人Wnt10b基因真核表达载体的构建及表达鉴定

目的：利用基因工程技术构建人Wnt10b基因的pEGFP-N1-Wnt10b真核表达载体,观察其在COS-7细胞中的表达。方法：以pUC19-Wnt10b为模板,PCR扩增人Wnt10b基因的cDNA编码区序列,扩增产物和pEGFP-N1载体双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pEGFP-N1-Wnt10b,酶切和测序鉴定该载体;LipofectamineTM2000将该载体转染入COS-7中,Western blot和免疫细胞化学检测COS-7 Wnt10b蛋白表达。结果：PCR扩增出的人Wnt10b基因cDNA正确克隆到pEGFP-N1载体,成功构建了pEGFP-N1-Wnt10b;将其转染入COS-7,COS-7 Wnt10b蛋白表达明显增高。结论：成功构建了人pEGFP-N1-Wnt10b,这为进一步研究Wnt10b基因功能奠定了前期基础。     

自噬在骨关节炎软骨细胞退变中的表达变化

目的：探讨自噬在骨关节炎(OA)软骨细胞中的表达及意义。方法收集临床 OA 及正常骨关节软骨标本各6例,分为 OA 组和对照组。免疫组化法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)和 Beclin-1在软骨组织中表达情况。分离关节软骨细胞并在低氧环境下培养,采用瞬时转染绿色荧光蛋白 LC3(GFP-LC3)在激光共聚焦显微镜下观察各组软骨细胞自噬变化,并用 Western blot 法检测软骨细胞中 LC3蛋白表达情况。结果 OA 组软骨组织中 LC3蛋白和Beclin-1蛋白的表达显著高于对照组(P <0．05);在 OA 组发现大量自噬颗粒形成,OA 组 GFP-LC3细胞阳性率显著高于对照组;OA 组软骨细胞中 LC3蛋白从 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转换表达显著高于对照组。结论自噬在 OA 软骨细胞退变的过程中起着重要作用,为 OA 发病机制的研究提供新的方向。     

磷酸化p38MAPK及ANK在终板软骨细胞退变模型中表达的变化

目的:探讨终板软骨细胞退变后磷酸化p38MAPK和ANK的表达变化。方法:取大鼠腰椎终板软骨细胞,酶消化法及自然传代法分离培养大鼠终板细胞,建立终板软骨细胞体外自然退变模型。采取甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色法,对该模型进行鉴定。以western-blot检测原代及第四代磷酸化p38MAPK及ANK的表达;RT-PCR检测原代及第四代Ank基因mRNA表达。结果:与原代相比第四代终板软骨细胞磷酸化p38MAPK表达量明显增加(P<0.01);ANK表达量明显下调(P<0.05)。结论:终板软骨细胞的退变伴随p38MAPK表达增强和ANK蛋白的表达减弱,两者与终板软骨细胞的退变存在明显关联,提示通过调控p38MAPK和ANK的表达可能影响终板软骨细胞的退变,可能有助于阻止终板软骨的退变。     

重组骨形态发生蛋白—7基因转染软骨细胞的实验研究

目的：研究外源性人重组骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)基因在转染的软骨细胞中的表达情况。方法：用脂质体介导法将rhBMP-7转入兔关节软骨细胞,分别用免疫组化染色和逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）检测其表达,同时用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT法）检测了表达产物的活性。结果：48h后转染的软骨细胞有明显的pcDNA3-rhBMP7基因表达,转染细胞的表达产物对正常软骨细胞的增殖有显著的促进作用。结论：外源性rhBMP-7基因可在软骨细胞中获得高效表达,这为关节疾病的基因治疗提供了理论基础。     

小鼠脊髓发育候选基因Wnt7b的初步研究

目的:探讨Wnt7b基因及Wnt信号系统分子对小鼠脊髓发育的作用。方法:基因测序比较A/J和C57BL/6J两种小鼠Wnt7b基因开放阅读框架序列差异;以RT-PCR方法测定Wnt7b基因在两种小鼠组织中的表达差异;免疫组化法测定Frizzled在2种孕14天胎鼠脊髓上的表达和分布。结果:测序结果中发现两种小鼠Wnt7b开放阅读框架序列结构具有差异;在2种小鼠8种组织中,脊髓、肌肉、脾和肾中的Wnt7b基因表达具有明显差异;免疫组化的测定表明,发育14天的胎鼠脊髓上的Frizzled表达强度和分布范围具有显著差异,尤其是A/J小鼠在神经管周围表达明显强于C57BL/6J。结论:基因表达差异和基因结构差异提示,Wnt7b基因与脊髓发育具有一定的关联,应为一脊髓发育候选基因;Frizzled的强表达与脊髓发育的抑制相关,Wnt7b的信号转导途径介导了控制脊髓发育的过程。     

基于大鼠OVX模型研究雌激素缺乏对终板软骨细胞退变的影响

目的 探究雌激素缺乏对终板软骨细胞退变的影响。方法 选取6月龄大鼠40只,分为两组：双侧卵巢切除实验组(OVX)和假手术对照组(SHAM)。术后9周取材,分别进行软骨终板组织的提取和原代终板软骨细胞的培养。免疫组化实验对比SHAM组和OVX组的软骨终板组织II型胶原(COL-II)的表达情况。倒置相差显微镜和甲苯胺蓝细胞染色观察细胞形态来鉴定终板软骨细胞。CCK-8法对比两组终板软骨细胞的活力情况。罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色观察OVX后终板软骨细胞F-actin的改变情况。细胞免疫荧光检测终板软骨细胞在雌激素缺乏后COL-II的改变情况。RT-qPCR法对比两组的SOX9、ACAN、ADAMTS-5、MMP13和COL-X的表达有无差异。结果 与对照组相比较,OVX组的软骨终板的COL-II蛋白表达减低。终板软骨细胞的形态大多呈多角形和梭形,铺路石样排列。OVX的终板软骨细胞活力降低,细胞骨架更加紊乱,应力纤维增多,迁移能力下降,COL-II表达降低。与对照组相比,OVX组的终板软骨细胞SOX9和ACAN表达降低,MMP13、ADAMTS-5和COL-X表达升高。结论 雌激素缺乏会使...     

脑缺血再灌注后大鼠海马Wnt7b的表达

目的   研究成年大鼠脑缺血再灌注后海马齿状回颗粒细胞下层（SGZ）Wnt7b的表达。方法   将44只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组和脑缺血再灌注组,线栓法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型,缺血90min,术后检测神经功能缺失和脑梗死,在脑缺血再灌注后1、3、7、14d取大鼠海马组织。RT-PCR技术检测Wnt7b mRNA表达水平;免疫荧光技术检测海马Wnt7b蛋白及β-catenin蛋白表达水平。结果   脑缺血后,大鼠出现严重的脑梗死和神经功能障碍,随再灌注时间延长,大鼠神经功能得到修复。再灌注7d后,健侧脑组织海马Wnt7b mRNA表达上调（P＜0.05）,缺血侧脑组织海马Wnt7b mRNA的表达明显上调（P＜0.01）。Wnt7b主要分布于SGZ附近,阳性细胞增多（P＜0.01）,且该脑区的细胞内β-catenin阳性细胞数目增多（P＜0.01）。结论   缺血性脑损伤可刺激Wnt7b在成年海马SGZ的表达上调,Wnt7b可能通过经典Wnt通路参与调节脑缺血后成年海马SGZ的神经发生。     

大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型的建立

目的：建立大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变的机制研究提供载体。方法：酶消化及自然传代法分离培养大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞，观察其形态学变化。采用MTT法测定第Ⅲ代软骨细胞的生长曲线。采用免疫细胞化学法检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况，对该模型进行鉴定。结果：大鼠椎间盘软骨终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原。第Ⅲ代细胞培养在生长第13天后，细胞分裂能力明显下降，核仁不清，细胞变形明显，以梭形为主，折、旋光性弱，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴；Ⅱ型胶原合成明显下降，细胞增殖率显著降低；呈现自然退变过程。结论：建立椎间盘软骨终板软骨细胞体外自然退变模型，为椎间盘退变机制研究提供较好的细胞学基础。     

人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型的建立及其意义

目的 建立人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,观察人正常颈椎椎体和退变颈椎椎体终板软骨细胞的形态及表征.方法 选择2010年7月至2011年7月49例颈椎骨折、脱位(19例)及颈椎病(30例)患者术中取出的颈椎终板软骨,用酶消化法分别分离培养人正常颈椎椎体终板软骨细胞(对照组)和退变颈椎椎体终板软骨细胞(颈椎病组);用倒置显微镜和HE染色法观察细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线;甲苯蓝染色及反转录-PCR(RT-PCR)法对终板软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测终板软骨细胞特征性基因蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原的表达.结果 人颈椎椎体终板软骨细胞表达特征性蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Ⅰ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨细胞.对照组原代终板软骨细胞以多角形为主,增殖速度较快;而颈椎病组原代终板软骨细胞以梭形为主,细胞增殖速度较慢.颈椎病组原代终板软骨细胞表达的蛋白多糖基因(0.695 ±0.052)和Ⅱ型胶原基因(0.726 ±0.035)均低于对照组(0.950±0.032、0.907±0.078,t=7.263、3.681,P=0.002、0.021),Ⅰ型胶原基因则高于对照组(0.795±0.028比0.552±0.070,t=-5.560,P=0.005).结论 成功建立了人颈椎椎体终板软骨细胞退变模型,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础,解决了以前一直以动物细胞模型为研究对象的局限性.     

独活寄生汤对胶原性关节炎大鼠膝关节软骨细胞退变的干预作用

目的:观察独活寄生汤对胶原性关节炎(CIA)大鼠膝关节软骨细胞的影响。方法:用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎模型,分为模型组、独活寄生汤组和布洛芬组3组,另设正常组。分别予独活寄生汤、布洛芬及生理盐水灌胃,持续30 d后取材。关节软骨组织切片采用番红-快绿染色,进行关节软骨组织学评分;透射电镜观察软骨细胞微结构变化。结果:独活寄生汤组软骨组织学评分提示软骨退变减轻,与模型组、布洛芬组比较,差异有统计学意义(P0.05)。独活寄生汤组透射电镜下软骨细胞线粒体和高尔基体数目均较模型组增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论:独活寄生汤可缓解胶原性关节炎大鼠软骨细胞退变。     

雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI细胞亚系模型的建立

目的利用雄激素递减法建立雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)细胞亚系模型LNCaP-AI。方法利用活性炭/葡聚糖处理的血清模拟去雄激素环境培养LNCaP细胞,逐渐递减培养基中雄激素10 d,然后在无雄激素环境中继续培养6个月,培养出能够在无雄激素环境中生长的LNCaP-AI细胞亚系。采用MTT和ELISA法检测LNCaP-AI细胞在去雄激素环境下的增殖能力和前列腺特异性抗原(PSA)的水平。结果 LNCaP细胞在去雄激素环境培养初期生长缓慢,细胞形态呈神经内分泌样改变,经过6个月的连续无雄激素培养,细胞恢复以前的形态和生长。MTT检测表明LNCaP-AI细胞能够在去雄激素环境中生长,通过ELISA检测PSA的分泌提示LNCaP-AI细胞能够在去雄激素环境中恢复分泌PSA的功能。结论激素递减法成功的建立了AIPC细胞亚系模型LNCaP-AI,利用该模型能够模拟前列腺癌由雄激素依赖发展为雄激素非依赖的过程。     

稳定过表达Cdx2基因胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株.方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养.RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为...     

人乳腺癌MCF-7他莫昔芬耐药细胞株的建立及鉴定

目的 构建人乳腺癌细胞MCF-7他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)耐药细胞模型,并鉴定其耐药性.方法 采用高浓度短时间4-羟他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,OHT)冲击法,诱导人乳腺癌MCF-7/TAM耐药细胞株.通过细胞形态学观察、生长曲线、细胞倍增时间、药物毒性实验、细胞周期及凋亡相关蛋白BI...     

雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系模型LNCaP-AI的建立

目的:建立雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系模型LNCaP-AI.方法:长期在去雄激素的血清环境下培养雄激素依赖性LNCaP细胞,培养出能够适直无雄激素环境的LNCaP-AI细胞亚系.MTT、RT-PCR、免疫荧光方法观察LNCaP-AI细胞在无雄激素环境下的增殖能力和表达及分泌前列腺特异性抗原(PSA)的水平.结果:LNCaP前列腺癌细胞在无雄激素中培养3个月后逐渐适应了无雄激素的环境,成为雄激素非依赖的LNCaP-AI细胞亚系.LNCaP-AI细胞在无雄激素的环境下迅速增殖,能够分泌PSA,但其PSA mRNA的表达水平是正常生长LNCaP细胞的44%.结论:成功构建雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系模型LNCaP-AI,可以模拟前列腺癌由雄激素依赖发展为雄激素非依赖的过程.     

人宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/cDDP的建立

目的建立人宫颈癌SiHa细胞对顺铂(cDDP)的耐药细胞系并分析其生物学特性。方法用化疗药物cDDP与人宫颈癌细胞系SiHa共培养,逐步增加培养液中cDDP浓度以诱导细胞产生耐药性,建立SiHa细胞对cDDP的耐药细胞系。利用MTT法绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间并检测肿瘤细胞耐药指数(RI)。免疫细胞化学法检测细胞P-糖蛋白(P-gp)、胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-π)、拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)蛋白的表达。结果成功建立耐药细胞系SiHa/cDDP(耐cDDP 2μg/mL),倍增时间(45.82±3.69)h,对cDDP的RI为16.131,对多种化疗药物有不同程度交叉耐药。耐药细胞P-gp、GST-π表达较亲代细胞增多(P<0.01),TopoⅡ表达与亲代细胞间差异无统计学意义。结论本研究建立了人宫颈癌顺铂耐药细胞系SiHa/cDDP,为肿瘤细胞体外研究提供了理想的实验模型。     

荧光标记人卵巢癌细胞株的建立

目的 建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人卵巢癌细胞株.方法 采用基因转染的方法,将EGFP基因导入人卵巢癌细胞HO8910PM中,通过G418筛选、亚克隆扩增获得稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-HO8910PM细胞株,并用流式细胞术检测所获细胞株的EGFP表达率,通过细胞生长曲线、黏附实验、侵袭迁移实验比较EGFP-HO8910PM细胞和HO8910PM细胞的生物学行为.结果 筛选出的EGFP-HO8910PM细胞经流式细胞仪检测EGFP阳性表达率达99％以上,EGFP-HO8910PM细胞和HO8910PM细胞生长、黏附及侵袭迁移能力无统计学差异.结论 成功建立了稳定表达EGFP且保持母株细胞特性的人卵巢癌细胞株EGFP-HO8910PM,为人卵巢癌整体活体应用中可视化研究打下基础.     

永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立

目的：建立永生化人成牙本质细胞系．方法：采用脂质体转染法，将人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因导入原代人成牙本质细胞样细胞．培养液加G418筛选约1mo后，抗性细胞克隆形成，滤纸片法转移、扩增并连续培养．检测转染细胞内hTERT的基因整和和表达，初步分析细胞系的生物学特征．结果：hTERT稳定转染入目的细胞，表达mRNA及其蛋白．转染后共获得5个细胞克隆，克隆5b来源的细胞在体外长期连续培养下生长良好，具有较高碱性磷酸酶活性，在转录水平表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白，细胞核型正常．该细胞系至今传代56代，约6mo，命名为hTERThOd-L结论：建立起永生化人成牙本质细胞样细胞系．     

裸鼠皮下前列腺癌模型的建立研究

目的:建立裸鼠皮下LNCaP前列腺癌模型,为前列腺癌动物实验研究提供工具.方法:以每只1×106 LNCaP细胞数与基底膜基质混合注射入5只BALB/c裸鼠前肢腋窝皮下,于第2周至第12周分别检测裸鼠血浆tPSA含量,12 w后处死裸鼠,取皮下肿瘤及相关器官做病理检查,监测肿瘤生长及转移情况.结果:80%(4/5)裸鼠于第8周后在前肢腋窝皮下长出肿瘤,肿瘤包膜完整,病理切片可见典型肿瘤细胞,但5只裸鼠均未发现肿瘤转移;5只裸鼠均可测得血浆tPSA,且血浆tPSA含量随肿瘤生长而升高,其中未长出实体瘤的裸鼠血浆tPSA含量亦随时间推移而升高.结论:成功地建立了裸鼠皮下LNCaP前列腺癌模型.该肿瘤模型能分泌PSA和表达DD3mRNA,能更有效地模拟人前列腺癌的生物学特性.     

裸鼠前列腺原位肿瘤模型的建立

目的: 建立一种裸鼠前列腺癌原位模型. 方法: 在10只裸鼠下腹部切口,显露膀胱和前列腺,用1 mL TB针筒、29G针头在其前列腺左右腹侧叶包膜下接种人前列腺癌DU145细胞50 μL,共计6×106个,以建立原位肿瘤模型,观察裸小鼠生命体征变化. 于濒死状态下处死,并取原位肿瘤、膀胱、盆腔淋巴结、肺脏和肝脏标本,用40 g/L甲醛固定、石蜡包埋和HE染色后显微镜下观察,X线照射显示骨骼转移情况. 结果: 10只裸鼠中有6只模型建立成功. 接种后14 d左右,可触及前列腺部位有黄豆大小的包块,质硬. 19 d后出现恶液质,解剖后发现前列腺部位有包块生长,直径约在0.8～1.5 cm,其中2例侵及膀胱. 肝脏泛黄、被膜皱缩,镜下呈急性重型肝炎的病理改变. 结论: 小鼠前列腺原位移植瘤模型建立成功.