSS组间差异无显著性意义(P&;gt;0．05)，即白藜芦醇对损伤后脊髓有相似作用。结论：白藜芦醇在脊髓损伤早期能够有效上调Bcl-2表达及下调Bax表达．对损伤后脊髓起保护作用。     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Bcl-2及Bax和Bcl-xl表达的影响

背景：中枢神经系统损伤后，神经细胞的凋亡在继发性损伤中发挥重要作用。近年来有研究表明二甲胺四环素抑制凋亡对脑组织缺血有明显的神经保护功能。 目的：探讨二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和相关因子表达的影响及对损伤脊髓神经功能的保护作用。 设计：随机对照动物实验。 单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院。 材料：实验于2003—11／2004-12在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。成年雄性SD大鼠36只，随机分成4组：①空白组6只。②损伤组10只。③二甲胺四环素治疗组10只。④甲基强的松龙治疗组10只。 方法：建立脊髓损伤模型，空白组只暴露脊髓，不损伤；损伤组损伤脊髓，不治疗；二甲胺四环素治疗组大鼠伤后1h给予腹腔内注射二甲胺四环素（50ms／ks），24h后再次给予50mg,／kg剂量注射，然后再给予5d的25mg／kg的剂量治疗。甲基强的松龙治疗组大鼠伤后1h予腹腔内注射甲基强的松龙（100ms／ks）。空白组和损伤组予生理盐水注射，给药方法同二甲胺四环素治疗组。主要观察指标：①各组大鼠神经功能评估结果。②免疫组化法检测损伤脊髓神经细胞凋亡因子（Bcl-2，Bcl-xl，Bax）的表达。③各组大鼠脊髓组织细胞凋亡指数。 结果：36只大鼠均进入结果分析。①二甲胺四环素治疗组的神经功能较损伤组提高（P〈0．05），与甲基强的松龙组差异无显著性意义（P〉0．05）。②二甲胺四环素治疗组Bcl-2阳性表达细胞多于损伤组，差异有显著性[（62．53&;#177;7．76）％，（35．14&;#177;3．70）％，P〈0．05]，Bcl-xl，Bax表达与损伤组差异无显著性（P〉0．05）。③损伤组的凋亡阳性细胞多于二甲胺四环素治疗组和甲基强的松龙治疗组[（441．63&;#177;5．90）％，（32．71&;#177;5．26）％。（34．31&;#177;6．84）％，P〈0．05]。 结论：二甲胺四环素能上调Bcl-2的表达，改变Bcl-2／Bax的比值，从而抑制脊髓神经细胞凋亡，对损伤脊髓的神经功能有保护作用。     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Bcl-2及Bax和Bcl-xl表达的影响

背景:中枢神经系统损伤后,神经细胞的凋亡在继发性损伤中发挥重要作用。近年来有研究表明二甲胺四环素抑制凋亡对脑组织缺血有明显的神经保护功能。目的:探讨二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和相关因子表达的影响及对损伤脊髓神经功能的保护作用。设计:随机对照动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院。材料:实验于2003-11/2004-12在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。成年雄性SD大鼠36只,随机分成4组:①空白组6只。②损伤组10只。③二甲胺四环素治疗组10只。④甲基强的松龙治疗组10只。方法:建立脊髓损伤模型,空白组只暴露脊髓,不损伤;损伤组损伤脊髓,不治疗;二甲胺四环素治疗组大鼠伤后1h给予腹腔内注射二甲胺四环素(50mg/kg),24h后再次给予50mg/kg剂量注射,然后再给予5d的25mg/kg的剂量治疗。甲基强的松龙治疗组大鼠伤后1h予腹腔内注射甲基强的松龙(100mg/kg)。空白组和损伤组予生理盐水注射,给药方法同二甲胺四环素治疗组。主要观察指标:①各组大鼠神经功能评估结果。②免疫组化法检测损伤脊髓神经细胞凋亡因子(Bcl-2,Bcl-xl,Bax)的表达。③各组大鼠脊髓组织细胞凋亡指数。结果:36只大鼠均进入结果分析。①二甲胺四环素治疗组的神经功能较损伤组提高(P<0.05),与甲基强的松龙组差异无显著性意义(P>0.05)。②二甲胺四环素治疗组Bcl-2阳性表达细胞多于损伤组,差异有显著性(62.53±7.76)%,(35.14±3.70)%,P<0.05,Bcl-xl,Bax表达与损伤组差异无显著性(P>0.05)。③损伤组的凋亡阳性细胞多于二甲胺四环素治疗组和甲基强的松龙治疗组(44.63±5.90)%,(32.71±5.26)%,(34.31±6.84)%,P<0.05。结论:二甲胺四环素能上调Bcl-2的表达,改变Bcl-2/Bax的比值,从而抑制脊髓神经细胞凋亡,对损伤脊髓的神经功能有保护作用。     

二甲胺四环素对大鼠脊髓损伤后Bcl-2、Bax和Bcl-xl表达的影响

目的：探讨二甲胺四环素（minocycline）对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和相关因子表达的影响及对损伤脊髓神经功能的保护作用。方法：36 只SD大鼠分为4组，空白组只暴露脊髓，不损伤，A、B组及损伤组建立脊髓损伤模型。A、B组分别给予二甲胺四环素和甲基强的松龙腹腔内注射；损伤组和空白组腹腔内注射生理盐水。免疫组化法检测4组大鼠损伤脊髓神经细胞凋亡因子（Bcl-2 、Bcl-xl、 Bax）的表达； TUNEL 标记凋亡细胞。结果：A组的神经功能高于损伤组（P〈0.01），与B组差异无显著性意义；损伤组的凋亡阳性细胞多于A、B组（P〈0.05）；A组Bcl-2阳性表达细胞多于损伤组（P〈0.05），而Bcl-xl、 Bax表达与损伤组差异无显著性意义。结论：凋亡是脊髓损伤后神经细胞死亡的一种重要方式； 二甲胺四环素能上调Bcl-2的表达，改变Bcl-2/Bax的比值，从而抑制脊髓神经细胞凋亡，对损伤脊髓的神经功能有保护作用。     

Bcl-2/Bax与脊髓损伤

细胞凋亡在脊髓继发性损伤过程中起着关键性作用。Bcl-2是一个多基因家族,成员有15种之多,其中Bcl-2、Bcl-xL抑制细胞凋亡,而Bax、Bad、Bak、Bcl-xS促进其凋亡,Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中最具代表性的基因,其比率决定细胞是否凋亡。近年来国内外通过调节Bcl-2/Bax的比例促进脊髓损伤修复的最新研究进展作一综述。     

督脉电针上调脊髓损伤早期大鼠Bcl-2 mRNA及蛋白的表达

背景：针灸对脊髓损伤后期神经功能的恢复具有明显的促进作用已得到客观证实，本课题组以往的实验已证实电针可抑制脊髓损伤早期细胞凋亡，但电针抑制细胞凋亡的机制尚不清楚。目的：通过原位杂交及免疫组织化学方法观察电针对凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响，探讨电针干预脊髓损伤早期细胞调亡可能的机制。设计：开放性动物实验。单位：解放军第二军医大学解剖学教研室，上海市针灸经络研究中心。材料：成年雄性SD大鼠，清洁级，鼠龄两三个月。Bcl-2原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司）；Bcl-2抗体（1：200，Santa Cruz Biotechnology公司）。方法：实验于2004—07／2005—12在解放军第二军医大学解剖学教研室完成。实验大鼠随机分为模型组、电针治疗组、甲基强的松龙组及假手术组。采用改良的Allen’s垂击法致大鼠T10脊髓损伤，损伤后即刻进行督脉电针治疗，应用原位杂交和免疫组织化学方法结合图象定量分析法进行评估。主要观察指标：①脊髓损伤早期Bcl-2 mRNA和蛋白的表达。②电针对Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响结果：实验过程中如遇动物死亡，及时补充，最终42只大鼠进入结果分析。①假手术组有中等量的Bcl-2 mRNA及蛋白表达。模型组在脊髓损伤后6hBcl-2 mRNA表达有增高趋势，Bcl-2蛋白表达未见明显变化；伤后24hBcl-2 mRNA表达增高，Bcl-2蛋白表达也相应增高。电针组Bcl-2 mRNA及蛋白表达均高于模型组（P〈0．05），与甲基强的松龙组相比无显著性差异。②电针及甲基强的松龙治疗6h组，Bcl-2 mRNA阳性细胞数增加，灰度值降低，与假手术组和模型组相比差异有显著性和非常显著性意义（P〈0．05-0．01）。电针24h治疗组，Bcl-2 mRNA阳性细胞数显著增高，灰度值降低，与假手术组及模型组相比差异均具有显著性和非常显著性意义俨〈0．05-0．01）。⑧电针24h治疗组，Bcl-2免疫阳性细胞明显增加，灰度值降低，与假手术组和模型组相比，差异具有显著性和非常显著性意义俨〈0．05-0．01）。结论：电针可上调Bcl-2 mRNA及蛋白的表达，进而对脊髓损伤早期细胞调亡具有部分抑制作用。     

督脉电针上调脊髓损伤早期大鼠Bcl-2 mRNA及蛋白的表达

背景:针灸对脊髓损伤后期神经功能的恢复具有明显的促进作用已得到客观证实,本课题组以往的实验已证实电针可抑制脊髓损伤早期细胞凋亡,但电针抑制细胞凋亡的机制尚不清楚。目的:通过原位杂交及免疫组织化学方法观察电针对凋亡抑制基因Bcl-2mRNA及蛋白表达的影响,探讨电针干预脊髓损伤早期细胞调亡可能的机制。设计:开放性动物实验。单位:解放军第二军医大学解剖学教研室,上海市针灸经络研究中心。材料:成年雄性SD大鼠,清洁级,鼠龄两三个月。Bcl-2原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司);Bcl-2抗体(1∶200,SantaCruzBiotechnology公司)。方法:实验于2004-07/2005-12在解放军第二军医大学解剖学教研室完成。实验大鼠随机分为模型组、电针治疗组、甲基强的松龙组及假手术组。采用改良的Allen’s垂击法致大鼠T10脊髓损伤,损伤后即刻进行督脉电针治疗,应用原位杂交和免疫组织化学方法结合图象定量分析法进行评估。主要观察指标:①脊髓损伤早期Bcl-2mRNA和蛋白的表达。②电针对Bcl-2mRNA和蛋白表达的影响结果:实验过程中如遇动物死亡,及时补充,最终42只大鼠进入结果分析。①假手术组有中等量的Bcl-2mRNA及蛋白表达。模型组在脊髓损伤后6hBcl-2mRNA表达有增高趋势,Bcl-2蛋白表达未见明显变化;伤后24hBcl-2mRNA表达增高,Bcl-2蛋白表达也相应增高。电针组Bcl-2mRNA及蛋白表达均高于模型组(P<0.05),与甲基强的松龙组相比无显著性差异。②电针及甲基强的松龙治疗6h组,Bcl-2mRNA阳性细胞数增加,灰度值降低,与假手术组和模型组相比差异有显著性和非常显著性意义(P<0.05～0.01)。电针24h治疗组,Bcl-2mRNA阳性细胞数显著增高,灰度值降低,与假手术组及模型组相比差异均具有显著性和非常显著性意义(P<0.05～0.01)。③电针24h治疗组,Bcl-2免疫阳性细胞明显增加,灰度值降低,与假手术组和模型组相比,差异具有显著性和非常显著性意义(P<0.05～0.01)。结论:电针可上调Bcl-2mRNA及蛋白的表达,进而对脊髓损伤早期细胞调亡具有部分抑制作用。     

孕酮对大鼠脊髓损伤后早期细胞凋亡的影响

目的:探讨孕酮对大鼠脊髓损伤后早期细胞凋亡的影响。方法:60只雄性SD大鼠随机分成假手术组、损伤组、孕酮组,采用改良的Allen’s撞击法制作脊髓损伤模型。孕酮组在造模成功后1、6、24、487、2 h腹腔注射16 mg/kg孕酮。术后6、24、48、75 h取材,采用HE染色观察脊髓形态学的变化,免疫组织化学法检测Caspase-3的表达,原位末端标记法(TUNEL染色)检测细胞凋亡。结果:假手术组大鼠脊髓形态正常,偶见凋亡细胞及Caspase-3阳性细胞;与损伤组相比,孕酮组术后各时间点的凋亡指数下降,Caspase-3阳性细胞数显著减少,差异有统计学意义。结论:抑制脊髓损伤后的细胞凋亡可能是孕酮的神经保护作用机制之一。     

大鼠急性脊髓损伤后早期血红素氧合酶-1的表达

目的研究大鼠急性脊髓损伤后血红素氧合酶- 1( HO)-1在脊髓表达的变化. 方法参考 Nystr(o)m方法建立大鼠脊髓压迫伤模型( T8～ 9),对损伤后早期不同时间点应用免疫组化、病理学及图像分析检测 HO-1蛋白的表达.应用化学比色法检测不同时间点脊髓中 HO活性的变化. 结果正常脊髓组织内存在少量 HO 1蛋白的表达,脊髓损伤后 4 h HO-1表达增强, 16 h达高峰,之后渐减弱.与正常组、假手术组相比损伤各组 HO活性明显增高 (P< 0.05). 结论脊髓压迫损伤后 HO-1表达迅速增强,提示 HO-1参与了脊髓继发损伤的病理生理过程,其表达可能具有保护作用.     

电刺激对大鼠脊髓损伤后神经生长因子表达的影响

目的探讨电刺激对成年大鼠脊髓损伤后脊髓灰质神经元神经生长因子(NGF)表达的影响。方法健康成年SD大鼠72只,随机分为正常组、损伤对照组、电刺激组。采用Allen法,将后两组复制为脊髓T9损伤模型。术后对电刺激组大鼠进行电刺激治疗7 d。于术后l d、3 d、5 d、7 d对3组进行BBB评分,免疫组化和Western blot法检测NGF的表达情况。结果 BBB评分结果显示大鼠脊髓损伤后有自行恢复功能,从第5天开始电刺激组与损伤对照组有显著性差异(P<0.05)。脊髓损伤后,电刺激组和损伤对照组NGF表达均持续升高(P<0.05),电刺激组表达多于损伤对照组(P<0.05)。结论脊髓损伤后电刺激诱导损伤区NGF表达,从而创造了有利于神经再生的微环境。     

Nogo-A在脊髓损伤大鼠脊髓组织中的动态表达

目的:观察大鼠脊髓损伤后神经生长抑制因子Nogo-A在脊髓组织中的动态表达变化,探讨Nogo-A蛋白在神经再生过程中的意义和作用。方法:选用108只SD大鼠随机分成正常组、假手术组和模型组,每组36只,A组不做任何处理,B组咬除T_9-T_(11)棘突及椎板,避免损伤脊髓;C组按照改良Allen法造模。分别于干预后24h、第3天、第7天、第14天处死大鼠,每组9只,以免疫组化及Western Blot检测各组大鼠脊髓组织中Nogo-A蛋白的表达变化,以荧光定量PCR检测Nogo-A mRNA表达变化。结果:正常组、假手术组各时间点Nogo-A蛋白和mRNA无显著变化(P0.05)。模型组在损伤后24h Nogo-A蛋白和mRNA表达较低,3d后下降至最低,7d后迅速上升达到高峰,至14d逐渐下降,但仍高于假手术组;与假手术组比较,模型组在损伤后7d、14d,Nogo-A蛋白和mRNA表达均明显增高,差异均有显著性意义(P0.05)。结论:大鼠脊髓损伤后,Nogo-A蛋白在早期一过性下降后可持续保持高水平表达,可能是造成脊髓损伤后中枢神经系统神经再生困难的重要原因之一。     

大鼠脊髓损伤模型的改良及伤后再生基因-2蛋白的表达变化

目的:制备改良的大鼠脊髓损伤(SCI)动物模型,并探讨再生基因(Reg)-2蛋白在SCI后的表达规律。方法:采用36只SD大鼠。参考Allen法,使用自制打击装置致大鼠T13段脊髓中度损伤。以行为联合评分法(CBS)评定模型的可靠性。免疫印迹法和免疫组织化学(SABC)法对正常对照组、伤后第1天、第2天、第3天、第5天和第7天的大鼠脊髓组织中的Reg-2蛋白进行检测。结果:SCI后大鼠一般情况符合临床损伤特点,且稳定性强;各损伤组大鼠神经功能联合评分均呈明显下降趋势,与正常对照组比较差异具有显著性意义(P<0.05);在正常对照组大鼠脊髓神经元内有微量的Reg-2蛋白表达(阳性细胞数为17.3±2.6,Reg-2相对表达量为0.038±0.007)。SCI后1天,大鼠脊髓内Reg-2表达的免疫阳性细胞随着损伤时间的推移逐渐增多,至伤后第7天仍呈高水平表达(阳性细胞数为90.0±3.6,相对表达量为0.694±0.018),各组间比较差异具有显著性意义(P<0.05)。伤后3天内,Reg-2免疫阳性细胞以后角神经元为主,而伤后7天以前角神经元和胶质细胞为主。结论:本实验装置制作的大鼠SCI模型稳定、可靠;SCI后Reg-2蛋白表达开始升高,对受损神经起保护和修复作用。     

嗅鞘细胞移植脊髓损伤大鼠NG2的表达

背景: 对于脊髓损伤,目前临床尚无有效的治疗对策,近年来嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤修复取得了一定的进展.NG2是主要的硫酸软骨素蛋白多糖分子,对轴突有抑制作用.目的: 观察嗅鞘细胞移植对脊髓损伤大鼠NG2表达的影响,进一步分析嗅鞘细胞移植在修复脊髓损伤中的作用途径.方法: 将112只大鼠随机分为4组,空白组、模型组、嗅鞘细胞移植组及DF12组各28只.空白组仅切开T10全椎板及T9,T11部分椎板,对脊髓未作其他处理;其他3组应用脊髓横切法制作脊髓损伤动物模型.嗅鞘细胞移植组进行嗅鞘细胞移植,每侧断端植入20 000 cells;DF12组于相同部位注射DF12培养液.在大鼠脊髓损伤后1,3,7,14,28,42和56 d时,取材按照SP试剂盒的操作步骤检测NG2的表达.结果与结论: 空白组NG2呈低表达,在模型组、DF12组脊髓损伤24 h后损伤部位的NG2的表达开始升高,7 d时达到顶点,4周时NG2表达明显降低,6,8周时仅在局部有所表达.嗅鞘细胞移植组脊髓损伤1 d时NG2表达开始增加,主要在损伤部位,在各时间点与模型组、DF12组相比NG2表达水平明显降低,但高于空白组NG2各时间点的表达.提示嗅鞘细胞移植后NG2的表达水平降低,嗅鞘细胞具有抑制NG2表达的作用,可消除或减轻细胞外基质中对轴突有抑制作用的化学屏障,这可能是其治疗脊髓损伤促进轴突再生的机制之一.     

磁刺激对脊髓损伤组织c-fos基因表达的影响

目的　观察磁刺激对损伤脊髓组织中c -fos基因表达的影响。方法　用Allen氏WD法制造大鼠T8脊髓损伤的动物模型。 38只Wistar大鼠随机分为正常组 ( 6只 )、脊髓损伤治疗组 ( 16只 )和对照组 ( 16只 )。治疗组于术后 15min、1h、2h和 4h分别予以磁刺激 ( 0 .5Hz ,70 %最大输出强度 ) ,对照组无特殊处理。治疗组、对照组分别于术后 15min、1h、2h和 4h各取 4只动物处死 ,取损伤段脊髓组织 ,作石蜡切片 ,用地高辛标记的c -fos基因探针进行原位杂交 ,测定c -fosmRNA在损伤脊髓组织中的表达 ,用免疫组织化学方法检测fos蛋白的表达。结果　fos蛋白OD值在正常组为 3.78± 0 .72 ,在对照组明显增多 (最高达 16 .49± 1.3) ,而治疗组在各时段均低于对照组 (P <0 .0 1) ,c -fos基因表达在正常脊髓组织中呈弱阳性 ,在对照组中表达明显增加 ,治疗组c -fos基因表达的数目少于对照组 (P <0 .0 1)。结论　应用磁刺激能抑制脊髓损伤后c -fos基因的表达 ,这可能是磁刺激保护神经元并减轻脊髓继发性损伤的机理之一。     

脊髓损伤大鼠核因子kappa B与细胞凋亡及肢体功能间的相关性分析

Objective To investigate the relationship of nuclear factor kappa B(NF-κB),Bcl-2 and Bax with limb function after acute spinal cord injury in rats. Methods Forty-eight rats were divided at random into a control group and an experimental group with 24 rats in each.The spinal cords of the rats in the experimental group were injured at the T8,9,10 level through moderate compression.Four hours,8 h,and 1,3,7 and 14 days after the injury,4 rats were selected randomly from each group and graded with a BBB score.They were then sacrificed and their spinal cords were collected.Immunohistochemical measurements were used to observe the expression of NF-κB, Bcl-2 and Bax. Results NF-κB,Bcl-2 and Bax were observed in the injured spinal nerve cells of rats in the exper imental group but were absent in the control group.After injury,the expression of these factors increased at first and then decreased.BBB scores for limb function increased gradually.No correlation was found between the changes in NF-κB and Bcl-2,but the expression of NF-κB was positively correlated with that of Bax.There was negative correla tion between NF-kB levels and BBB scores,and between NF-kB levels and the ratio of Bcl-2 to Bax. Conclusion In rats,there is a close negative correlation between NF-kappa B levels,the ratio of Bcl-2/Bax and limb function after acute spinaI cord iujury.     

脊髓损伤大鼠核因子kappa B与细胞凋亡及肢体功能间的相关性分析

目的研究急性脊髓损伤（ASCI）大鼠核因子kappa B（NF-κB）与细胞凋亡及肢体功能间的相关性。 方法共选取48只雌性SD大鼠,将其随机分为实验组及对照组。2组大鼠均采用手术切除椎板,对照组术中未进行脊髓压迫处理,实验组大鼠术中采用压迫法制作脊髓中度损伤模型。2组均于术后第4 h、8 h、1 d、3 d、7 d及14 d时各随机选取4只大鼠,参照BBB评分标准对其后肢功能进行评定,待评分结束后处死大鼠并提取脊髓标本,采用免疫组织化学染色法检测各组大鼠脊髓标本内NF-κB、Bcl-2及Bax表达水平。 结果实验组大鼠受损脊髓神经细胞中有NF-κB、Bcl-2及Bax表达,且表达水平随术后时间延长呈现先增高、后降低过程;大鼠肢体功能BBB评分随时间延长而逐渐升高。经相关性分析发现,随着术后时间延长,实验组大鼠NF-κB表达量与Bcl-2表达量无明显相关性（P＞0.05）,与Bax表达量有正相关性（P＜0.05）,与Bcl-2/Bax比值及BBB评分有负相关性（P＜0.05）。 结论ASCI大鼠NF-κB表达与Bcl-2/Bax比值及肢体运动功能均具有显著负相关性。