多种病理因素对血管内皮细胞增殖与凋亡的影响及VEGF的干预作用

目的 研究缺氧、H2O2、氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对血管内皮细胞(VEC)增殖、凋亡和凋亡相关基因表达的影响及血管内皮生长因子(VEGF)的干预作用,探讨VEGF预防经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后再狭窄和支架内血栓形成的机制.方法 将VEC分成对照组、缺氧处理组、缺氧+VEGF处理组、H2O2处理组、H2O2+VEGF处理组、OX-LDL处理组、OX-LDL+VEGF处理组、TNF-α处理组和TNF-α+VEGF处理组.利用四氮唑盐比色法检测各组细胞吸光度值,观察VEC增殖情况,采用原位末端标记法和流式细胞术观察各组细胞凋亡情况,通过RT-PCR法了解各组细胞凋亡相关基因Bcl-2与Apo-1/Fas mRNA表达情况.结果 缺氧、H2O2、OX-LDL和TNF-α处理组凋亡细胞和Apo-1/Fas mRNA表达明显多于对照组和相应VEGF处理组,而细胞增殖和Bcl-2 mRNA表达则明显低于对照组和相应VEGF处理组(均P<0.01).结论 缺氧、H2O2、OX-LDL和TNF-α能抑制VEC增殖,诱导VEC凋亡,而VEGF能部分拮抗上述作用,其抗凋亡作用可能与Bcl-2 mRNA表达上调和Apo-1/Fas mRNA表达下调有关,为VEGF用于预防PCI后再狭窄和支架内血栓形成进一步提供了理论依据.     

血管紧张素Ⅱ、卡托普利及氯沙坦对血管内皮细胞凋亡的影响

目的：探讨血管紧张素Ⅱ在不同浓度和不同作用时间下对血管内皮细胞凋亡的作用及卡托普利和氯沙坦的影响。方法：采用流式细胞术测定在血管紧张素Ⅱ不同浓度和不同作用时间下血管内皮细胞凋亡率的变化和卡托普利、氯沙坦的影响。结果：血管紧张素Ⅱ可明显促进血管内皮细胞凋亡，且其作用呈剂量依赖性和时间依赖性；单用氯沙坦对细胞凋亡无明显作用，卡托普利有一定的作用，二者合用时抑制作用较明显。结论：血管紧张素Ⅱ具有明显的促血管内皮细胞凋亡的作用；合用卡托普利和氯沙坦可明显抑制内皮细胞凋亡。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

抗VEGF抗体对骨肉瘤OS-732细胞血管生成及其肿瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的：探讨阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)的血管生成作用对骨肉瘤OS-732细胞及血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,通过解剖显微镜血管计数,光镜HE染色,原位末端标记及PC-NA免疫组化检测观察VEGF抗体对骨肉瘤血管生成及肿瘤增殖,凋亡状态的影响。结果：VEGF抗体组肿瘤区血管数目及瘤细胞数显著低于PBS对照组,肿瘤细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,增殖指数两组差异不明显,同时VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期微血管内皮细胞少见。结论：VEGF抗体能显著抑制骨肉瘤OS-732血管生成,抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,可能是VEGF抗体发挥抗血管生成作用的途径之一,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,最终达到抑制瘤细胞生长的作用。     

Ang1～7对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究血管紧张素1～7(Ang1～7)对婴幼儿血管瘤内皮细胞(Hem ECs)的增殖、凋亡及Mas受体mRNA表达的影响.方法 收集2016—2017年间在广东医科大学附属医院整形外科经手术切除的临床及病理诊断为增殖期婴幼儿血管瘤组织块3例,采用贴壁法培养并经第Ⅷ因子相关抗原鉴定为Hem ECs,qRT-PCR、W...     

血管紧张素II、卡托普利及氯沙坦对血管内皮细胞凋亡的影响

目的 :探讨血管紧张素II在不同浓度和不同作用时间下对血管内皮细胞凋亡的作用及卡托普利和氯沙坦的影响。方法 :采用流式细胞术测定在血管紧张素II不同浓度和不同作用时间下血管内皮细胞凋亡率的变化和卡托普利、氯沙坦的影响。结果 :血管紧张素II可明显促进血管内皮细胞凋亡 ,且其作用呈剂量依赖性和时间依赖性 ;单用氯沙坦对细胞凋亡无明显作用 ,卡托普利有一定的作用 ,二者合用时抑制作用较明显。结论 :血管紧张素II具有明显的促血管内皮细胞凋亡的作用 ;合用卡托普利和氯沙坦可明显抑制内皮细胞凋亡     

血管紧张素Ⅱ诱导人内皮细胞凋亡

为探讨血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）能否诱导人内皮细胞凋亡,将健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代,用不同浓度Ang Ⅱ培养不同时间,用TUNEL和ELISA检测细胞凋亡,并检验Caspase-3酶性变化,用RT－PCR检测Ang Ⅱ受体AT1和AT2的mRNA表达。发现Ang Ⅱ可以诱导出典型的凋亡,凋亡细胞阳性率极显著高于对照组,凋亡强度与Ang Ⅱ呈现剂量依赖关系。Caspase-3酶活性在Ang Ⅱ作用后有极显著的增加。内皮细胞同时表达AT1和AT2的mRNA。结果表明：Ang Ⅱ经AT1或（和）AT2可以诱导人内皮细胞凋亡,并且是Caspase-3依赖性的。这一结果有助于阐明Ang Ⅱ的致病机制。     

血管紧张素Ⅱ对内皮细胞致凋亡效应及血脂康的保护作用

目的观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖与凋亡的影响及血脂康对AngⅡ此效应的干预作用,探讨AngⅡ的致动脉粥样硬化作用及血脂康调脂之外的内皮保护作用。方法将体外培养内皮细胞株ECV304进行实验分组:空白对照组;AngⅡ诱导组,培养基中AngⅡ终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L,与细胞共孵育18h。利用三磷酸腺苷生物素发光法(ATP法)检测AngⅡ对HU VECs生长增殖的影响,用电子显微镜观察AngⅡ(10-4mol/L)诱导后内皮细胞的超微结构特点,用流式细胞仪检测AngⅡ作用后内皮细胞凋亡率的变化,采用比色法检验AngⅡ(10-4mol/L)诱导后内皮细胞Caspase3活性的改变;血脂康干预组,培养基中AngⅡ浓度为10-4mol/L,同时加入血脂康500ng/ml与细胞共培养18h,检测该组内皮细胞凋亡率和Caspase3活性的变化。结果与对照组比较,不同浓度(10-8～10-4mol/L)的AngⅡ均能抑制内皮细胞生长增殖(P<0.05),且其作用呈剂量依赖性;不同浓度(10-7～10-4mol/L)的AngⅡ均可显著诱导内皮细胞凋亡(P<0.05),同时Caspase3的活性在AngⅡ(10-4mol/L)作用后明显增加(P<0.01);透射电镜下可见AngⅡ诱导后内皮细胞呈明显凋亡改变;血脂康(500ng/ml)可抑制AngⅡ(10-4mol/L)所诱导的内皮细胞凋亡(P<0.05)。结论     

血管内皮生长因子对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨缺氧对培养人静脉内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预性影响。方法 （1）人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定。（2）建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型,TUNEL法观测不同缺氧时间（0、12、24、48h）对内皮细胞凋亡的影响及血管内皮生长因子的干预作用。结果 随缺氧时间延长,NUVECs凋亡率显著升高,血管内皮生长因子抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡。结论 内皮细胞的过渡凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素,血管内皮生长因子通过抑制内皮细胞凋亡,而具有内皮细胞保护作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导人内皮细胞凋亡

为探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能否诱导人内皮细胞凋亡,将健康胎儿脐静脉内皮细胞培养至第3代,用不同浓度AngⅡ培养不同时间,用TUNEL和ELISA检测细胞凋亡,并检验Caspase-3酶活性变化.用RT-PCR检测AngⅡ受体AT1和AT2的mRNA表达.发现AngⅡ可以诱导出典型的凋亡,凋亡细胞阳性率极显著高于对照组,凋亡强度与AngⅡ呈现剂量依赖关系.Caspase-3酶活性在AngⅡ作用后有极显著的增加.内皮细胞同时表达AT1和AT2的mR-NA.结果表明AngⅡ经AT1或(和)AT2可以诱导人内皮细胞凋亡,并且是Caspase-3依赖性的.这一结果有助于阐明AngⅡ的致病机制.     

Apelin通过Akt/eNOS机制促进肺血管内皮细胞一氧化氮释放

 目的 探讨Apelin对肺血管内皮细胞释放一氧化氮（NO)的影响及其机制。方法 培养新生鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）。 (1) 以1 x 10⁵ 个/孔密度接种至24孔板,80%融合后,无血清培养24 h。分为2组：Apelin组,加入Apelin至终浓度为10^-8 mol/L;对照组,加入等量无血清DMEM培养液。每组设立4个复孔。继续培养,并分别在0 min、2 min、5 min、15 min 、30 min时间点取培养液测NO浓度。(2) 以5 x 10⁵ 个/孔密度接种至6孔板,80%融合后,无血清培养24 h分为3组：Apelin组,加入Apelin至终浓度为10^-8 mol/L。Apelin + Akt抑制剂（Akt inhibitor）组,加入Apelin前用5 μmol/L浓度的Akt抑制剂预处理30 min。对照组加入等量DMEM培液。每组设立3复孔。继续培养5 min后立即提取总蛋白,用于Western blot检测磷酸化Akt和磷酸化内皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表达。结果 与0 min时间点比较,培养液中NO浓度分别在2 min、5 min、15 min时间点增加（P<0.01或P<0.05）,其中在5 min时间点达到高峰。与对照组比较,Apelin组磷酸化Akt和磷酸化eNOS表达增加（P<0.01）,与Apelin组比较,Apelin + Akt inhibitor组磷酸化eNOS表达降低（P<0.01）。结论 Apelin促进PMVECs释放NO,Akt/eNOS磷酸化参与Apelin促进NO释放机制。     

TNP-470对肺癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的:应用体外细胞培养法探讨O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉素(TNP-470)对肺癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖的影响及其可能机制.方法:免疫细胞化学方法检测血管内皮细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、胚胎肝激酶1(Flk-1)、纤维细胞生长因子受体(FGFR)的表达.结果:TNP-470以剂量依赖方式抑制肺癌细胞条件培养液或细胞粉碎液诱导的血管内皮细胞PCNA,Flk-1,FGFR的表达,与对照组比较差异均显著(P<0.05).结论:TNP-470能够相对特异地抑制血管内皮细胞增殖,可能与通过降低内皮细胞表面Flk-1,FGFR的表达,进而减弱酪氨酸激酶受体介导的细胞增殖途径有关.     

受体型酪氨酸磷酸酶J抑制血管内皮细胞增殖及迁移

目的 分析受体型酪氨酸磷酸酶J(PTPRJ)过表达对血管内皮细胞增殖及迁移活性的影响及机制.方法 使用PTPRJ质粒转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞.使用Western blot、RT-PCR、免疫荧光检测HUVEC细胞中PTPRJ表达情况,Western blot检测ERK1/2激酶磷酸化情况,RTPCR检测血小板源性生长因子-B(PDGF-B)的表达变化,BrdU摄入法检测细胞增殖率,划痕法检测细胞迁移率变化.结果 免疫荧光检测质粒转染后HUVEC细胞中PTPRJ表达定位于细胞膜;PTPRJ质粒转染后ERK1/2激酶磷酸化受抑制,PDGF-B mRNA表达减少;PTPRJ质粒转染组细胞增殖率较空质粒组下降,差异有统计学意义(P =0.004).PTPRJ质粒转染组细胞迁移率较空质粒组下降,差异有统计学意义(P=0.002).结论 PTPRJ通过下调PDGF-B表达、抑制ERK1/2激酶磷酸化,对血管内皮细胞增殖及迁移活性具有负性调控作用.     

辛伐他汀对内皮祖细胞增殖?迁移及凋亡影响的研究

目的:细胞水平观察不同浓度辛伐他汀对内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能的影响.方法:采用密度梯度离心法从人外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板上,培养7天后,收集贴壁细胞,通过激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞为正在分化EPCs.以不同浓度辛伐他汀(分别为0.0001、0.0010、0.0100、0.1000、1.0000 μmol/L)或PI3K阻断剂(LY294002) 0.01μmol/L辛伐他汀和EPCs培养.分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室和碘化丙啶(PI)标记观察辛伐他汀对EPCs的增殖、迁移和凋亡影响.结果:辛伐他汀显著提高了外周血 EPCs的迁移能力、增殖能力与抗凋亡能力(P＜0.05).辛伐他汀浓度在0.01 μmol/L时对EPCs功能影响达到最大.随着药物浓度的继续增大,EPCs的上述功能反呈下降趋势,但0.1μmol/L组仍高于对照组.辛伐他汀对EPCs的功能影响能被LY294002阻断.结论:辛伐他汀能增加EPCs的增殖、迁移、抗凋亡功能,其机制可能与磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号途径有关.     

VEGF在HaCaT细胞中的自分泌作用

目的:检测VEGF在皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞中可能的自分泌作用.方法:用MTT法,检测不同浓度外源性VEGF165(0,1,5,10,25,50,100 ng/ml)和不同浓度VEGF特异性抑制剂阿瓦斯丁(0,0.063,0.125,0.25,0.50,1.0,2.0 mg/ml)作用下HaCaT细胞增殖的变化;用细胞迁移实验,检测不同浓度VEGF165和0.5 mg/ml阿瓦斯丁作用下HaCaT细胞迁移的变化;蛋白免疫印迹检测10 ng/ml VEGF165和0.5mg/ml阿瓦斯丁作用下HaCaT细胞ERK1/2的磷酸化情况.结果:VEGF165剂量依赖性地促进HaCaT细胞的增殖和迁移能力;而阿瓦斯丁剂量依赖性地抑制其增殖能力,0.50 mg/ml阿瓦斯丁可以显著性降低其迁移能力;10 ng/ml VEGF165显著性促进HaCaT细胞ERK1/2的磷酸化,而对0.5 mg/ml阿瓦斯丁预处理过的HaCaT细胞的ERK1/2磷酸化没有促进作用.结论:VEGF在皮肤角质形成细胞系HaCaT中存在着自分泌作用.     

生脉成骨胶囊对血管内皮细胞增殖及分泌VEGF功能的影响

目的探讨生脉成骨胶囊兔血清对人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304细胞）增殖及分泌血管内皮生长因子（VEGF）功能的影响.方法以MTT法测定体外培养的ECV304细胞增殖,采用ELISA法检测培养液上清中VEGF浓度,应用透射电镜技术观察药物血清作用12 h后细胞显微结构.结果不同剂量生脉成骨胶囊兔血清在作用12 h和36h后对ECV304细胞增殖无促进作用,中剂量和高剂量兔血清在36h表现出抑制ECV304细胞增殖的作用（P＜0.01）,低剂量兔血清作用1 h后可显著促进ECV304细胞分泌VEGF（P＜0.01）.结论生脉成骨胶囊兔血清对ECV304细胞增殖无促进作用,低剂量生脉成骨胶囊兔血清可促进ECV304细胞分泌VEGF,提示这可能是生脉成骨胶囊促进血管生成的主要作用机制之一.     

生脉成骨胶囊对血管内皮细胞增殖及分泌VEGF功能的影响

目的 探讨生脉成骨胶囊兔血清对人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304细胞)增殖及分泌血管内皮生长因子(VEGF)功能的影响。方法 以MTT法测定体外培养的ECV304细胞增殖,采用ELISA法检测培养液上清中VEGF浓度,应用透射电镜技术观察药物血清作用12h后细胞显微结构。结果 不同剂量生脉成骨胶囊兔血清在作用12h和36h后对ECV304细胞增殖无促进作用,中剂量和高剂量兔血清在36h表现出抑制ECV304细胞增殖的作用(P<0.01),低剂量兔血清作用1h后可显著促进ECV304细胞分泌VEGF(P<0.01)。结论 生脉成骨胶囊兔血清对ECV304细胞增殖无促进作用,低剂量生脉成骨胶囊兔血清可促进ECV304细胞分泌VEGF,提示这可能是生脉成骨胶囊促进血管生成的主要作用机制之一。     

内分泌腺性血管内皮生长因子对结肠癌LoVo细胞增殖和迁移的促进作用

目的：探讨内分泌腺性血管内皮生长因子（EG-VEGF）对结肠癌LoVo细胞相关恶性行为的影响。方法：采用不同浓度（50、100、200μg·L^-1） EG-VEGF处理的结肠癌LoVo细胞作为EG-VEGF组,采用不含EG-VEGF培养液培养的结肠癌LoVo细胞作为对照组。MTT法检测各组LoVo细胞的增殖活性,流式细胞术（FCM）检测各细胞周期LoVo细胞百分率,细胞划痕实验检测各组结肠癌LoVo细胞迁移率,Transwell实验检测各组结肠癌LoVo细胞迁移数。结果：MTT法,与对照组比较,50、100和200μg·L^-1EG-VEGF组LoVo细胞增殖活性明显升高（P<0.05）,且随着浓度的升高细胞增殖活性升高。FCM检测,与对照组比较,100μg·L^-1EG-VEGF组G₀/G₁期LoVo细胞百分率降低（P<0.05）,S期细胞百分率升高（P<0.05）,G₂+M期细胞百分率变化不明显。细胞划痕实验,100μg·L^-1EG-VEGF组LoVo细胞迁移率较对照组明显升高（P<0.05）。Transwell实验,50、100和200μg·L^-1EG-VEGF组结肠癌LoVo细胞迁移数较对照组明显升高（P<0.05）。结论：EG-VEGF可明显促进结肠癌LoVo细胞增殖和迁移,EG-VEGF可能与结肠癌的恶性发展有关联。     

三氧化二砷对血管内皮细胞增殖和周期的影响

目的:观察As2O3对血管内皮细胞增殖、凋亡和细胞周期的干扰,探讨As2O3对血管内皮细胞生长的直接影响。方法:血管内皮细胞EVC-304体外培养,As2O3干预。采用MTT测定细胞活性,流式细胞仪测定细胞周期、细胞凋亡。结果:ECV-304细胞经过As2O3干预,其存活率明显降低,并且呈剂量依赖性。As2O3干预后,进入S期的细胞减少,细胞周期被阻在G1期,细胞可能在G1期进入凋亡。As2O3诱导早期凋亡是对照组的2.88～5.1倍,并且呈剂量依赖性;其晚期凋亡是对照组的1.17～1.67倍。结论:As2O3可直接干扰血管内皮细胞的细胞周期,阻滞细胞在G1期,并诱导细胞凋亡,进而抑制血管内皮细胞的增殖。     

抗KDR抗体体外抑制血管瘤内皮细胞增殖的研究

目的 证明抗内皮生长因子受体2(KDR)抗体通过与血管内皮生长因子竞争性结合KDR从而抑制血管内皮生长因子结合KDR后产生的血管瘤内皮细胞(HVEC)增生的作用.方法 取增殖期血管瘤标本培养血管瘤内皮细胞.HVEC原代传至第3代时在培养液中加入抗KDR抗体,按照抗体的不同稀释浓度分为3个干预小组,在干预前和干预后9天内分别进行细胞计数并检测细胞活性.结果 各干预组在干预后HVEC增殖减慢,抗体浓度在50μg/ml、10μg/ml、2μg/ml时,第9天对HVEC的抑制率分别为84.2%、63.6%和39.5%,抗体浓度与HVEC的抑制率呈正相关,对照组在无干预的情况下数目显著增加.结论 抗KDR抗体通过封闭KDR而抑制血管内皮生长因子的活性,在血管瘤的治疗中具有潜在的应用前景.