ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达

目的构建靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体,包装产生高滴度慢病毒并观察其感染小鼠海马齿状回基因的表达。方法将靶向ErbB4基因的miRNA干扰质粒利用Gateway重组技术构建慢病毒表达质粒,并与慢病毒包装系统共转染HEK293T包装细胞,收获上清并浓缩得到慢病毒浓缩液,通过测定绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定其滴度。所得慢病毒浓缩液经立体定位微量注射感染小鼠海马齿状回。观察鼠脑冰冻切片基因表达情况,并用神经元标志物神经元核抗原(NeuN)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性抗体行免疫染色分析转导的细胞类型。结果阳性克隆测序结果与设计序列一致,说明靶向ErbB4基因的miRNA慢病毒干扰载体构建成功。包装收获慢病毒。浓缩的慢病毒包装上清感染HEK293T细胞后,流式细胞术检测GFP阳性率,计算得慢病毒活性滴度为1.0×1012转导单位(TU).L-1。小鼠海马齿状回立体定位微量注射1.0×1012TU.L-1慢病毒6个月后,观察到注射部位外源基因的显著表达。免疫荧光染色显示,慢病毒转导的细胞多呈NeuN标记阳性,并与GFAP的表达不重叠。结论靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体构建成功,获得了靶向ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒颗粒,并实现了脑实质的局部长期稳定转导,慢病毒转导的主要细胞类型为神经元。     

新的HIV DNA候选疫苗通过Ⅰ期临床试验

最近已证明两种新的HIV DNA疫苗在健康成年人中具有安全性和良好的耐受性。第一种疫苗是表达A、B和C亚型HIV-1 Env蛋白和B亚型HIV-1融合蛋白（Gag—Pol—Nef）的混合质粒。第二种疫苗是利用重组腺病毒（rAd5）来传递上述HIV抗原。     

改进植物生产疫苗抗原的方法

英国伦敦大学Obregon等最近报道用基因工程技术使烟草生产HIV-1p24蛋白与人IgA Fc序列的融合蛋白,该融合蛋白能成功地诱导小鼠产生针对HIV的抗体和T细胞应答。研究显示,免疫球蛋白序列与病毒抗原的结合能直接或通过把抗原导向靶细胞群而增强免疫原性。该融合蛋白的一个意外的好     

HIV变异性与艾滋病疫苗的前景

本文概述了为研制有效艾滋病疫苗而进行的诱导中和抗体研究工作;并描述了1型人类免疫缺陷症病毒(HIV-1)包膜上的主要中和性抗原决定簇(PND);讨论了PND的变异性与代表PND的合成肽对中和抗体的诱导。应用代表大多数HIV-1分离株PND顺序的不同肽的混合物以及组建含几个病毒分离株PND的杂交免疫原可解决与PND变异性有关的问题。本文还讨论了另一种有可能诱导某种细胞内免疫力的方法:作者用HIV-1感染者淋巴细胞培养上清液感染Hut-78细胞获得的细胞克隆(F12),虽有完整的HIV-1前病毒,但不能释放病毒颗粒。并且F12细胞能完全抵抗HIV-1或HIV-2分离株的重复感染。目前,作者试图将该克隆的F12/HIV基因组转入HIV易感细胞以产生同源病毒干扰作用,从而使这些细胞抵抗HIV感染.     

狂犬病病毒用作HIV疫苗的载体

美国 Jefferson医学院的研究人员运用减毒的狂犬病病毒作为表达人类免疫缺陷症病毒 (HIV)包膜蛋白的载体 ,研制 HIV疫苗。这是一种新方法 ,因为狂犬病病毒或不分节段的负链 RNA病毒用于 HIV疫苗尚属首次。　　研究人员将 HIV- 1 gp1 6 0基因插入减毒的狂犬病病毒产生重组病毒。然后将其注射小鼠 ,并加强注射一次 HIV gp1 2 0蛋白以致敏免疫系统。结果该病毒成功地表达出 gp1 6 0糖蛋白 ,并诱导强的抗 HIV- 1包膜蛋白的体液免疫应答。另外 ,在小鼠血清中检出滴度高达 1 :80 0的抗 HIV中和抗体。而一些广泛使用的重组病毒载体 (表达…     

hPARP-1蛋白缺陷细胞株建立及生长特性

目的建立hPARP-1蛋白缺陷细胞株，观察该缺陷所引起的生物学效应。方法用构建的hPARP-1基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体（pEGFP-C1-P）转染人胚肺成纤维细胞（HLF），用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP-1基因的表达水平。同时观察转染细胞生长形态，绘制生长曲线，用流式细胞术观察细胞周期，软琼脂培养法鉴定转染细胞恶性程度。结果pEGFP-C1-P载体在转染细胞内可较稳定表达，hPARP-1蛋白缺陷细胞株hPARP-1基因的蛋白表达水平比HLF下降了47％，比绿色荧光蛋白载体（HLFC）低45％，HLFC比HLF仅少3％。转染后hPARP-1蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化，软琼脂培养未见细胞集落。hPARP-1缺陷细胞生长形态无明显变化，细胞倍增时间为0．89d．与HLF细胞0．93d接近，软琼脂培养未见细胞集落。结论成功建立和鉴定了hPARP-1蛋白缺陷细胞株，在正常生长环境中，该缺陷不足以单独引起可观察的生长特性改变。     

治疗HIV感染和艾滋病的靶——慢性感染的细胞

本文讨论了靶向慢性感染细胞的抗病毒战略,重点是 HIV 蛋白酶抑制剂。HIV-1蛋白酶抑制剂可干扰病毒生活周期后期的功能。蛋白酶抑制剂可通过阻断细胞内聚合蛋白的加工(导致非感染病毒毒粒的生长),从而阻止了感染的传播。sCD4-KDEL 诱变蛋白则从茅生毒粒表面清除病毒包膜蛋白,以阻止病毒在慢性感染细胞中的传播,而单克隆抗体-毒素或 sCD4毒素共轭蛋白可靶向并杀死感染的细胞。     

RNA干扰技术

RNA干扰首次发现于美丽线虫,siRNAs(小干扰RNA)的产生可诱导特异内源性mRNA的降解,现在被认为是真核细胞在翻译后水平抑制蛋白产生的主要途径.典型的内源性siRNA是由19-23个碱基构成的双链寡核苷酸RNA,由RNase蛋白复合物聚集降解靶mRNA所产生.RNA干扰最近常被用作逆转录基因工具来沉默多倍体有机体中的基因表达.表达siRNAs的方法日新月异,已经由最初的在体内或者体外利用病毒载体转染合成的siRNA至细胞,发展为在不同型细胞和有机体中建立不同功能的特异蛋白.RNA干扰的方法较之前的方法(反义DNA或抗体封闭技术)在抑制基因表达方面有着明显的优点.RNAi序列特异性的抑制效应是有选择性的、长期的,系统地调节靶向基因.不论是直接转染siRNA或者由RNA载体表达产生,RNAi都可抑制哺乳动物中的特异基因,这无疑加速了基因功能的研究速度,而且极有潜力成为高效的基因特异性治疗方法.药理学家一直梦寐以求可有方法能够选择性的拮抗或剔除个体特异蛋白的功能,RNAi十分有望使其梦想成真.     

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转染对小鼠黑色素瘤B16细胞蛋白质表达谱的影响

目的研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因转染对小鼠黑素瘤细胞B16F1的蛋白表达谱的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法采用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究策略,分析稳定表达sv-cystatin的B16F1细胞系B16F1/cystatin与转染空载体的对照细胞B16F1/pcDNA3.1的蛋白表达谱的差别,筛选鉴定差异表达蛋白;用实时定量PCR和Western blot进一步确定实验结果;对蛋白组数据和前期基因组数据进行比较分析。结果 B16F1/cystatin和B16F1/pcDNA3.1细胞总蛋白的双向电泳图谱上共有匹配蛋白点(412±20)个,其中有11个蛋白的表达差异在2倍以上,5个上调,6个下调。这11个蛋白和1个仅在B16F1/cystatin中表达的蛋白经MALDI-TOF-MS分析,其中10个蛋白得到了鉴定,它们分属于代谢酶系、小G蛋白Ran调控分子、真核翻译因子、核苷酸激酶等。Western blot显示NM23和RhoGDI-beta的蛋白表达分别上调了(2.23±0.34)倍和(1.57±0.11)倍;实时定量PCR结果显示NM23、RhoGDI-beta、RANBP1的mRNA表达上调,eIF5A、eEF1-beta2、MDH1表达下调;与蛋白质组学研究结果一致。基于Gene Ontology的分析提示sv-cystatin作用的靶分子主要定位于细胞外周、质膜和细胞核,与转录、半胱氨酸蛋白酶活性、细胞凋亡等过程有关。结论 sv-cystatin可能通过调控抑癌基因NM23、RhoGDI等蛋白质发挥其抗肿瘤作用。sv-cystatin的主要靶分子可能是转录因子、分泌蛋白和质膜受体。     

RNAi介导MeCP2基因沉默对HSC-T6细胞活化增殖的影响

目的探讨RNA干扰介导甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)基因沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞增殖的影响。方法根据MeCP2的碱基序列设计并合成小干扰RNA(small interfering RNA,siR-NA),通过脂质体LipofectamineTM2000转染到HSC-T6细胞内,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSC-T6细胞增殖变化;Quantitative Real-Time PCR检测α-SMA、MeCP2 mRNA的表达;流式细胞术检测HSC-T6细胞周期的变化;Western blot检测α-SMA、MeCP2蛋白的表达。结果将MeCP2-siRNA转染进HSC-T6细胞内,MeCP2基因及蛋白水平明显降低;同时α-SMAmRNA及α-SMA蛋白的表达水平亦明显降低;靶向封闭MeCP2基因的表达可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖。结论靶向封闭MeCP2的表达可明显抑制HSC-T6细胞活化增殖,MeCP2可能是潜在的肝纤维化治疗靶点。     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体,鉴定其特性,为进一步研制HIV治疗性抗体提供贮备。方法将HIV-1 gp120基因片段连接到经酶切的原核表达载体PEGX-4T-2中,利用大肠杆菌XL1-blue表达GST-HIV蛋白。表达的蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆。重组免疫印迹分析(RIBA)和Western blot检测抗体特异性。结果构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1 gp120抗原基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE可见1条相对分子质量(Mr)32 000的表达蛋白条带。获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其细胞培养上清效价为10-3,小鼠腹水效价为10-5,抗体亚型均为IgG1。RIBA结果显示6株单抗皆只与HIV-1 gp120抗原反应。Western blot结果显示在Mr32 000处可见1条单一目的条带。结论获得6株稳定分泌抗HIV-1 gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定了基础。     

KRAS基因编辑的PANC-1细胞的细胞行为学变化

目的应用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建KRAS基因敲低的人胰腺癌细胞株PANC-1并观察其细胞行为学变化。方法设计合成靶向KRAS基因的小向导RNA序列片段,体外转染构建KRAS基因敲低的PANC-1细胞。采用实时定量PCR和Western blot检测KRAS基因mRNA及蛋白表达,MTT细胞增殖实验、Transwell小室及流式细胞术分别检测KRAS基因敲低的PANC-1细胞的细胞增殖活性、细胞迁移能力及细胞内活性氧水平。结果经测序验证,体外成功转染构建KRAS基因敲低的PANC-1细胞,KRAS基因mRNA及蛋白表达均降低,细胞增殖能力和细胞迁移能力减弱,细胞内活性氧水平升高(P<0.05或P<0.01)。结论采用CRISPR/Cas9系统成功构建KRAS基因敲低的PANC-1细胞,可为研究KRAS下游新功能基因在胰腺癌发生、发展中的作用提供帮助。     

RNAi介导大鼠腺苷A1和A2A受体基因沉默对乙醛诱导的肝星状细胞活化增殖的影响

目的研究大鼠腺苷A1受体(A1R)和腺苷A2A(A2AR)受体的siRNA分别转染大鼠肝星状细胞(HSC)对乙醛诱导的HSC活化增殖的影响。方法采用乙醛诱导HSC-T6建立离体的大鼠酒精性肝纤维化HSC模型,设计并合成A1R和A2AR小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,通过脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染至HSC-T6细胞内,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSC-T6细胞增殖变化;利用Real-Time q PCR及Western blot法分别检测HSC-T6的A1R、A2AR、α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表达。结果将A1R和A2AR siRNA转染至HSC-T6细胞内,A1R和A2AR基因及蛋白的表达水平明显降低;同时α-SMA、Collagen I mRNA及蛋白表达水平亦明显降低;靶向封闭A1R或A2AR基因的表达可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖。结论靶向封闭A1R或A2AR基因的表达可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖,A1R和A2AR可能是潜在的酒精性肝纤维化的治疗靶点。     

利用siRNA敲除P-选择素受体CD24对黑色素瘤细胞增殖的影响

目的探讨CD24在黑色素瘤细胞增殖中的作用。方法 B16F10细胞转染靶向CD24的RNA干扰质粒pSi-CD24,然后用RT-PCR和WesternBlot观察其对细胞CD24表达的影响,用MTT法观察其对细胞增殖的抑制效果。结果在mRNA和蛋白水平均证实,转染pSi-CD24明显抑制B16F10细胞CD24的表达;与对照组相比较,pSi-CD24转染在48h和72h显著抑制细胞增殖速度。结论 CD24具有促进黑色素瘤细胞体外增殖作用,在肿瘤的发生发展中起重要作用。     

HPV16的新型伪病毒对DNA特异性B细胞的靶向实验研究

目的:构建人乳头状病毒(human papilloma virus,HPV)16型的新型伪病毒,并检测其对DNA特异性B细胞(R4A)的靶向性。方法:利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白,在体外变性与复性过程中将病毒蛋白包装绿色荧蛋白EGFP表达型质粒,形成伪病毒。透射电镜观察病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结构,并转染R4A细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。结果:透射电镜观察证实病毒蛋白可自我组装成VLP,在转染R4A细胞后,荧光显微镜和流式细胞仪成功检测到荧光的表达。结论:HPV16的新型伪病毒能成功转染R4A细胞,为系统性红斑狼疮(SLE)的靶向治疗提供了理想的策略。     

靶向沉默SSBP1基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响

目的 观察靶向沉默线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响.方法 设计并构建靶向SSBP1 基因的特异性siRNA,采用脂质体介导瞬时转染肝癌HepG2细胞,细胞分3组:对照组、空白转染组、转染组.Real time-PCR和Western-blot检测靶向干扰后SSBP1 mRNA和蛋白表达变化.CCK-8法检测细胞增殖.流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位.划痕实验及Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭转移能力.Western-blot检测增殖、侵袭转移相关基因蛋白表达状况.结果 SSBP1 siRNA能够显著抑制SSBP1 mRNA和蛋白表达.与对照组和空白转染组比较,转染SSBP1 siRNA后HepG2细胞增殖能力、G2期和S期细胞比例、线粒体膜电位明显降低,G1期细胞比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05);同时细胞增殖相关基因PCNA、凋亡抑制基因Bcl-2、转移相关基因MMP-9蛋白表达显著下调,凋亡诱导基因Bax蛋白表达显著上调(P<0.05).结论 靶向沉默SSBP1基因能够通过线粒体途径抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移,并诱导其凋亡.     

抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目前报道的靶向VEGF/VEGFR基因工程抗体多为不含Fc片段的Fabs、cFv等小分子抗体,该文旨在CHO-k细胞中表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体。将抗VEGFR-2 scFv(AK404)基因与含有人IgG1恒定区的真核表达载体pcDNA3.1-Fc连接,重组质粒测序后经脂质体介导转染CHO-k细胞,G418加压筛选获取稳定表达细胞株。RT-PCR、western blot检测目的基因的转录、表达。测序结果表明重组质粒构建成功,RT-PCR及western blot显示目的基因成功整合到宿主基因组并表达。最终获得可稳定表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的重组CHO-k细胞株,为融合抗体的大量制备和活性研究打下基础。     

中国人常见GJB2基因突变蛋白亚细胞定位研究

目的研究中国人常见三种GJB2基因突变（c.235de1C,c.299-300delAT,and c.176-191de1（16）bp）的亚细胞定位和致聋机理。方法用MegaTran 1.0将GJB2野生型和三种突变的绿色荧光蛋白融合表达载体转染HEK293细胞,转染48h后用红色ER-TrackerTM复染细胞,激光共聚焦显微镜下观察结果。结果转染野生型质粒后可见细胞膜上出现点状或线状绿色荧光,三种突变融合蛋白质粒转染后均可见HEK293细胞质中有弥漫分布的绿色荧光,而胞膜上没有表达;转染突变质粒的细胞用ER-Tracker TM复染后,激光共聚焦显微镜下见红色和绿色几乎完全重叠,提示上述三种突变蛋白没有出现在细胞膜上,而是滞留在内质网中。结论中国人常见三种GJB2基因突变没有到达细胞膜上形成缝隙连接,而是滞留在细胞内质网中,提示过多的突变蛋白可能通过诱发内质网应激以及后续的内质网应激相关细胞凋亡导致耳聋。     

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸对海马神经元及神经元样细胞中COX-2表达的影响

目的设计合成靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs,并检测其对神经元样细胞及海马神经元中NF-κB及环氧化酶-2(COX-2)的抑制作用。方法采用NF-κB靶向性哑铃形圈套ODNs转染培养的PC12细胞,用Western blot方法对PC12细胞内NF-κB和COX-2的蛋白表达进行分析;转染培养的海马神经元再经LPS刺激后,用RT-PCR法检测COX-2mRNA。结果经靶向性NF-κB哑铃形圈套ODNs处理的PC12细胞中NF-κB的表达明显降低(P<0.01),同时伴有COX-2表达明显减少(P<0.01);海马神经元中COX-2mR-NA的表达明显降低(P<0.01)。结论靶向性NF-κB的哑铃形圈套ODNs可抑制神经元样细胞及神经细胞中NF-κB和COX-2的表达,且NF-κB对COX-2具有调控作用。     

作用于病毒细胞融合过程的药物

美国Trimeris制药公司正在开发一类阻挡病毒进入细胞的化合物。他们正注重于包膜病毒与细胞膜的融合过程，这个病毒生命循环的关键步骤允许病毒将其遗传物质DNA或RNA注入宿主细胞。膜融合是真核细胞的普遍过程，对于免疫缺陷病毒（HIV），感染的细胞之间的传递也是一种融合过程。导向化合物Pentafuside来自于HIV一1包膜糖蛋白的一部分，它是HIV-1融合抑制剂。HIV－1的表面带有糖蛋白gP120和gP41的寡聚复合体，在自然和静止状态下，两个gP120和两个gP41的杂寡聚物通过非共价蛋白-蛋白作用相联，gP41介导与细胞的融合，“融合区”被…