IFN-γ联合阿霉素或依托泊苷增强TRAIL对神经母细胞瘤细胞的诱导凋亡作用

  目的  探讨半胱-天冬氨酸蛋白酶8(Caspase 8)和死亡受体(DR)在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导神经母细胞瘤(NB)细胞凋亡中的作用。  方法  应用RT-PCR方法检测γ干扰素(IFN-γ)作用前后NB细胞Caspase 8 mRNA的表达; 应用Western blot方法检测Caspase 8、DR4和DR5蛋白表达; 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞术检测IFN-γ, TRAIL, IFN-γ+TRAIL, Caspase 8抑制剂+TRAIL及IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL对NB细胞株生长及凋亡的影响。  结果  IFN-γ在NB细胞株SKNDZ中诱导了Caspase 8mRNA及蛋白表达。SY5Y细胞对TRAIL不敏感, 而IFN-γ与TRAIL或阿霉素, 依托泊苷联用对SY5Y细胞有明显诱导凋亡作用。IFN-γ+TRAIL组SY5Y细胞早期凋亡率(23.09+2.35)%高于TRAIL组[(6.15±0.54)%(P< 0.01)], 但低于IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL组[(43.41±6.46)%/(38.86±7.29)%, P< 0.01]。阿霉素或依托泊苷可以诱导NB细胞株DR5蛋白表达, 但未诱导DR4蛋白表达。IFNγ诱导后表达Caspase 8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感, 而阿霉素或依托泊苷处理后同时表达DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用相对敏感。IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL组SKNDZ细胞早期凋亡率(11.54±2.49)%/(13.38±1.65)%高于IFN-γ+TRAIL组(P< 0.01)。  结论  IFN-γ上调Caspase 8表达及化疗药阿霉素或依托泊苷诱导DR5表达可以恢复NB细胞对TRAIL的敏感性, Caspase 8和DR5在TRAIL诱导NB细胞凋亡中起着十分关键的作用。      

TRAIL联合阿霉素和IFN-γ对人骨肉瘤细胞凋亡的影响

 目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)联合阿霉素和IFN-γ应用对人骨肉瘤细胞生长抑制和诱导凋亡的作用。 方法 用MTT测定TRAIL、阿霉素、IFN-γ单独或联合应用对人骨肉瘤细胞MG-63的体外增殖抑制作用,并检测各组细胞凋亡 率。 结果 TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联合作用于MG-63细胞后,能显著增强对MG-63的杀伤、抑制增殖及诱导凋亡作用,明显高于单独应用TRAIL组或阿霉素组(P<0.05)。 结论 TRAIL、阿霉素、IFN-γ三者联用能显著提高骨肉瘤细胞MG-63生长抑制和诱导凋亡作用。     

5氮杂胞苷联合干扰素-γ上调神经母细胞瘤细胞Caspase 8表达的研究

  目的  探讨半胱-天冬氨酸蛋白酶8(Caspase 8)和死亡受体(DR)在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导神经母细胞瘤(NB)细胞凋亡中的作用。  方法  应用RT-PCR方法检测γ干扰素(IFN-γ)作用前后NB细胞Caspase 8 mRNA的表达; 应用Western blot方法检测Caspase 8、DR4和DR5蛋白表达; 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞术检测IFN-γ, TRAIL, IFN-γ+TRAIL, Caspase 8抑制剂+TRAIL及IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL对NB细胞株生长及凋亡的影响。  结果  IFN-γ在NB细胞株SKNDZ中诱导了Caspase 8mRNA及蛋白表达。SY5Y细胞对TRAIL不敏感, 而IFN-γ与TRAIL或阿霉素, 依托泊苷联用对SY5Y细胞有明显诱导凋亡作用。IFN-γ+TRAIL组SY5Y细胞早期凋亡率(23.09+2.35)%高于TRAIL组[(6.15±0.54)%(P< 0.01)], 但低于IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL组[(43.41±6.46)%/(38.86±7.29)%, P< 0.01]。阿霉素或依托泊苷可以诱导NB细胞株DR5蛋白表达, 但未诱导DR4蛋白表达。IFNγ诱导后表达Caspase 8的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用仍不敏感, 而阿霉素或依托泊苷处理后同时表达DR5的SKNDZ细胞对TRAIL的诱导凋亡作用相对敏感。IFN-γ+阿霉素/依托泊苷+TRAIL组SKNDZ细胞早期凋亡率(11.54±2.49)%/(13.38±1.65)%高于IFN-γ+TRAIL组(P< 0.01)。  结论  IFN-γ上调Caspase 8表达及化疗药阿霉素或依托泊苷诱导DR5表达可以恢复NB细胞对TRAIL的敏感性, Caspase 8和DR5在TRAIL诱导NB细胞凋亡中起着十分关键的作用。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因对人大肠癌细胞株HT29作用的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体基因（TRAIL）用于人大肠癌细胞株HT29基因治疗的实验研究。方法 将重组腺病毒载体（Ad)介导的TRAIL基因作用于人大肠癌细胞株HT29,通过相差显微镜、MTT比色法和流式细胞仪,研究分析其对HT29细胞作用的效果。结果 Ad/GT-TRAIL能引起HT29细胞出现明显的形态学改变,对HT29细胞的生长抑制率和凋亡诱导率分别为54．3％和11．1％;联合Ad/PGK-GV16后,生长抑制率和凋亡诱导率均显著提高（P＜0．05）,分别为82．7％和24．6％。结论 Ad/GT-TRAIL能有效诱导HT29的凋亡从而抑制HT29的生长,联合Ad/PGK-GV16后将显著提高其疗效。     

RNA干扰介导的Adrml基因沉默对大肠癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨RNA干扰使Adrml基因沉默后对大肠癌细胞增殖的影响.方法 构建靶向Adrml基因的shRNA真核表达载体,转染大肠癌细胞RKO,筛选Adrml基因沉默的稳定克隆.实验细胞分为3组,即稳定转染Adrml-shRNA的实验组、仅含大肠癌RKO细胞的空白对照组和转染空载体的阴性对照组.采用Western blot法检测Adrml蛋白的表达水平.通过软琼脂细胞集落形成实验观察3组细胞的集落形成能力.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和原位末端标记(TUNEL)法检测细胞的增殖和凋亡水平.应用流式细胞仪检测细胞周期的变化情况.结果 实验组大肠癌RKO细胞中,Adrml蛋白的表达受到明显抑制.实验组细胞的非贴壁依赖生长能力明显下降,偶见个别集落形成.实验组细胞的凋亡百分率为(12.4±1.1)%,明显高于阴性对照组[(1.3±0.2)%,P＜0.05].实验组G_0/G_1期和S/G_2期细胞所占的比例分别为(41.2±1.1)%和(58.8±1.1)%,实验组细胞被阻滞在G_1期.Adrml基因沉默能明显增强5-氟尿嘧啶(5-Fu)对大肠癌RKO细胞的生长抑制作用,并引起大肠癌RKO细胞大量凋亡.结论 RNA干扰介导的Adrml基因沉默能诱导大肠癌细胞发生凋亡并出现细胞周期阻滞,从而抑制肿瘤细胞的增殖.对于Adrml基因高表达的大肠癌患者,RNA干扰Adrml基因的表达并结合传统化疗有望成为新的治疗手段.     

TRAIL抑制人前列腺癌细胞PC-3M体外生长的实验研究

 目的　观察TRAIL对前列腺癌细胞PC 3M的生长抑制作用。方法　采用MTT法检测不同浓度TRAIL对人非激素依赖性前列腺癌细胞株PC 3M的生长抑制率 ,原位末端酶标记技术检测细胞凋亡。免疫组化法观察bcl 2的表达。结果　TRAIL可有效地抑制PC 3M细胞生长 ,具有时间、浓度依赖性特点。经药物作用后 ,前列腺癌细胞凋亡明显增多 ,凋亡率随作用时间的延长而增高 ,PC 3M细胞中的bcl 2基因表达无显著变化。结论　TRAIL蛋白可显著抑制前列腺癌细胞PC 3M生长 ,其诱导细胞凋亡不依赖bcl 2基因表达     

蟾毒灵联合阿霉素对膀胱癌T24细胞生长的影响及机制

目的:观察蟾毒灵联合阿霉素对膀胱癌T24细胞生长的影响，探讨蟾毒灵联合阿霉素抗肿瘤作用的可能机制。方法:用不同浓度的蟾毒灵和阿霉素分别作用于T24细胞，用MTT法检测细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，RT-PCR检测凋亡基因Bax及Bcl-2表达水平，再联合使用两组药物作用T24细胞，检测相关凋亡指标。结果:MTT 结果显示，蟾毒灵与阿霉素联合应用比单独应用阿霉素对T24细胞的增殖抑制率要明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05)；流式细胞仪结果显示，当蟾毒灵和阿霉素联合应用T24细胞的凋亡率要明显高于单独应用两种药物，差异有统计学意义(P＜0.05)；RT-PCR结果显示，蟾毒灵联合阿霉素能明显下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达，上调促凋亡基因Bax的表达，与单独用药相比差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:蟾毒灵联合阿霉素可增敏阿霉素对T24细胞的增殖抑制及诱导细胞凋亡的能力;其抗肿瘤活性的机制可能与影响凋亡基因Bax及Bcl-2的表达有关。     

阿霉素对肝癌细胞增殖及TRAIL受体表达影响的实验研究

[目的]研究亚毒性浓度阿霉素联合TRAIL蛋白对肝癌HepG2细胞增殖及TRAIL受体表达的影响。[方法]采用MTT法,分别检测阿霉素、TRAIL及亚毒性浓度阿霉素联合TRAIL对HepG2细胞的生长抑制率;RT-PCR和Westernblot分别检测阿霉素作用前后HepG2细胞TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2mRNA和蛋白表达的水平。[结果]TRAIL对HepG2细胞增殖的抑制不存在浓度依赖性;阿霉素对HepG2细胞增殖的抑制作用存在浓度依赖性;亚毒性浓度阿霉素与亚毒性浓度TRAIL联用杀伤肿瘤的能力明显增强;无论在mRNA还是蛋白水平,阿霉素处理后HepG2细胞死亡受体DR4、DR5的表达水平显著增加,而阿霉素处理后诱骗受体DcR1、DcR2的表达量较阿霉素处理前明显减少。[结论]亚毒性浓度的阿霉素与亚毒性浓度的TRAIL联合应用具有协同作用,其机制可能是由于阿霉素在某种程度上增加了细胞表面死亡受体的表达,从而诱导了细胞凋亡的增加,说明TRAIL在肿瘤治疗方面存在潜在的应用价值。     

VP3和TRAIL基因共表达沙门菌载体对胃癌细胞生长作用的影响

目的: 构建鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)VP3基因和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apopto-sis-inducing ligand,TRAIL)基因的真核表达载体,并观察其对胃癌细胞生长的影响情况.方法: 采用分子克隆技术,将VP3基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建获得质粒pBud-TRAIL-VP3,采用电转化法将该重组质粒转入减毒沙门菌SL7207,再直接转染胃癌细胞株SGC-7901.48 h后采用RT-PCR检测VP3基因表达状况并在荧光显微镜下观察细胞内有无绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达.MTT法检测重组菌株对SGC-7901细胞生长状况的影响.AO/EB荧光染色检测其对肿瘤细胞凋亡率的影响.透射电镜观察胃癌细胞形态改变.结果: 获得VP3基因正确插入的真核表达载体;重组质粒经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后,RT-PCR检测到VP3基因存在;荧光显微镜下观察到在转染细胞内有GFP表达;转染48 h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有明显抑制作用(P<0.05),荧光染色可见胃癌细胞有凋亡现象,pBud-TRAIL-VP3能够明显提高胃癌细胞的凋亡率(P<0.05),透射电镜观察到转染细胞发生凋亡形态变化.结论: 减毒沙门菌可将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞并进行表达,TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长起协同抑制作用并能促进胃癌细胞的凋亡.     

TRAIL蛋白对卵巢癌COC1和COC1/DDP细胞生长及促凋亡作用研究

目的:为研究TRAIL对卵巢癌COC1和耐药COC1/DDP细胞生长及凋亡的影响.方法:用MTT法检测TRAIL蛋白单独(或与DDP联合用药)对COC1和耐药COC1/DDP细胞生长的影响,流式细胞仪检测TRAIL对肿瘤细胞凋亡情况和细胞周期分布改变的影响.结果:①TRAIL蛋白对COC1/DDP细胞生长有抑制作用,随着TRAIL蛋白浓度升高,细胞抑制率逐渐上升.②TRAIL对COC1和耐药COC1/DDP细胞均有抑制作用,分别为15.74%和30.84%,COC1/DDP细胞的抑制率明显高于前者(P＜0.05).两细胞株的TRAIL与DDP联合组细胞抑制率均比单纯TRAIL组明显升高(P＜0.05).③流式细胞仪检测COC1/DDP细胞的对照组、TRAIL组和TRAIL+DDP组细胞凋亡率分别为4.6%、16.7%、23.6%,各组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05).TRAIL蛋白使细胞更多地停留在G0-G1期,有丝分裂期细胞减少,凋亡细胞增多.结论:TRAIL蛋白对COC1和COC1/DDP细胞生长均有抑制作用,DDP与TRAIL联合使用对细胞的生长抑制更明显,细胞凋亡率明显升高.TRAIL可克服COC1/DDP细胞对DDP的耐药性.     

自噬相关WIPI1基因在结肠癌细胞中的表达及功能

目的:探讨细胞自噬相关WIPI1基因在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌细胞功能之间的关系。方法:RT-PCR技术检测WIPI1基因在HCT116、SW60、RKO细胞中的表达。利用针对WIPI1基因的shRNA慢病毒感染人低分化结肠癌RKO细胞株，应用Celigo法检测WIPI1敲减对细胞增殖能力的影响；FACS检测WIPI1敲减对细胞周期阻滞能力的影响；Casepase3/7检测WIPI1基因敲减对细胞凋亡的影响；抗体芯片技术检测其可能影响的信号通路。结果:RT-PCR结果证实WIPI1基因在三株结肠癌细胞中表达丰度均为高表达。在基因沉默后，与对照组相比较，RKO细胞增殖受到显著抑制（P＜0.05)，且凋亡细胞数显著增加（P＜0.05)，细胞周期阻滞于S期；抗体芯片技术显示:细胞内信号通路中Stat3，Akt(Ser473)，mTOR，p38，GSK-3β等相关分子显著下调。结论:沉默细胞自噬相关WIPI1基因对结肠癌细胞起到一定的抑制作用。     

藤黄酸联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的效果和机制

背景与目的：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）能选择性地杀伤肿瘤细胞,但多种肿瘤对其耐药。该研究旨在探讨藤黄酸（gambognic acid,GA）与TRAIL联合对人结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影响及GA联合TRAIL抗结肠癌的作用机制。方法: 建立人结肠癌HT-29细胞裸鼠皮下移植瘤模型,测定TRAIL和（或）GA对裸鼠移植瘤的影响,采用H-E染色观察肿瘤组织形态结构改变,TUNEL法检测细胞凋亡状况;HT-29细胞经过siRNA干扰Nrf2表达后,通过AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量,RT-PCR法检测Nrf2、Bcl-2、Bax和DR5 mRNA的表达水平。结果: 联合应用GA显著促进了TRAIL对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制（抑瘤率达67.0%）和诱导凋亡作用,下调了组织中Nrf2、Bcl-2的表达,增强了Bax和DR5的表达;与阴性对照siRNA相比,Nrf2干扰能明显上调TRAIL诱导HT-29细胞的凋亡率,提高ROS含量,下调Nrf2和Bcl-2表达,上调Bax和DR5表达。结论: GA可能是通过下调Nrf2表达,使ROS水平升高而激活线粒体凋亡途径与死亡受体途径,从而逆转人结肠癌HT-29细胞体内外对TRAIL的耐药性。     

Suppression of Cellular Apoptosis Susceptibility (CSE1L)Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis in ColorectalCancer Cells

The cellular apoptosis susceptibility (CSE1L) gene has been demonstrated to regulate multiple cellularmechanisms including the mitotic spindle check point as well as proliferation and apoptosis. However, theimportance of CSE1L in human colon cancer is largely unknown. In the present study, we examined expressionlevels of CSE1L mRNA by semiquantitative RT-PCR. A lentivirus-mediated small interfering RNA (siRNA)was used to knock down CSE1L expression in the human colon cancer cell line RKO. Changes in CSE1L targetgene expression were determined by RT-PCR. Cell proliferation was examined by a high content screeningassay. In vitro tumorigenesis was measured by colony-formation assay. Cell cycle distribution and apoptosiswere detected by flow cytometric analysis. We found CSE1L mRNA to be expressed in human colon cancer cells.Using a lentivirus based RNAi approach, CSE1L expression was significantly inhibited in RKO cells, causingcell cycle arrest in the G2/M and S phases and a delay in cell proliferation, as well as induction of apoptosisand an inhibition of colony growth capacity. Collectively, the results suggest that silencing of CSE1L may be apotential therapeutic approach for colon cancer.     

Doxorubicin enhances TRAIL-induced apoptosis in prostate cancer

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces apoptosis in various tumor cells. The anthracycline doxorubicin (DOX) can sensitize several types of cancer cells to TRAIL-mediated apoptosis. Here we report that DOX enhances TRAIL-induced apoptosis and cytotoxicity against prostate cancer cells. Cytotoxicity was determined by a MTT assay. Synergistic effect was assessed by isobolographic analysis. Caspase activity was determined by a quantitative colorimetric assay. The combination treatment with DOX and TRAIL resulted in a synergistic cytotoxic effect on LNCaP, LNCaP-Bcl-2, PC-3, and PC93 human prostate cancer cell lines, but not on normal human prostatic stromal cells. Synergistic cytotoxicity was also obtained even when the exposure time was shortened from 24 to 8 or 2 h. A similar effect was achieved with TRAIL in combination with epirubicin, pirarubicin, or amrubicin. The synergy obtained in cytotoxicity with TRAIL and DOX was also achieved in apoptosis. DOX treatment significantly activated caspase-8, -6, and -3 in LNCaP cells. Furthermore, the synergistic cytotoxicity of TRAIL and DOX was completely inhibited by Z-VAD-FMK, and partly inhibited by Ac-IETD-CHO, Ac-DQTD-CHO, or Ac-DMQD-CHO. These findings indicate that DOX enhances TRAIL-induced apoptosis and cytotoxicity in prostate cancer by activation of caspase cascades, and suggest that TRAIL in combination with DOX have a therapeutic potential in the treatment of prostate cancer.     

Combining TRAIL with PI3 Kinase or HSP90 inhibitors enhances apoptosis in colorectal cancer cells via suppression of survival signaling

TRAIL has been shown to induce apoptosis in cancer cells, but in some cases they fail to respond to this ligand. We explored the ability of representative phosphatidylinositol-3-kinase (PI3 Kinase)/mTOR and HSP90 inhibitors to overcome TRAIL resistance by increasing apoptosis in colorectal cancer models. We determined the sensitivity of 27 human colorectal cancer and 2 non-transformed colon epithelial cell lines to TRAIL treatment. A subset of the cancer cell lines with a range of responses to TRAIL was selected from the panel for treatment with TRAIL combined with the PI3 Kinase/mTOR inhibitor PI-103 or the HSP90 inhibitor 17-AAG (tanespimycin). Two TRAIL-resistant cell lines were selected for in vivo combination studies with TRAIL and 17-AAG. We found that 13 colorectal cancer cell lines and the 2 non-transformed colon epithelial cell lines were resistant to TRAIL. We demonstrated that co-treatment of TRAIL and PI-103 or 17-AAG was synergistic or additive and significantly enhanced apoptosis in colorectal cancer cells. This was associated with decreased expression or activity of survival protein biomarkers such as ERBB2, AKT, IKKα and XIAP. In contrast, the effect of the combination treatments in non-transformed colon cells was minimal. We show here for the first time that co-treatment in vivo with TRAIL and 17-AAG in two TRAIL-resistant human colorectal cancer xenograft models resulted in significantly greater tumor growth inhibition compared to single treatments. We propose that combining TRAIL with PI3 Kinase/mTOR or HSP90 inhibitors has therapeutic potential in the treatment of TRAIL-resistant colorectal cancers.     

RNAi沉默GTPBP4基因对结肠癌RKO细胞增殖及凋亡的影响

 目的 探讨GTPBP4基因沉默后,RKO细胞增殖和凋亡等生物学行为的改变。方法 将慢病毒GTPBP4-siRNA及CON053阴性病毒转染结肠癌RKO细胞株,以Real-time PCR 和Western blot检测敲减效率。Cellomics细胞计数检测细胞生长,MTT法检测细胞增殖,FACS法进行细胞周期检测,并进行细胞克隆形成实验,AnnexinⅤ-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 慢病毒成功感染RKO细胞,mRNA和蛋白检测均显示GTPBP4基因敲减成功。GTPBP4基因敲减后,RKO细胞增殖速率受到显著抑制,MTT值比值（即增殖倍数）减小,G_0/1、G₂/M期细胞显著增多,S期明显减少,细胞克隆集落数目减少,凋亡峰值明显高于对照组,且峰值出现时间早于对照组。 结论 GTPBP4基因可能通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡而影响结肠癌的发生发展。