应用脉冲电磁场刺激人骨髓间充质干细胞体外培养的生物学特性的研究

目的　应用脉冲电磁场 (PEMFs)刺激体外分离培养的人骨髓间充质干细胞 (hMSCs) ,对其生物学特性进行研究。方法　PEMFs (1 2Hz、 1 1mT、 8h/d)刺激hMSCs体外培养 ,计算细胞的倍增时间 ,观察细胞超微结构 ,放免法测定骨钙素的分泌情况和钙化结节VonKossa染色。结果　脉冲电磁场作用后的细胞增殖能力提高 ,细胞形态发生变化 ,透射电镜观察提示细胞成熟 ,VonKossa钙染色阳性 ,骨钙素的分泌活性增高。结论　hMSCs经合理的PEMFs体外刺激培养后 ,不仅能够大量扩增细胞 ,同时能够向成骨细胞转化 ,具有一定的成骨活性 ,是一种较为理想的骨种子细胞来源     

脉冲电磁场促进人骨髓间充质干细胞成骨的研究

目的 :观察脉冲电磁场 (PEMFs)对人骨髓间充质干细胞 (hMSCs)成骨能力的影响。方法 :hMSCs受频率 12Hz、场强 1.1mT的PEMFs刺激 8h/d ,检测细胞增殖、细胞周期 ,观察细胞超微结构、骨钙素、Ⅰ型胶原免疫组化染色 ,碱性磷酸酶 (ALP)活性、核固红钙染色。结果 :脉冲电磁场作用后的细胞增殖能力提高 ,细胞形态发生变化 ,透射电镜观察提示细胞成熟 ,核固红钙染色、骨钙素、Ⅰ型胶原免疫组化染色均阳性 ,ALP活性增高。结论 :hMSCs经合理的PEMFs体外刺激后 ,细胞增殖加速 ,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性。     

不同年龄人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的研究

目的 :观测年龄对人骨髓间充质干细胞 (humanmesenchymalstemcells ,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响。方法 :使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察细胞生长情况 ,检测其增殖活性、碱性磷酸酶活性 (ALP)、诱导后骨钙素定量测定。结果 :低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、MTT、ALP及骨钙素浓度高。结论 :hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低。     

冲击波诱导人骨髓基质细胞成骨分化及机制的研究

目的 观察出生后人骨髓基质细胞(hIMSCs)在体外培养条件下增殖与分化的特点；研究适宜能量冲击波对出生后hMSCs成骨分化的作用及机制。方法 抽取健康自愿者髂骨骨髓，采用密度梯度离心法进行hMSCs体外培养。设冲击波组(SW组)与对照组，应用不同能量级冲击波对SW组原代细胞进行处理，根据细胞活力测定与集落形成数量确定适宜的冲击波能量值。应用适宜的冲击波能量处理hMSCs原代细胞并传代培养，采用倒置显微镜观察、细胞增殖活力测定、ELISA法检测细胞分泌TGF-81、茜素红染色、钙钴法染色、四环素荧光标记、细胞分泌碱性磷酸酶测定和逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素mRNA表达等方法，对SW组和对照组的各代细胞形态、增殖与分化及其机制进行探讨。结果冲击波处理体外原代培养hMSCs的适宜能量为10kV(500)。SW组细胞在冲击波处理后早期分泌TGF-B1显著高于对照组(P＜0．001)。SW组与对照组细胞在形态学方面第3代前无明显差别；SW组各代细胞分泌碱性磷酸酶显著高于对照组(P＜0．01)；茜素红染色、钙钴法染色、四环素荧光标记等显示SW组细胞的成骨作用明显优于对照组；SW组细胞经冲击波处理后第10天应用RT-PCR方法可以检测到骨钙素mRNA的表达，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0．001)。结论 冲击波对体外培养的出生后人骨髓基质细胞具有促进成骨分化的作用，适宜能量为10kv(500)，其机制之一为TGF-B1介导的促hMSCs成骨分化作用。10kV(500)能量级的冲击波对体外培养的hMSCs增殖无影响，大于该能量的冲击波具有抑制细胞增殖的作用。     

颈椎后纵韧带骨化成纤维细胞的培养及其生物学特性

目的探讨颈椎后纵韧带骨化(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)成纤维细胞培养的方法及其生物学特性,为研究OPLL的病理、生理及发生机制等提供生物学基础。方法采集OPLL患者减压过程中未骨化的部分和颈椎外伤手术减压过程中正常后纵韧带,用原代培养的方法进行体外培养,倒置显微镜观察细胞形态和分泌形成钙结节的过程,并应用Von Kossa方法染色;MTT比色法分析细胞增殖特性;碱性磷酸酶(ALP)活性定量测定和骨钙素(OC)测定比较病变组和正常组差别。结果经Von Kossa染色后镜下显示黑色结节,证实为钙结节;细胞数量从第3 d开始明显增加,并快于正常组;病变组ALP分泌量为(28.56±0.65)U/gprot、OC分泌量为(1.04±0.14)ng/ml,明显高于正常组(P相似文献   

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞成骨分化功能的促进作用

目的观察辛伐他汀对体外培养的人骨髓基质干细胞(humanBoneMarrowStromalcells,hMSCs)成骨分化功能的影响,探讨其刺激成骨的作用机制。方法体外培养来自于股骨颈骨折患者的骨髓基质干细胞,传代后实验组加入1×10-7molL的辛伐他汀,于不同时间点采用Westernblot检测核转录因子1(CoreBindingFactor1,Cbfa1)的表达,碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,ALP)试剂盒检测ALP的比活性,及放射免疫法检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)含量。结果辛伐他汀作用后,实验组与对照组比较,实验组Cbfa1蛋白表达水平增高,ALP比活性增高且骨钙素含量增加。结论1×10-7molL辛伐他汀能够促进人骨髓基质细胞成骨分化,此种促进作用可能与辛伐他汀增强其分化过程中相关蛋白的表达有关。     

人间充质干细胞在骨组织工程中的应用

目的从数量与功能两方面探讨人间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hMSCs)作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法髂骨穿刺,梯度离心分离获得hMSCs,体外扩增培养;对第3代细胞用地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C等成骨诱导培养,检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素的表达和钙结节形成情况;诱导细胞与可吸收性复合支架材料体外构建复合体,植入裸小鼠皮下,对照组仅植入支架材料,术后3周取材检测骨钙素、Ⅰ型胶原表达。结果4ml骨髓含3.2×107～6.0×107个单个核细胞,培养3周收获hMSCs2.5×107～4.3×107;成骨诱导后,表达碱性磷酸酶、骨钙素阳性细胞数>50%,对照组<10%;诱导细胞与材料复合后植入体内仍然高表达骨钙素、Ⅰ型胶原。结论hMSCs能够满足体外构建组织工程化骨,对种子细胞数量和功能的要求。     

脉冲电磁场对卵巢切除大鼠骨质疏松的预防作用

目的：观察脉冲电磁场(PEMFs)对去势后大鼠骨质疏松症的预防作用。方法：40只雌性SD大鼠随机分为5组：去势组、对照组和3个PEMFs治疗组。治疗组磁场强度分别为2、4和8G，每天治疗6h，共12周。术后12周处死动物，测定血清骨钙素、骨密度、生物力学参数、骨形态计量学分析。结果：PEMFs治疗可以提高骨密度、骨小梁面积百分比、骨小梁宽度、骨小梁数目和股骨生物力学性能。PEMFs还可以降低去势后升高的血清骨钙素。结论：PEMFs治疗可以预防大鼠卵巢切除引起的骨质疏松。     

长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响

目的通过观察长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,鉴定ADSCs作为组织工程种子细胞的优越性。方法通过流式细胞技术观察长期体外培养对人ADSCs表面抗原表达和凋亡的影响。通过碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及RT-PCR检测长期体外培养对人ADSCs成骨分化潜能的影响。结果原代ADSCs表面高表达间充质干细胞表面标记物,而不表达血源性细胞表面标记物,标记物不随传代次数变化。早期ADSCs凋亡率为1%～2%,随传代次数增多凋亡率逐渐增加．但幅度不大。碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色和RT-PCR检测显示ADSCs传至第8代时仍能保持成骨分化潜能。结论ADSCs生物学特性稳定,是较为理想的组织工程及再生医学研究的种子细胞。     

人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的 探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7(BMP7)诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能.方法 成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养.CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖(GAG),Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Yon Kossa染色法检测钙结节.结果 两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用.     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

胎儿毛乳头细胞的培养和鉴定及其体外诱导分化

目的探讨胎儿毛乳头细胞（dermal papilla cells，DPCs）生物学特性和体外诱导分化潜能，论证作为组织工程种子细胞的可行性。方法Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头，Eagle动物细胞培养基（DMEM）／F12（3：1）中培养细胞，通过免疫荧光检测α平滑肌动蛋白（smooth muscle actin-α，SMA—α）、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、层粘连蛋白，对细胞的生物学特性进行鉴定。取第3、7代细胞以成脂诱导液、成骨诱导液体外定向诱导7～10d，油红染色和Von Kossa染色、骨桥蛋白免疫荧光检测鉴定细胞的成脂和成骨特性。结果体外培养的DPCs表达SMA—α、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白，成脂诱导10d后油红染色可见细胞胞浆内红色脂滴形成，成骨诱导7d后Von Kossa染色细胞间有黑色钙结节形成，细胞表达骨桥蛋白。结论体外培养DPCs具有干细胞特性，可作为皮肤组织工程和骨组织工程一种新的种子细胞。     

脉冲电磁场对卵巢切除大鼠骨质疏松的预防作用

目的:观察脉冲电磁场(PEMFs)对去势后大鼠骨质疏松症的预防作用.方法:40只雌性SD大鼠随机分为5组:去势组、对照组和3个PEMFs治疗组.治疗组磁场强度分别为2、4和8G,每天治疗6h,共12周.术后12周处死动物,测定血清骨钙素、骨密度、生物力学参数、骨形态计量学分析.结果:PEMFs治疗可以提高骨密度、骨小梁面积百分比、骨小梁宽度、骨小梁数目和股骨生物力学性能.PEMFs还可以降低去势后升高的血清骨钙素.结论:PEMFs治疗可以预防大鼠卵巢切除引起的骨质疏松.     

脉冲电磁场对大鼠破骨细胞功能分子的影响

目的研究脉冲电磁场(puslsed electromagnetic fields,PEMFs)对大鼠破骨细胞的作用。方法取10w龄雌性SD大鼠随机分为三组:PEMFs组、Control组和Sham组;其中PEMFs组、Control组进行双侧卵巢切除手术,Sham组不切除卵巢。术后12w对PEMFs组大鼠进行PEMFs作用(70Hz,2mT),Control组和Sham组不进行PEMFs作用。作用结束后,取大鼠股骨骨髓,进行体外破骨细胞诱导培养。7天后分别进行破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)检测和整合素αvβ3、NF-κB受体激活子(receptor activator of NF-κB,RANK)、组织蛋白酶K(cathepsin K)免疫荧光染色检测。结果经PEMFs作用后,TRAP检测显示破骨细胞形态;免疫荧光染色显示阳性破骨细胞也明显减少。结论 PEMFs对破骨细胞功能分子的表达有抑制作用,提示PEMFs作用可以抑制SD大鼠破骨细胞的骨吸收活性。     

组织工程化骨膜的构建及其在体外的成骨活性检测

[目的]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程骨膜,体外观察其生物学特性并检测成骨活性,为将来体内移植提供实验依据。[方法]以猪小肠粘膜下层基质作为支架材料,与新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)或体外成骨诱导培养后的BMSCs,采用沉淀法复合构建两种组织工程化骨膜(M2及M1),用MTT法检测种子细胞在支架材料上的生长情况;扫描电镜(SEM)观察种子细胞在支架材料上的生长、粘附状态;通过ELISA检测碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌水平。[结果]种子细胞在SIS上生长良好,M2及M1在含有成骨诱导剂的培养基中培养可分泌一定量骨钙素(11 d达峰值),并表达碱性磷酸酶活性(7 d达峰值)。而且,Ml所分泌骨钙素的量与碱性磷酸酶活性高于M2,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程化骨膜能够保持较稳定的生物活性,种子细胞能良好地在支架上附着、生长增殖,并稳定地分泌一定量的骨钙素和碱性磷酸酶,在体外表达较强的成骨活性。     

脉冲电磁场对新型低弹多孔钛合金表面成骨效应的影响研究

目的:观察脉冲电磁场刺激对新型低弹多孔钛合金支架表面的成骨效应。方法:使用3D打印技术制备多孔钛合金(Ti-24Nb-4Zr-8Sn,Ti2448)支架,并使用扫描电镜对支架的表面形貌进行观察;将成骨细胞接种于支架表面,给予脉冲电磁场刺激的支架为实验(PMEF)组,不给予脉冲电磁场刺激的支架为对照组;使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测两组细胞的增殖能力;使用活/死细胞染色观察两组细胞在支架上的活性;使用扫描电镜观察两组细胞在支架上的形态;通过实时定量PCR观察两组细胞相关成骨基因分化;通过兔股骨外侧髁缺损模型进行体内骨长入分析,分别使用荧光标记和Van Gieson染色观察两组支架的骨长入情况。结果:使用3D打印技术成功制备实验所需的多孔钛合金支架;PMEF组成骨细胞的增殖能力、细胞活性明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);PMEF组成骨细胞可见明显细胞伪足,细胞状态良好;PMEF组成骨细胞的成骨相关基因表达明显高于对照组(P0.05);术后4周和12周,PMEF组新生骨沉积速率(两种荧光间距)均高于对照组(P0.05),Van Gieson染色发现PMEF组骨长入明显多于对照组(P0.05)。结论:脉冲电磁场刺激和多孔Ti2448植入物的组合可为骨科、口腔和整形等领域的骨修复重建提供一种新方法和新思路。     

脉冲电磁场影响人骨髓基质干细胞缝隙连接通讯的实验研究

目的研究脉冲电磁场(PEMFs)对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)缝隙连接所介导细胞间通讯(GJIC)的影响。方法透射电镜观察BMSCs超微结构,应用荧光漂白恢复(FRAP)技术,通过激光共聚焦显微镜检测hBM-SCs经PEMFs刺激后GJIC的功能变化。结果经PEMFs刺激后的hBMSCs,平均荧光漂白恢复率为(64.12±0.83)%,较对照组犤(35.26±0.76)%犦有显著性增加(P<0.05)。结论PEMFs刺激能促进hBMSCs的缝隙连接通讯功能。     

成人间充质干细胞体外成骨的初步研究

目的 建立一种分离和培养成人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察成人MSCs体外成骨潜能。方法 用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,并在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养。通过传代培养扩增MSCs。为促进成人MSCs体外成骨性分化,第5传代培养时加入成骨性添加剂,培养第4、12天分别用流式细胞仪分析成人MSCs表面分子的表达,并用碱性磷酸酶组化染色和Von Kossa染色。结果 成人MSCs是骨髓黏附细胞中有相应细胞表面蛋白表达和形态均的一细胞群。成骨性添加剂可作用于传代培养的成人MSCs,表现为培养皿表面有相互连接的结节状聚合体、碱酶染色阳性细胞数量增多、Von Kossa染色可见钙化的基质沉积。结论 所建立的成人MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,成人MSCs具有体外成骨潜能。     

大鼠脂肪基质干细胞的培养及其向成骨细胞分化的研究

目的：研究大鼠脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠脂肪基质干细胞在体外向成骨细胞分化的能力。方法：取成年Sprague—Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织，胶原酶消化分离．接种于自制基础培养基巾分离传代。于基础培养基中传至第二代时改换诱导培养基，诱导向成骨细胞分化，培养2-4周．用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨细胞分化能力。结果：大鼠脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪基质下细胞：经向成骨细胞诱导培养后，碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色阳性，证实细胞能够分化为成骨细胞。结论：大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪基质干细胞，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相似，能够向成骨细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。